基于傅里叶变换红外光谱的微生物分型系统在乳酸菌分型或乳酸菌类益生菌筛选中的用途

摘要

本发明公开了基于傅里叶变换红外光谱的微生物分型系统在乳酸菌分型或乳酸菌类益生菌筛选中的用途。与其他基因型分型技术相比，IR Biotyper分型等效于新旧金标准全基因组测序(WGS)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)，并且优于多位点序列分型(MLST)。与益生菌表型分型相比，IR Biotyper光谱型和表型聚类结果相一致，揭示两者密切相关。此外，得益于IR Biotyper在基于DNA的技术方面的巨大优势，使其适用于益生菌实验室和工业的日常的菌株分型工作，不仅可以有效提高益生菌筛选效率，在益生菌的可追溯性和质量控制也有应用潜力。

权利要求

1.基于傅里叶变换红外光谱的微生物分型系统在乳酸菌类益生菌筛选中的用途，其特征在于，所述乳酸菌为植物乳植杆菌Lactiplantibacillus plantarum；所述乳酸菌类益生菌的筛选是在菌株水平上的筛选；所述筛选的方法，包括以下步骤：步骤1)、获得乳酸菌类益生菌的分离株样本；所述分离株样本数大于等于5；

步骤2)、制备步骤1）中分离株样本的加载样品并在IR Biotyper光谱仪中上样，使用IR ‑1Biotyper光谱仪在4,000～500cm 光谱范围内以透射模式记录光谱，并利用IR Biotyper软件对所获得的光谱进行处理，构建聚类图，利用聚类图对所述分离株进行菌株水平分型；所述IR Biotyper软件的聚类截止值COV设定为0.241‑0.263；

步骤3)、对步骤2)所得各个分型中的代表性菌株进行益生菌相关的表型特征分析，确定所述各个分型的光谱型与益生菌表型特征之间的对应关系，从而构建乳酸菌类益生菌的各个分型光谱型和其所对应益生菌表型的筛选数据库；

步骤4)、利用IR Biotyper光谱仪获得待测菌株的光谱型，将待测菌株的光谱型与步骤

3）中所述的筛选数据库中的光谱型比对，获得所述待测菌株的表型特征结果；

其中，步骤3)中所述益生菌相关的表型特征选自耐酸耐胆盐性、表面疏水性或抗生素敏感性中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微生物分型系统为IR Biotyper微生物分型系统。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤1)中获得的所述乳酸菌分离株在密封的MRS培养基上37℃条件下生长48±3小时。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤2)中加载样品的制备方法为：取步骤

1)中获得的乳酸菌分离株重悬于无菌水中，按照1:1的体积比加入70v/v％乙醇，混匀，将获得的细菌悬浮液点在IR Biotyper样品板上，并在37℃下干燥直至形成干膜。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤4)中所述构建聚类图的方法为：对所‑1获得的多糖吸收区1200～900cm 中FTIR光谱的二阶导数进行矢量归一化，通过IR Biotyper软件对二阶导数IBRT的层次聚类进行分析，使用欧几里得距离和平均连锁聚类方法构建所述聚类图。

6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，步骤2)中所述构建聚类图的方法为：对所‑1获得的多糖吸收区1200～900cm 中FTIR光谱的二阶导数进行矢量归一化，通过IR Biotyper软件对二阶导数IBRT的层次聚类进行分析，使用欧几里得距离和平均连锁聚类方法构建所述聚类图。

说明书

基于傅里叶变换红外光谱的微生物分型系统在乳酸菌分型或

乳酸菌类益生菌筛选中的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物分型方法领域，特别涉及基于傅里叶变换红外光谱的微生物分型系统在乳酸菌分型或乳酸菌类益生菌筛选中的用途。

背景技术

[0002] 众所周知，微生物在人类健康方面起着至关重要的作用。一方面，有些致病菌侵入宿主后会引起一系列疾病，另一方面，共生菌则与人体建立互惠关系，有助于维持宿主正常的生理机能。服用益生菌可能是决定健康状况和疾病易感性的关键因素。因此，在菌株水平分型致病菌和益生菌是与人类健康相关的巨大挑战，不仅要考虑病原菌的有害因素，如毒力增加、传播性增强、对多种抗生素耐药，也要考虑有利的一面，包括益生菌管理带来的健康益处。由于对益生菌的需求不断增长，行业需要快速准确地识别菌株水平的特定益生菌。

[0003] 基于表型、基因型和光谱型的菌株分型方法伴随着微生物特征知识以及技术、仪器和数据分析工具的发展而进行演变。众所周知，基于培养的传统表型鉴定方法比较繁琐且可靠性有限，因此正逐渐被分子方法或基因技术所取代。其中，脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点可变数量串联重复分析(MLVA)和多位点序列分型(MLST)等已广泛用于各种细菌的监测和流行管理。应用全基因组测序(WGS)评估遗传变异可以提供全部遗传信息，已成为鉴定、比较和分类微生物的新“金标准”。然而，除了高分辨率之外，这些技术通常成本高、技术难度大，费力且耗时阻碍了它们的大规模常规应用。此外，基于遗传数据的表型预测并非总是匹配，细菌学中也尚未设定能区分菌株表型的通用遗传阈值。

