一种免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置及其应用转让专利
申请号 : CN202210089703.0
文献号 : CN114107512B
文献日 : 2022-05-13
发明人 : 刘宝琳 , 张园园 , 张泽民
申请人 : 北京大学
摘要 :
本发明提供了一种免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置及其应用，所述免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置包括测序模块、筛选模块、聚类分析模块、监控模块和分析模块。本发明还提供了一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的免疫治疗获得性耐药的早期筛查方法。本发明通过实时监控外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例变化，并结合活检样本中非耗竭性前体T细胞在癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例的变化进行综合判断，可以对样本是否对免疫治疗产生了获得性耐药进行极早期的筛查，结果准确，适用性强，为相关的治疗及用药提供了理论依据，具有重要的指导意义。
权利要求 :
1.一种免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置，其特征在于，所述免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置包括：
测序模块：取活检组织进行单细胞测序，根据T细胞受体序列对细胞进行分类，并计算每个基因表达量的平均值；
筛选模块：根据CD8A和CXCL13表达量的阈值，筛选出CD8A和CXCL13双阳性的克隆，即为癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆；
聚类分析模块：对所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆进行聚类分析，筛选出非耗竭性前体T细胞，并计算所述非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例，记为A1；
监控模块：对外周血进行单细胞测序，筛选出CD8A和CXCL13双阳性的克隆，即为外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆，计算所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例，并进行监控；
分析模块：所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例显著下降时，再次取活检组织进行单细胞测序，计算非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例，记为A2，根据A1与A2的差值，判断样本对免疫治疗的获得性耐药情况；
所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例显著下降的标准为：所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例相比于治疗有效期间的比例下降小于
50%，未发生显著下降；
所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例相比于治疗有效期间的比例下降大于或等于50%，发生显著下降；
所述判断的标准为：
所述A1与A2的差值大于或等于0.39，样本对免疫治疗产生获得性耐药；
所述A1与A2的差值小于0.39，样本未对免疫治疗产生获得性耐药；
所述免疫治疗为PD‑1抗体治疗或PD‑L1抗体治疗。
2. 根据权利要求1所述的免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置，其特征在于，所述单细胞测序包括10×Genomics 5’单细胞转录组建库测序；
所述聚类分析包括无监督聚类分析；
所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆与活检组织中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆具有相同的T细胞受体序列。
3.根据权利要求1所述的免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置，其特征在于，所述免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置包括：测序模块：取治疗有效期间的活检组织进行10×Genomics 5’单细胞转录组建库测序，得到单细胞的基因表达数据和T细胞受体测序数据，根据T细胞受体序列对细胞进行分类，并计算每个基因表达量的平均值；
筛选模块：根据CD8A和CXCL13表达量的阈值，筛选出CD8A和CXCL13双阳性的克隆，即为癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆；
聚类分析模块：对所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆进行无监督聚类分析，筛选出非耗竭性前体T细胞，并计算所述非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例，记为A1；