[0004] 傅里叶变换红外光谱(FTIR)是基于分子振动指纹，通过红外光谱中菌株特定的吸光度模式来表征微生物的。FTIR的主要优点是快速、廉价、操作简单、无损、高通量，此外，还可以获得细菌生物分子含量的相关信息，包括来自红外光谱的脂质、碳水化合物、蛋白质和核酸。但是，由于益生菌具有高度的种内变异，作用方式、制造过程和质量控制的不可预测性，因此在菌株水平上区分益生菌菌株具有挑战性，而菌株特异性验证是检验稳定性、质量安全和有效性的基础。然而，在现有技术的益生菌研究中，由于以上所述的种种原因，FTIR 技术是否能在“株水平”区分乳酸菌，特别是乳植杆属的植物乳植杆菌还有待进一步证实。

[0005] 由于益生菌潜在的促进健康作用的证据越来越多，乳酸菌菌种和菌株的重要特征，例如与宿主的相互作用、肠道定植动态或生态分布，一直是益生菌行业深入研究的对象。考虑到益生菌的健康益处是菌株特异性的，欧洲食品安全局和国家食品药品监督管理局也要求对益生菌菌株编号进行标示，这是健康声明的依据。因此，从对益生菌的需求不断增长的角度来看，行业需要快速准确地识别特定益生菌菌株，益生菌食品和补充剂的质量和安全评估以及对具有功效且安全的益生菌菌株的筛选是行业的责任。在临床应用场景中，为患有特定疾病的患者筛选匹配合适的益生菌菌株也是一项具有挑战的任务。在这方面，考量益生菌菌株特异性和疾病特异性具有重要意义。

[0006] 为获取具有功效且安全的益生菌菌株需采用严格的筛选标准。候选益生菌菌株需要耐受消化液，粘附并定植于肠道，并且在宿主中是安全有效的，这导致使用体外评估或体内研究从大量分离株中选择益生菌是昂贵、耗时且不易实现的。由于乳酸菌的生态位、表型和基因型多样，同一生态位中可能会分离出大量同一菌株的重复株，而从不同生境获得新的分离株也可能导致同一菌株的多次分离。这使得从乳酸菌分离株中严格筛选益生菌非常具有挑战性。在现有技术中，PFGE操作非常费力，WGS又相当昂贵，而且都非常耗时(2‑3天)，特别是当对一大群新分离株进行分型时，它们应用于益生菌鉴定和分型的常规操作可能会受到限制。考虑到不同益生菌的特性和功能是菌株特异性的，因此，无论学术界还是工业界都非常需要一种易于使用，且快速有效的益生菌菌株分型技术，以减少在进行广泛的评估和选择之前要考虑的分离株数量。基于此，一项能够保证明确区分益生菌菌株的技术对于设计专注于疾病预防或治疗的临床试验至关重要。

发明内容

[0007] 本发明的一个方面，是针对现有技术中缺乏证明FTIR技术是否能在“株水平”上区分乳酸菌，特别是植物乳植杆菌的研究，提供了一种基于傅里叶变换红外光谱的微生物分型系统在乳酸菌分型或乳酸菌类益生菌的筛选中的用途。

[0008] 本发明提供的技术方案为：

[0009] 基于傅里叶变换红外光谱的微生物分型系统在乳酸菌分型或乳酸菌类益生菌的筛选中的用途。

[0010] 在本发明的实施方式中，上述乳酸菌可以为任意合适的乳酸菌，包括，例如，乳杆菌属，例如，嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、德式乳杆菌、格式乳杆菌、瑞士乳杆菌、约式乳杆菌、马乳酒样乳杆菌，等；乳植杆菌属，例如植物乳植杆菌，等；乳酪杆菌属，例如干酪乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌、鼠李糖乳酪杆菌，等；粘液乳杆菌属，例如发酵粘液乳杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌，等；联合乳杆菌属，例如唾液联合乳杆菌，等；广布乳杆菌属，例如弯曲广布乳杆菌、清酒广布乳杆菌，等；链球菌属；乳球菌属；丙酸杆菌属；片球菌属；明串珠菌属；等(参考《国家食品安全法》发布的《可用于食品的菌种名单》)。上述分类可能会随着国际微生物学分类的变化而调整，其也被视为包含在本发明的保护范围之内。

[0011] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述乳酸菌为乳植杆菌属的乳酸菌。更优选地，在本发明的一个实施方式中，上述乳植杆菌属的乳酸菌为植物乳植杆菌，其英文名称为Lactiplantibacillus  plantarum。到目前为止，乳植杆菌属包括的其他物种如L.plantarum、L.argentoratensis，等，其也被视为包含在本发明的保护范围之内。

[0012] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述微生物分型系统为IR Biotyper 微生物分型系统。