监控模块：对外周血进行10×Genomics 5’单细胞转录组建库测序，筛选出CD8A和CXCL13双阳性且与活检组织中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆具有相同的T细胞受体序列的克隆，即为外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆，计算所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例，并进行监控；
分析模块：所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例相比于治疗有效期间的比例下降大于或等于50%时，再次取活检组织进行10×Genomics 5’单细胞转录组建库测序，计算非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例，记为A2，根据A1与A2的差值，判断样本对免疫治疗的获得性耐药情况，所述判断的标准为：所述A1与A2的差值大于或等于0.39，样本对免疫治疗产生获得性耐药；
所述A1与A2的差值小于0.39，样本未对免疫治疗产生获得性耐药。
4.权利要求1 3任一项所述的免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置在制备免疫治疗获~
得性耐药筛查产品中的应用；
所述免疫治疗为PD‑1抗体治疗或PD‑L1抗体治疗。
说明书 :
一种免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于免疫治疗技术领域，尤其涉及一种免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置及其应用。
背景技术
[0002] 以PD‑1抗体治疗为代表的免疫检查点阻断疗法改善了癌症的治疗格局。一部分癌症患者在接受免疫检查点阻断疗法后对药物产生响应，病情逐渐好转；但是有15% 20%的患
~
者在治疗产生效果后的一段时间内病情开始加重，肿瘤变大并出现新的肿瘤转移，对治疗
产生了获得性耐药。
~
者在治疗产生效果后的一段时间内病情开始加重，肿瘤变大并出现新的肿瘤转移，对治疗
产生了获得性耐药。
[0003] 目前，癌症病人在首次接受免疫治疗三个月后医院会对癌症病人进行评估，如果不出现明显的疾病进展或者很严重的副作用，会继续进行免疫治疗；如果通过影像学等技
术发现癌症病人治疗好转一段时间后，肿瘤明显变大，或者出现新的癌症转移，则判断病人
出现了获得性耐药，并采取新的治疗策略，如免疫治疗和其他治疗方式联合治疗。
术发现癌症病人治疗好转一段时间后，肿瘤明显变大，或者出现新的癌症转移，则判断病人
出现了获得性耐药，并采取新的治疗策略，如免疫治疗和其他治疗方式联合治疗。
[0004] 基于影像学检测癌症病人是否出现免疫治疗获得性耐药的方法存在一定的缺陷。一方面，该方法具有滞后性，通常发现病人出现获得性耐药时病人的病情已经比较严重，导
致病人治疗的不及时；另一方面，免疫治疗的费用比较高，滞后判断会使患者承担不必要的
治疗费用。因此传统技术对获得性耐药检测的不及时不仅会对治疗不利，也会导致患者的
经济损失。
致病人治疗的不及时；另一方面，免疫治疗的费用比较高，滞后判断会使患者承担不必要的
治疗费用。因此传统技术对获得性耐药检测的不及时不仅会对治疗不利，也会导致患者的
经济损失。
[0005] 目前还没有成熟的免疫治疗获得性耐药的早期筛查方法。因此，如何提供一种可以对免疫治疗获得性耐药进行早期筛查的产品及方法，已成为亟待解决的问题。
发明内容
[0006] 针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置及其应用，通过监测外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例变化，并结合活检样
本中非耗竭性前体T细胞在癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例的变化进行判断，结果准
确，具有实际应用的价值。
本中非耗竭性前体T细胞在癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例的变化进行判断，结果准
确，具有实际应用的价值。
[0007] 为达此目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 第一方面，本发明提供了一种免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置，所述免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置包括：
[0009] 测序模块：取活检组织进行单细胞测序，根据T细胞受体序列对细胞进行分类，并计算每个基因表达量的平均值；
[0010] 筛选模块：根据CD8A和CXCL13表达量的阈值，筛选出CD8A和CXCL13双阳性的克隆，即为癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆；
[0011] 聚类分析模块：对所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆进行聚类分析，筛选出非耗竭性前体T细胞，并计算所述非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比
例，记为A1；
例，记为A1；
[0012] 监控模块：对外周血进行单细胞测序，筛选出CD8A和CXCL13双阳性的克隆，即为外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆，计算所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例，
并进行监控；
并进行监控；
[0013] 分析模块：所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例显著下降时，再次取活检组织进行单细胞测序，计算非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的
比例，记为A2，根据A1与A2的差值，判断样本对免疫治疗的获得性耐药情况。
比例，记为A2，根据A1与A2的差值，判断样本对免疫治疗的获得性耐药情况。
[0014] 本发明中，所述免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置通过监控外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例变化，并结合活检样本中非耗竭性前体T细胞在癌细胞杀伤性CD8
T细胞克隆中的比例的变化，进而判断样本对免疫治疗是否产生了获得性耐药，结果准确，
为相关的免疫治疗提供了理论依据；外周血的采集更为方便，因此可以达到实时监控的效
果，便于及时调整治疗方案，选择更加精准、有针对性的方法，同时也可以避免了反复活检
造成的伤害，减轻了患者的痛苦。
T细胞克隆中的比例的变化，进而判断样本对免疫治疗是否产生了获得性耐药，结果准确，
为相关的免疫治疗提供了理论依据；外周血的采集更为方便，因此可以达到实时监控的效
果，便于及时调整治疗方案，选择更加精准、有针对性的方法，同时也可以避免了反复活检
造成的伤害，减轻了患者的痛苦。
[0015] 优选地，所述单细胞测序包括10×Genomics 5’单细胞转录组建库测序。
[0016] 本发明中，具有同样T细胞受体（TCR）序列的细胞来自同一个细胞克隆，可根据T细胞受体的序列对细胞进行分类，确认每个细胞所属的克隆。
[0017] 本发明中，所述CD8A和CXCL13表达量的阈值可根据每个样本进行具体确认，方法为：以克隆为单位分别查看CD8A和CXCL13的基因表达分布，两个分布的拐点分别确定为
CD8A和CXCL13表达量的阈值。
CD8A和CXCL13表达量的阈值。
[0018] 本发明中，也可以直接将0.9作为CD8A表达量的阈值，将0.15作为CXCL13表达量的阈值，CD8A的表达量大于或等于0.9且CXCL13的表达量大于或等于0.15，即认为属于癌细胞
杀伤性CD8 T细胞克隆，采用这种方式对细胞进行筛选，准确率可达96.9%。
杀伤性CD8 T细胞克隆，采用这种方式对细胞进行筛选，准确率可达96.9%。
[0019] 优选地，所述聚类分析包括无监督聚类分析。
[0020] 本发明中，所述无监督聚类分析的流程包括：基因表达量标准化处理、差异表达基因选取、主成分分析、去除批次效应和聚类分析。
[0021] 本发明中，所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆经过无监督聚类分析后，可分为4个不同的亚群，即增殖性T细胞（高表达MKI67和STMN1等基因）、耗竭T细胞（高表达HAVCR2、
ENTPD1、LAYN、PDCD1、TIGIT、LAG3和CTLA4等基因）和非耗竭性前体（precursor）T细胞（低表
达耗竭T细胞的信号基因），其中非耗竭性前体T细胞进一步分为GZMK阳性前体T细胞和IL7R
阳性前体T细胞（高表达IL7R、TCF7、LEF1、CCR7和SELL基因）。
ENTPD1、LAYN、PDCD1、TIGIT、LAG3和CTLA4等基因）和非耗竭性前体（precursor）T细胞（低表
达耗竭T细胞的信号基因），其中非耗竭性前体T细胞进一步分为GZMK阳性前体T细胞和IL7R
阳性前体T细胞（高表达IL7R、TCF7、LEF1、CCR7和SELL基因）。
[0022] 优选地，所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆与活检组织中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆具有相同的T细胞受体序列。
[0023] 本发明中，在外周血中，与活检组织中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆具有相同TCR序列的T细胞克隆即为外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆。
[0024] 本发明中，所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例是指外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆在外周血中的所有T细胞中的占比。
[0025] 优选地，所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例显著下降的标准为：
[0026] 所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例相比于治疗有效期间的比例下降小于50%，未发生显著下降；
[0027] 所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例相比于治疗有效期间的比例下降大于或等于50%，发生显著下降。
[0028] 本发明中，所述治疗有效期间的比例为第一次外周血采样时，外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例。
[0029] 本发明中，以外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例作为监控的指标，若外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例显著下降，则认为可能出现了获得性耐药，需要重新
取活检样本进行测序分析，进一步验证及确认；若外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比
例未明显下降，则认为未出现获得性耐药，无需进行活检取样。由于外周血的取样比较方
便，因此可以对样本进行多个时间点的外周血采集及分析，达到实时监控的效果，一方面有