[0013] IR Biotyper(IRBT)是一种基于傅里叶变换红外(Fourier transform infrared, FTIR)光谱的微生物新型分型系统，旨在3小时内通过探索细菌表面细胞多糖的特异性FTIR光谱来进行株水平的鉴别。

[0014] 在本发明中，发明人创造性地发现基于傅里叶变换红外光谱的微生物分型系统，特别是IR Biotyper(IRBT)微生物新型分型系统能够在菌株水平区分乳酸菌，特别是乳植杆菌属的光谱型。

[0015] 因此，作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述乳酸菌分型是在菌株水平上的分型，上述乳酸菌类益生菌的筛选是在菌株水平上的筛选。

[0016] 本发明的另一个方面，是提供了一种利用基于傅里叶变换红外光谱的微生物分型系统，特别是IR Biotyper(IRBT)微生物新型分型系统对乳酸菌，特别是乳植杆菌属的乳酸菌，更特别是植物乳植杆菌进行分型的方法。上述分型的方法，包括以下步骤：

[0017] 步骤1)获得乳酸菌分离株；

[0018] 步骤2)制备上述分离株的加载样品并在IR Biotyper光谱仪中上样；

[0019] 步骤3)使用IR Biotyper光谱仪在4,000～500cm‑1光谱范围内以透射模式记录光谱；

[0020] 步骤4)利用IR Biotyper系统软件对所获得的光谱进行处理，构建聚类图，利用聚类图对所述乳酸菌进行分型分析。

[0021] 在上述方法中，步骤1)所述的乳酸菌可以为分离的菌株，也可以为通过商业途径购买的菌株。作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述乳酸菌分离株在37℃下在密封的MRS培养基上生长48±3小时。

[0022] 在本发明的一个实施方式中，上述乳酸菌通过MALDI  Biotyper(Bruker, Germany)在种水平上鉴定所有分离株，当MALDI‑TOF MS的分数≤2.0时，通过16S rDNA基因测序分析进行额外确认。将每种分离株在20％(w/v)甘油管中于‑80℃下保存，用于进一步研究。对于表型和基因型分析，上述分离株通常在37℃的MRS培养基中生长，无需摇动。

[0023] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述步骤2)中加载样品的制备方法为：取步骤1)中获得的乳酸菌分离株重悬于无菌水中，按照1:1的体积比加入70v/v％乙醇，混匀，将获得的细菌悬浮液点在IR Biotyper样品板上，并在37℃下干燥直至形成干膜。

[0024] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述步骤4)中所述构建聚类图的方法为：‑1
对所获得的多糖吸收区1200～900cm 中FTIR光谱的二阶导数进行矢量归一化，通过IR Biotyper系统软件对二阶导数IBRT的层次聚类进行分析，使用欧几里得距离和平均连锁聚类方法构建所述聚类图。

[0025] 在本发明中，发明人创造性地发现通过调整COV值(Cut‑off value)能够有效避免各个检测单位间的结果差异性，提高重现性。

[0026] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述步骤4)中IR Biotyper软件的聚类截止值COV设定为0.22～0.28。更优选地，上述聚类截止值COV设定为0.24～0.26，设定的均值为0.25。

[0027] 本发明的另一个方面，是提供了一种利用基于傅里叶变换红外光谱的微生物分型系统对乳酸菌类益生菌，特别是乳植杆菌属的乳酸菌，更特别是植物乳植杆菌的筛选方法。所述筛选的方法，包括以下步骤：

[0028] 步骤1)利用与上述分型方法中步骤1)相同的方法获得乳酸菌类益生菌的分离株样本；

[0029] 步骤2)利用上述分型方法中步骤2)～步骤4)中的方法对上述分离株样本进行光谱型测定并分型；

[0030] 步骤3)对步骤2)所得各个分型中的代表性菌株进行表型特征分析，确定该光谱型与表型特征之间的对应关系，从而构建乳酸菌类益生菌的筛选数据库；

[0031] 步骤4)利用IR Biotyper光谱仪获得待测菌株的光谱型，将其带入上述筛选数据库，获得所述待测菌株的表型特征结果。

[0032] 在本发明中，发明人创造性地将IR Biotyper光谱型和乳酸菌的益生菌表型相关联，观察到对益生菌表型(如酸和胆盐的敏感性、细胞表面疏水性以及对抗生素的耐药性)分型，其聚类结果与IR Biotyper的光谱分型相一致。将这两类结果进行一一对应，例如，如‑1图4所示，利用IR Biotyper得到植物乳植杆菌的五个代表性光谱a～e(4,000～500cm )，可分别与代表具有特定益生菌特征的5个不同菌株对应：