利于根据检查结果及时调整治疗方案，另一方面也可以避免反复活检带来的损伤，减轻了
患者的痛苦。
取活检样本进行测序分析，进一步验证及确认；若外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比
例未明显下降，则认为未出现获得性耐药，无需进行活检取样。由于外周血的取样比较方
便，因此可以对样本进行多个时间点的外周血采集及分析，达到实时监控的效果，一方面有
利于根据检查结果及时调整治疗方案，另一方面也可以避免反复活检带来的损伤，减轻了
患者的痛苦。
[0030] 优选地，所述判断的标准为：
[0031] 所述A1与A2的差值大于或等于0.39，样本对免疫治疗产生获得性耐药；
[0032] 所述A1与A2的差值小于0.39，样本未对免疫治疗产生获得性耐药。
[0033] 作为优选技术方案，本发明所述免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置，包括：
[0034] 测序模块：取治疗有效期间的活检组织进行10×Genomics 5’单细胞转录组建库测序，得到单细胞的基因表达数据和T细胞受体测序数据，根据T细胞受体序列对细胞进行
分类，并计算每个基因表达量的平均值；
分类，并计算每个基因表达量的平均值；
[0035] 筛选模块：根据CD8A和CXCL13表达量的阈值，筛选出CD8A和CXCL13双阳性的克隆，即为癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆；
[0036] 聚类分析模块：对所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆进行无监督聚类分析，筛选出非耗竭性前体T细胞，并计算所述非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆
中的比例，记为A1；
中的比例，记为A1；
[0037] 监控模块：对外周血进行10×Genomics 5’单细胞转录组建库测序，筛选出CD8A和CXCL13双阳性且与活检组织中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆具有相同的T细胞受体序列
的克隆，即为外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆，计算所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细
胞克隆的比例，并进行监控；
的克隆，即为外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆，计算所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细
胞克隆的比例，并进行监控；
[0038] 分析模块：所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例相比于治疗有效期间的比例下降大于或等于50%时，再次取活检组织进行10×Genomics 5’单细胞转录组建库测
序，计算非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例，记为A2，根据A1
与A2的差值，判断样本对免疫治疗的获得性耐药情况，所述判断的标准为：
序，计算非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例，记为A2，根据A1
与A2的差值，判断样本对免疫治疗的获得性耐药情况，所述判断的标准为：
[0039] 所述A1与A2的差值大于或等于0.39，样本对免疫治疗产生获得性耐药；
[0040] 所述A1与A2的差值小于0.39，样本未对免疫治疗产生获得性耐药。
[0041] 本发明中，所述免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置可以对包括乳腺癌、食管癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌和子宫内膜癌等在内的多种
样本进行筛查，适用性强，应用前景广阔。
样本进行筛查，适用性强，应用前景广阔。
[0042] 第二方面，本发明提供了一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的免疫治疗获得性耐药的早期筛查方法，所述早期筛查方法包括：
[0043] 取活检组织进行单细胞测序，根据T细胞受体序列对细胞进行分类，并计算每个基因表达量的平均值；
[0044] 根据CD8A和CXCL13表达量的阈值，筛选出CD8A和CXCL13双阳性的克隆，即为癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆；
[0045] 对所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆进行聚类分析，筛选出非耗竭性前体T细胞，并计算所述非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例，记为A1；
[0046] 对外周血进行单细胞测序，筛选出CD8A和CXCL13双阳性的克隆，即为外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆，计算所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例，并进行监
控；
控；
[0047] 所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例显著下降时，再次取活检组织进行单细胞测序，计算非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例，记
为A2，根据A1与A2的差值，判断样本对免疫治疗的获得性耐药情况。
为A2，根据A1与A2的差值，判断样本对免疫治疗的获得性耐药情况。
[0048] 优选地，所述单细胞测序包括10×Genomics 5’单细胞转录组建库测序。
[0049] 优选地，所述聚类分析包括无监督聚类分析。
[0050] 优选地，所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆与活检组织中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆具有相同的T细胞受体序列。
[0051] 优选地，所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例显著下降的标准为：
[0052] 所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例相比于治疗有效期间的比例下降小于50%，未发生显著下降；
[0053] 所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例相比于治疗有效期间的比例下降大于或等于50%，发生显著下降。
[0054] 优选地，所述判断的标准为：
[0055] 所述A1与A2的差值大于或等于0.39，样本对免疫治疗产生获得性耐药；
[0056] 所述A1与A2的差值小于0.39，样本未对免疫治疗产生获得性耐药。
[0057] 作为优选技术方案，本发明所述以非疾病诊断和/或治疗为目的的免疫治疗获得性耐药的早期筛查方法，包括以下步骤，其流程示意图如图1所示：
[0058] 取治疗有效期间的活检组织进行10×Genomics 5’单细胞转录组建库测序，得到单细胞的基因表达数据和T细胞受体测序数据，根据T细胞受体序列对细胞进行分类，并计
算每个基因表达量的平均值；
算每个基因表达量的平均值；
[0059] 根据CD8A和CXCL13表达量的阈值，筛选出CD8A和CXCL13双阳性的克隆，即为癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆；
[0060] 对所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆进行无监督聚类分析，筛选出非耗竭性前体T细胞，并计算所述非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例，记为
A1；
A1；
[0061] 对外周血进行10×Genomics 5’单细胞转录组建库测序，筛选出CD8A和CXCL13双阳性且与活检组织中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆具有相同的T细胞受体序列的克隆，即
为外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆，计算所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比
例，并进行监控；
为外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆，计算所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比
例，并进行监控；
[0062] 所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例相比于治疗有效期间的比例下降大于或等于50%时，再次取活检组织进行10×Genomics 5’单细胞转录组建库测序，计算非
耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例，记为A2，根据A1与A2的差
值，判断样本对免疫治疗的获得性耐药情况，所述判断的标准为：
耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例，记为A2，根据A1与A2的差
值，判断样本对免疫治疗的获得性耐药情况，所述判断的标准为：
[0063] 所述A1与A2的差值大于或等于0.39，样本对免疫治疗产生获得性耐药；
[0064] 所述A1与A2的差值小于0.39，样本未对免疫治疗产生获得性耐药。
[0065] 第三方面，本发明提供了第一方面所述的免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置和/或第二方面所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的的免疫治疗获得性耐药的早期筛查
方法在制备免疫治疗获得性耐药筛查产品中的应用。
方法在制备免疫治疗获得性耐药筛查产品中的应用。
[0066] 相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0067] 本发明通过监控外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例，并结合活检样本中非耗竭性前体T细胞在癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例的变化，对样本的获得性耐药
情况进行判断，为相关的治疗及用药提供了参考；所述免疫治疗获得性耐药的早期筛查装
置操作简单，使用方便，并且可以避免反复活检给患者带来的损伤和痛苦；对多种类型的样
本均可进行有效检测，适用性强；可以对样本进行获得性耐药的极早期筛查，在病人病情加
重即肿瘤复发、变大以及转移之前，及时判断出病人是否会对免疫治疗产生获得性耐药，以
利于病人的后续治疗；具有良好的灵敏度、特异性和准确性，可以对样本的免疫治疗获得性
耐药情况进行预测，准确率在93.3%以上，方便临床上根据检测结果尽早进行治疗方案的调
整，应用前景广阔。