[0033] spectruma对应益生菌特征为：酸和胆盐敏感、亲水、恩诺沙星耐药，其他 14种抗生素敏感；

[0034] spectrumb:对应益生菌特征为：耐酸和耐胆盐、亲水、恩诺沙星、链霉素、卡那霉素、庆大霉素耐药，头孢西丁中度耐药，其他10种抗生素敏感；

[0035] spectrumc:对应益生菌特征为：耐酸和中度耐受胆盐、两亲、恩诺沙星耐药、链霉素中度耐药，其他13种抗生素敏感；

[0036] spectrumd:对应益生菌特征为：耐酸和中度耐受胆盐、疏水、恩诺沙星、链霉素、卡那霉素耐药、庆大霉素中度耐药，其他11抗生素敏感；

[0037] spectrume：对应益生菌特征为：耐酸和中度耐受胆盐、亲水、恩诺沙星、链霉素、卡那霉素耐药，庆大霉素和头孢西丁中度耐药，其他10种抗生素敏感；

[0038] 在大量样本的基础上，可以构建数据库，使之可以纳入益生菌筛选和分型的常规程序。以后对益生菌表型的筛选判断中，只要获得IR Biotyper光谱，就可以获得对应特定的益生菌表型信息，不需要再做繁琐的益生菌体外实验的筛选，大大提高了益生菌的筛选效率。

[0039] 上述大量样本可以为任意多个样本数，一般情况下，样本数应大于等于5。

[0040] 上述益生菌的特征可以根据不同益生菌的种类进行调整。作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述步骤2)中所述的表型特征包括选自耐酸耐胆盐性、表面疏水性或抗生素敏感性中的一种或几种。

[0041] 本发明的有益效果为：

[0042] 本发明提出了IR Biotyper可以在菌株水平作为乳酸菌分型工具的用途。与其他基因型分型技术相比，IR Biotyper分型能力与新旧金标准WGS和PFGE 相当，并且优于MLST。与益生菌表型分型相比，IR Biotyper光谱型和表型聚类结果相一致，揭示两者得属性密切相关。此外，得益于IR Biotyper在基于DNA 的技术方面的巨大优势，使其适用于益生菌实验室和工业的日常的菌株分型工作，不仅可以有效提高益生菌筛选效率，在益生菌的可追溯性和质量控制也有应用潜力。

附图说明

[0043] 图1为本发明实施例中20株植物乳植杆菌分离株的IRBT光谱聚类分型结果图，其中，垂直线代表截止值(COV)；A、B、C表示在3个独立实验获得的聚类结果，调整后的COV分别为0.259、0.241和0.263；A和B的IRBT光谱来自浙江农业科学院公共平台实验室，C的IRBT光谱来自浙江大学第二附属医院实验室；

[0044] 图2为本发明实施例中5个植物乳植杆菌的五个代表性光谱图，其中，A 为吸光度‑1光谱图，B为透光度光谱图，a～e(4000至500cm )分别代表具有特定益生菌特征的5个不同菌株C7‑83、C7‑7、R47、R62和R106；

[0045] 图3为本发明实施例中20株植物乳植杆菌分离株的基因分型结果图，其中， A为PFGE聚类分析，B为基于核心基因组的SNP分析的系统发育树，C为基于WGS‑MLST的系统发育树；

[0046] 图4为本发明实施例中20株植物乳植杆菌分离株和两个参考菌株，L. argentoratensis DSM 16365和L.plantarum ATCC14817的基因组间的ANI值(％) 结果图；

[0047] 图5为本发明实施例中益生菌表型分型结果图，其中，A为基于益生菌表型数据的10株植物乳植杆菌分离株的聚类分析的树状图，B为主成分分析图。

具体实施方式

[0048] 本发明公开了基于傅里叶变换红外光谱的微生物分型系统在乳酸菌分型或乳酸菌类益生菌的筛选中的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0049] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。

[0050] 下面就本发明中出现的部分术语作以解释。

[0051] 术语“傅立叶变换红外光谱(Fourier Transform infrared spectroscopy，FTIR)”是一种将傅立叶变换的数学处理，用计算机技术与红外光谱相结合的分析鉴定方法。主要由光学探测部分和计算机部分组成。当样品放在干涉仪光路中，由于吸收了某些频率的能量，使所得的干涉图强度曲线相应地产生一些变化，通过数学的傅立叶变换技术，可将干涉图上每个频率转变为相应的光强，而得到整个红外光谱图，根据光谱图的不同特征，可检定未知物的功能团、测定化学结构、观察化学反应历程、区别同分异构体、分析物质的纯度等。

[0052] 术语“乳酸菌”(lactic acid bacteria，LAB)是一组革兰氏阳性菌、非孢子形成的球菌或杆状菌，产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要终产物。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。除极少数外，其绝大部分都是人体内必不可少的、且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中。乳酸菌至少包含41个属，主要包括乳杆菌属、乳球菌属、片球菌属、明串珠菌属和链球菌属和双歧杆菌属。

[0053] 术语“植物乳植杆菌”(Lactiplantibacillus plantarum)是一种兼性异型发酵乳酸菌，已被广泛用作乳酸菌生态、代谢和遗传研究的模式菌种。此外，作为多种食品和饮料的发酵剂以及动物和人类的益生菌，植物乳植杆菌具有重大的学术和经济价值。植物乳植杆菌因其生态位多样而被归类为“游牧”或“全面手”菌株。可以从许多不同的新鲜和发酵食品中分离植物乳植杆菌，包括水果、蔬菜、肉类、乳制品和谷物，同时也是昆虫、鱼类、动物和人类微生物组的一部分。与其广泛的环境和宿主相适应，植物乳植杆菌表现出丰富的种内遗传和表型多样性。目前已经将之间的2个亚种L.plantarum subsp.plantarum和L.plantarum subsp.argentoratensis提升为新种L.plantarum和L.argentoratensis。“植物乳植杆菌”的中文名称可能会随着现实中的需要而变化，例如之前称为“植物乳杆菌”。其只要代表Lactiplantibacillus plantarum都应视为包含在本发明的保护范围之内。

[0054] 术语“IR Biotyper”，在本发明中简称IRBT，是2017年德国布鲁克公司推出基于FTIR技术的微生物分型系统。

[0055] 术语“欧几里得距离”，又称欧几里得度量(euclidean metric)(也称欧氏距离)，是一个通常采用的距离定义，指在m维空间中两个点之间的真实距离，或者向量的自然长度(即该点到原点的距离)。在二维和三维空间中的欧氏距离就是两点之间的实际距离。

[0056] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0057] 实施例1：乳植杆菌菌株的分离鉴定

[0058] 分离株的来源见表1。收集第7天和第21天的萝卜发酵液，用无菌生理盐水连续稀释后涂布于MRS琼脂(OXOID)，并在37℃在有氧或厌氧条件下孵育 48±3小时。在鉴定之前随机选择单菌落并重复在MRS上划线进行分离。通过 MALDI Biotyper(Bruker,Germany)在种水平上鉴定所有分离株，当MALDI‑TOF MS的分数≤2.0时，通过16S rDNA基因测序分析进行额外确认。本研究选择其中20株乳植杆菌分离株。将每种分离株在20％(w/v)甘油管中于‑80℃下保存，用于进一步研究。对于表型和基因型分析，乳植杆菌分离株通常在37℃的MRS 培养基中生长，无需摇动。

[0059] 表1本发明中使用的20株乳植杆菌分离株

[0060]

[0061] 其中：IRBT，IR Biotyper；PFGE，脉冲场凝胶电泳；WGS，全基因组测序；MLST，多位点序列分型；PT，益生菌表型分型

[0062] 实施例2：IR Biotyper光谱分型

[0063] 将实施例1中的所有分离株在37℃下在用Parafilm M密封的MRS培养基上生长48±3小时。对于FTIR分析，使用改进的H2O‑EtOH方法制备加载样品。首先，取细菌培养克隆一环，重新悬浮于100μL无菌H2O中。涡旋后，加入 100μL 70％(vol/vol)乙醇，并通过移液器混悬溶液以获得均匀的悬浮液。然后，将15μL细菌悬浮液点在IRBT硅样品板上，并在37℃下干燥直至形成干膜。每个样品重复3或4次。对于每次运行，使用IR Biotyper试剂盒中的红外测试标准试剂(IRTS 1和2)进行质量控制。

[0064] 使用IR Biotyper光谱仪(Bruker Optics‑Daltonics GmbH)在4,000‑500cm‑1光谱范围内以透射模式记录光谱。通过OPUS v7.5软件获取、可视化、和处理光谱。然后，对厂家‑1默认设置的多糖吸收区(1200–900cm )中FTIR光谱的二阶导数进行矢量归一化，用于放大分离株之间的差异，并校正与光谱采集相关的变量。在进一步分析中排除了不符合默认质量标准的数据。表明不同菌株之间关系的二阶导数IBRT的层次聚类分析(HCA)是通过离线的IRBT客户端软件 v2.0，使用欧几里得距离和平均连锁聚类方法构建的树状图进行分析。
对于每个树状图，，IR Biotyper软件自动计算聚类截止值(COV)，这是辛普森多样性指数和用户定义的参数的平均相干性结果。

[0065] 实施例3：IRBT重现性分析

[0066] 为了评估IRBT分型及可重复性，将涵盖WGS的5种序列类型(SNP差异范围0～65195)的20株乳植杆菌分离株，在两个不同实验室重复了3次独立分型实验。WGS的分型结果用作参考。进行IRBT的重现性分析是由于已知FTIR 光谱技术对培养基、孵育时间、温度和湿度的变化非常敏感。比较结果见图1，来自同一实验室的图1的A和图1的B的IRBT将20株分离株聚类为5种不同的光谱型(a～d)(如图2所示)，对应5种不同的WGS序列类型(1～5)，但来自不同实验室的图1的C除外。IRBT软件自动计算的图1的C的COV值为0.241，这将20株分离株分成7个簇，与WGS结果不一致。因此，我们将COV设置在两个节点(形成一个新集群的节点和当前最大距离的节点)的最“右侧”。经过用户调整后，图1的C的COV值变更为0.263，避免了来自不同实验室IRBT结果的偏差。对于每个树状图，调整后的COV值范围为0.241～
0.263，均给出了与WGS相一致的结果，这表明IRBT具有良好的重现性和稳健性。

[0067] 实施例4：基因型分析

[0068] 1、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析

[0069] 制备含有来自乳植杆菌分离株DNA琼脂糖包埋块用于PFGE分析，并选择合适的核酸内切酶处理。简而言之，将DNA在37℃下用30U的Asc I在150μL 的限制性缓冲液中消化4.5小时。用限制酶Xba I消化的沙门氏菌血清型 Braenderup(H9812)用作标记。用于PFGE分析的凝胶含有1％(w/v)SeaKem Gold琼脂糖(Sigma)溶解于0.5×Tris–硼酸盐–EDTA(TBE)缓冲液。PFGE在 CHEF‑mapper系统(Bio‑Rad Laboratories)6V/cm电压下和14℃中进行20小时。来自菌株的片段以1～15秒的脉冲运行。用Gelred染色后，使用Quantity One
4.4.1软件(Bio‑Rad Laboratories)在Bio‑Rad Gel Doc XR设备中获得图像。PFGE 模式的图像处理和聚类分析使用BioNumerics 7.6软件。

[0070] 分离株通过基于PFGE生成的相似性树状图进行亚型区分(如图3的A所示)。Asc I消化乳植杆菌基因组DNA产生了5种独特的PFGE模式(A～E)。PFGE 模式中的B、D和E由不止一个分离株组成，其中模式E包含最多的分离株(n＝ 11)，其次是模式B(n＝5)。事实上，C7‑83是唯一属于L.argentoratensis的菌株，与其它分离株相比显示出明显可辨别的模式。此外，大多数从同一发酵日期收集的分离株在树状图中按照时间因素紧密聚集。PFGE、WGS和IRBT聚类结果彼此完全一致。

[0071] 2、全基因组测序(WGS)和核苷酸同一性(ANI)计算

[0072] 按照制造商的说明，使用细菌基因组提取试剂盒(GeneRay，中国上海)提取乳植杆菌基因组DNA，并使用Illumina HiSeq 4000平台进行全基因组测序。总共有21.96Gb高质量配对的reads被保留用于进一步分析。使用CLC Genomics Workbench CLC v.12.0.3修剪原始读数并组装成contigs。基因组由NCBI原核基因组注释管道(PGAP)自动注释，并上传至GenBank的BioProject PRJNA769251 中。使用ResFinder 4.0数据库对获得性耐药基因进行鉴定。

[0073] 单核苷酸多态性(SNP)是通过使用BioNumerics软件7.6版将Trimmomatic 生成的高质量测序读数映射到核心基因组(core genome)来调用的，并设置了严格的SNP分析。基因组的系统发育分析由KSNP3.0软件基于最大似然法进行，其中SNP检测基k‑mer分析。通过比较使用JSpecies软件计算ANI值，确定了乳植杆菌分离株之间的全基因组相似性。

[0074] 为了生成基于光谱的分型方法参考，对20株已测序的乳植杆菌基因组进行了基于核心基因组SNP的系统发育比较。WGS数据允许从wg/cgMLST到SNP 差异的不同分辨率水平下进行分析。WGS将分离株分配到5个簇(如图3的B 所示)，此分类基于SNP≤12的两个分离株属于同一株细菌。其中，两个WGS 簇分别只包含一个分离株C7‑83和R47，而其他三个簇包含2～11个分离株(见表4)。到目前为止，代表性乳酸菌益生菌的wg/cgMLST或SNP分型的阈值尚未建立，并且为所有微生物设定通用的阈值标准并非易事。相关性的阈值必须根据微生物各个菌种来单独确定。

[0075] 计算了每个分离株WGS与乳植杆菌的两个邻近种的模式菌株基因组之间的ANI值。当ANI>95％表明分类为同一物种。相对于两个乳植杆菌模式菌的基因组，所有分离株显示出>94.8％的ANI值，其中分离株C7‑83与L. argentoratensis DSM16365T的ANI>99％；其他
19个分离株与L.plantarum ATCC 14817T的ANI>98.6％。ANI分析证实分离株C7‑83属于L.argentoratensis。而其它19个分离株属于L.plantarum(如图4所示)。至此，本研究中使用的分离株的分类归属均由ANI计算并获得可靠的确认。

[0076] 3、多位点序列分型(MLST)分析

[0077] MLST分析中包含了以下7个管家基因的序列(磷酸葡萄糖变位酶(pgm)、 D‑丙氨酸连接酶(ddl)、DNA促旋酶的B亚基(gyrB)、磷酸核糖氨基‑诺咪唑羧化酶(purK1)的ATPase亚基、谷氨酸脱氢酶(gdh)、DNA错配修复蛋白(mutS) 和转酮醇酶(tkt4))。等位基因图谱由De las Rivas等人(2006)描述的MLST方法确定。对所有分离株获得的序列进行比较，并将等位基因编号分配给每个独特的序列。每个分离株均由等位基因谱定义，该图谱对应所分析基因座上的等位基因的数字组合(见表4)。单个核苷酸位点不同的序列被认为是不同的等位基因。

[0078] 表4中指定了每个分离株的等位基因谱。由于无法获得C7‑83分离株的tkt4 等位基因序列，因此将它剔除于MTLS分析。基于6个基因座序列(从WGS 数据中提取)的MLST分析将20株分离株区分为4个等位基因谱(如图3的C 所示)。所有等位基因谱在至少2个基因座上存在差异。相比WGS‑SNP聚类和 PFGE，MLST方法不能成功将R62和R95与其它植物乳植杆菌菌株区分开来，分辨率较其他基因分型方法低。

[0079] 实施例5：益生菌表型分型及与IRBT的对应

[0080] 为了探索IRBT分型与表型属性之间的相关性，选择分别代表了了5个簇的 10株乳植杆菌分离株(即C7‑85、C7‑7、C7‑39、C7‑52、R62、R95、R47、R75、 R98和R106)，用于益生菌特征表征。

[0081] 1、酸和胆盐敏感性

[0082] 根据Silva等人(2013)和Sandes等人(2017)的改进方法评估了人工胃液敏感性(GJS)和人工胆汁敏感性(BSS)。将乳植杆菌克隆接种于pH 7.0的无菌生理盐水(对照)或人工胃液(NaCl 2g/L，胃蛋白酶3.2g/L，pH 2.5)或人工小肠液(NaHCO3 150mM，胰蛋白酶1.9g/L，pH 8.0)中，并在37℃下孵育3小时。离心样品，将沉淀悬浮在1mL MRS肉汤中。对于GJS和BSS分析，将每种培养物转移到 管中，在MRS肉汤或补充有0.3％胆汁酸
(Hopebio) 的MRS肉汤中稀释2％(v/v)。然后，将200μL细菌悬浮液等分到无菌的96孔微孔板中，并在恒温分光光度计(Microplate Spectrophotometer System SpectraMax I3X，Molecular Devices，Sunnyvale，美国)中孵育。在37℃下持续培养18小时。通过每30分钟测量的OD620吸光度确定生长曲线。使用程序 Graphpad Prism 8.0通过以下公式计算生长抑制百分比：(1‑AreaS/AreaCT)×100，其中AreaS和AreaCT分别对应菌株在人工胃液或胆汁盐压力下和对照的生长曲线下面积。菌株被分类为酸碱抗性GJS/BSS<40％、中度抗性40≤GJS/BSS≤75％或敏感GJS/BSS>75％。结果基于三个独立测定的平均值。

[0083] 益生菌候选菌需要能够在宿主的胃肠道中存活才能发挥有益作用，因此，我们评估了菌株对人工胃液和胆盐的敏感性。表2显示了10个被测分离株的 GJS和BSS值。其中，只有3个分离株C7‑85、C7‑7和C7‑39被鉴定为对酸和胆盐具有抗性(GJS/BSS<40％)。六株分离株R62、R95、R47、R75、R98和 R106表现出对酸的抗性，和对胆盐的中度抗性GJS<40％，40≤BSS≤75％)。只有一株乳植杆菌C7‑83对酸和胆盐敏感(GJS/BSS>75％)。

[0084] 表2乳植杆菌分离株对人工胃液和胆盐的耐受性及表面疏水性

[0085]

[0086] 其中，S(>75％)易受GJS/BSS影响；MR(40％‑75％)对GJS/BSS中度抗性；R(<40％)耐受GJS/BSS；HI(<30％)亲水；AI(30％‑70％)两亲性；HO(>70％)疏水性；GJS，胃液敏感性；BSS，胆盐敏感性；MAST，微生物对溶剂粘附性。

[0087] 2、表面疏水性

[0088] 根据Silva等人(2013)和Liu等人(2021)描述的方法，通过微生物对溶剂的粘附(MATS)来评估乳酸菌分离株的疏水/亲水细胞表面特性。将处于对数生长期的乳植杆菌离心，用PBS洗涤两次，并用0.1M KNO3、pH 6.2(A0)溶液将OD600nm调节至0.6。接下来，通过涡旋2分钟将0.4mL二甲苯混合到2.0mL 微生物悬浮液中。除去水相并测量OD600nm(A1)。MATS的计算公式为：(1– A1/A0)×100。菌株被归类为疏水性MATS>70％；两亲性为30％≤MATS≤70％；或亲水性<30％。结果基于三个独立测定的平均值。

[0089] 细菌粘附在非极性表面(如粘膜上皮)上的能力可以通过表面疏水性间接表明。10株乳植杆菌分离株的表面疏水性从2.3％到86.4％不等(见表2)。被归类为疏水性(MAST>70％)的分离株R62和R95的表面疏水性高于其它菌株。被归类为亲水性(MAST<30％)的分离株C7‑85、C7‑7、C7‑39、C7‑52、R75、 R98和R106现出相对低的疏水性，而MAST值为54.5％的分离R47被认为是两亲性的。

[0090] 3、抗生素药物敏感性试验

[0091] 通过琼脂盘扩散法进行抗生素微生物药敏试验。分离的乳植杆菌在MRS琼脂8
(Oxoid)上，在需氧条件下，37℃培养24小时。然后，使用0.85％缓冲盐水制备浓度为10 个细胞悬浮液(0.5McFarland标度)，并涂布于MRS琼脂 (Oxoid)。抗生素圆盘(Oxoid)分布于琼脂表面，在37℃下培养24小时。然后，根据自动抑菌圈测量的菌落计数器(Shineso Science&Technology Co.,Ltd, 杭州，中国)记录抑菌圈的直径(mm)。使用的15种抗生素圆盘 分别是：阿莫西林‑AMC(30μg)、红霉素‑E(15μg)、克林霉素‑DA(2μg)、氯霉素‑C(30μg)、四环素‑TE(30μg)、庆大霉素‑CN(10μg)、氨苄青霉素‑AMP(10μg)、磺胺甲恶唑‑SXT(25μg)、头孢曲松‑CRO(30μg)、卡那霉素‑K(30μg)、链霉素‑S (10μg)、恩诺沙星‑ENR(5μg)、青霉素GP(10U)、头孢西丁‑FOX(30μg)和奎奴普汀‑QD(15μg)。使用大肠杆菌ATCC 25922对含有抗菌剂的圆盘进行质量控制。根据Charteris等人(1998年)提出的临界水平，将乳杆菌分离株分为耐药、中度敏感和敏感三类。氨基糖苷类(庆大霉素、卡那霉素、链霉素和新霉素)、环丙沙星和甲氧苄啶的抗生素耐药性被认为是大多数乳酸菌种固有的，此外乳酸菌还对青霉素和β‑内酰胺类、氯霉素、四环素、红霉素、利奈唑胺和金霉素敏感。

[0092] 菌株E.coli ATCC 25922产生的抑菌环直径在质控范围内，证明本次试验所用培养基和药物是有效的。10株乳植杆菌对不同抗生素的耐药性结果见表3。在测试的15种抗生素中，所有10株菌株都对至少一种抗生素表现出耐药性。 C7‑85对恩诺沙星耐药(1个)，R47对恩诺沙星耐药，对链霉素中度敏感(2个)， R62和R95对除恩诺沙星和链霉素以外的卡那霉素和庆大霉素耐药(4个)，其余菌株表现出多重耐药。所有菌株对10种抗生素都敏感，即阿莫西林、红霉素、克林霉素、氯霉素、四环素、氨苄青霉素、头孢曲松、磺胺甲恶唑、青霉素‑G、头孢西丁和奎奴普丁。使用默认设置的ResFinder 4.0数据库中查询所有分离株的基因组序列中的获得性耐药基因，发现这些菌株的基因组中都不含获得性抗性基因，这表明这些分离株对于未来作为益生菌的应用是安全的。

[0093] 表3乳植杆菌对15种不同抗生素的耐药性

[0094]

[0095] 其中，“‑”代表无抑制圈；R(<10mm)对抗生素有抗药性；I(10‑20mm) 抗生素中间敏感；S(>20mm)对抗生素敏感；抗菌圆盘周围没有生长抑制区被描述为细菌耐药性；结果表示为敏感(S)、中间(I)和抗性(R)。

[0096] 4、统计分析

[0097] 应用R(4.0.2版)对基于乳植杆菌胃液和胆盐敏感性、表面疏水性和抗生素微生物敏感性的变量数据进行非层次聚类(K‑means)和主成分分析(PCA) 分析，对乳植杆菌分离株的益生菌表型进行分型。

[0098] 5、表型分型与IRBT光谱型的一致性

[0099] 对10株分离株的益生菌表型(酸耐受性、胆汁耐受性、表面疏水性和抗生素微生物敏感性)的数据进行聚类和PCA分析。如图5的A所示，聚类分析将 10株分离株分为三个主要聚类和五个亚聚类(I～Ⅴ)。根据IRBT和基因组分型结果，单独的C7‑85和R47分别形成簇I和簇Ⅲ。R62与R95分离形成簇Ⅳ。簇Ⅱ包括分离株C7‑7、C7‑39和C7‑52，而簇Ⅴ包含分离株R75、R98和R106 (见表4)。

[0100] 此外，基于各种益生菌特征，进行了PCA分析以评估候选益生菌之间的变异性和相似性。如图5的B所示，第一和第二主成分分别代表18个变量(GJS、 BSS、MAST和15种抗生素的抑菌圈直径)比重的55.6％和19.4％，表明耐受消化液在益生菌功能方面的重要性。在PCA图中观察到10个分离株清晰地分为5个点集，分离株C7‑83与其它分离株的距离最远。这些结果表明基因组的差异可以反映在表型上。基因型、表型和光谱的分型结果相互验证一致(见表4)。

[0101] 表4等位基因图谱与其他光谱型、基因型和表型的结果比较

[0102]

[0103]

[0104] 其中，*代表与该基因座最接近的变型体；ND为无可用数据。IRBT为IR Biotyper；WGS为全基因组测序；ST为序列类型；PFGE为脉冲场凝胶电泳； MLST为多位点序列分型；AP为等位基因谱；PT为表型分型。

[0105] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。