情况进行判断，为相关的治疗及用药提供了参考；所述免疫治疗获得性耐药的早期筛查装
置操作简单，使用方便，并且可以避免反复活检给患者带来的损伤和痛苦；对多种类型的样
本均可进行有效检测，适用性强；可以对样本进行获得性耐药的极早期筛查，在病人病情加
重即肿瘤复发、变大以及转移之前，及时判断出病人是否会对免疫治疗产生获得性耐药，以
利于病人的后续治疗；具有良好的灵敏度、特异性和准确性，可以对样本的免疫治疗获得性
耐药情况进行预测，准确率在93.3%以上，方便临床上根据检测结果尽早进行治疗方案的调
整，应用前景广阔。
附图说明
[0068] 图1为本发明中的以非疾病诊断和/或治疗为目的的免疫治疗获得性耐药的早期筛查方法的流程示意图；
[0069] 图2为本发明实施例1中未接受免疫治疗、免疫治疗后无响应以及免疫治疗后有响应的肿瘤样本的单细胞测序数据的分析结果图片；
[0070] 图3为本发明实施例2中不同类型T细胞克隆的分类结果图片；
[0071] 图4为本发明实施例3中ExhaustionhiCXCL13+CD8A+T细胞和ExhaustionlowCXCL13++
CD8AT细胞的聚类分析及基因表达的结果图片；
CD8AT细胞的聚类分析及基因表达的结果图片；
[0072] 图5为本发明实施例4中在肿瘤中与外周血中具有相同TCR序列的癌细胞杀伤性CD8 T细胞的比例的相关性的结果图片；
[0073] 图6为本发明实施例4中治疗有响应与出现获得性耐药或无响应样本的外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞的比例的统计结果图片；
[0074] 图7为本发明实施例4中治疗有响应与出现获得性耐药或无响应样本的非耗竭性前体T细胞在癌细胞杀伤性CD8 T细胞中的比例的统计结果图片；
[0075] 图8为本发明实施例6中对免疫治疗获得性耐药情况进行预测的准确性的统计结果图片。
具体实施方式
[0076] 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非
对本发明的限定。
对本发明的限定。
[0077] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购
获得的常规产品。
获得的常规产品。
[0078] 实施例1
[0079] 本实施例收集33个癌症患者（头颈癌、肺癌和乳腺癌）对应的未接受免疫治疗、免疫治疗后无响应以及免疫治疗后有响应的肿瘤样本数据，对T细胞的单细胞测序数据进行
分析。其中，免疫治疗为PD‑1抗体治疗或PD‑L1抗体治疗。所分析的每一个CD8 T细胞克隆的
抗原特异性都已经通过体外实验或者基于体外实验结果的相关计算分析进行了验证。
分析。其中，免疫治疗为PD‑1抗体治疗或PD‑L1抗体治疗。所分析的每一个CD8 T细胞克隆的
抗原特异性都已经通过体外实验或者基于体外实验结果的相关计算分析进行了验证。
[0080] 结果如图2所示。可以看出，所有的CD8 T细胞克隆分为能够识别肿瘤抗原的癌细胞杀伤性CD8 T细胞，以及识别特定流感病毒抗原的非癌细胞杀伤性CD8 T细胞。结果显示，
来自没有接受免疫治疗和治疗后无响应的肿瘤中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆高表达耗
竭信号基因（HAVCR2、ENTPD1、LAYN、PDCD1、TIGIT、LAG3和CTLA4）和CXCL13，标记为
hi + +
Exhaustion CXCL13 CD8A T细胞。来自治疗后有响应的肿瘤中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞
low + +
低表达耗竭信号基因并高表达CXCL13，标记为Exhaustion CXCL13CD8AT细胞。
来自没有接受免疫治疗和治疗后无响应的肿瘤中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆高表达耗
竭信号基因（HAVCR2、ENTPD1、LAYN、PDCD1、TIGIT、LAG3和CTLA4）和CXCL13，标记为
hi + +
Exhaustion CXCL13 CD8A T细胞。来自治疗后有响应的肿瘤中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞
low + +
低表达耗竭信号基因并高表达CXCL13，标记为Exhaustion CXCL13CD8AT细胞。
[0081] 实施例2
[0082] 对实施例1中样本的所有的CD4 T细胞克隆和CD8 T细胞克隆的CXCL13和CD8A的表达情况进行分析。结果如图3所示，CD8A和CXCL13的表达量可以有效地鉴定癌细胞杀伤性
CD8 T细胞克隆。本实施例中，直接将0.9作为CD8A表达量的阈值，将0.15作为CXCL13表达量
的阈值。CD8A的表达量大于或等于0.9且CXCL13的表达量大于或等于0.15，即认为属于癌细
胞杀伤性CD8 T细胞克隆，采用这种方式对T细胞克隆进行筛选，准确率可达96.9%。
CD8 T细胞克隆。本实施例中，直接将0.9作为CD8A表达量的阈值，将0.15作为CXCL13表达量
的阈值。CD8A的表达量大于或等于0.9且CXCL13的表达量大于或等于0.15，即认为属于癌细
胞杀伤性CD8 T细胞克隆，采用这种方式对T细胞克隆进行筛选，准确率可达96.9%。
[0083] 实施例3
[0084] 对实施例1中所有的ExhaustionhiCXCL13+CD8A+T细胞和ExhaustionlowCXCL13+CD8A+
T细胞进行无监督聚类分析，发现这些癌细胞杀伤性CD8 T细胞可以分为4个亚群（如图4所
示），包括增殖性T细胞（高表达MKI67和STMN1等基因）、耗竭T细胞（高表达HAVCR2、ENTPD1、
LAYN、PDCD1、TIGIT、LAG3和CTLA4等基因）和非耗竭性前体T细胞，非耗竭性前体T细胞可以
进一步分为GZMK阳性前体T细胞和IL7R阳性前体T细胞（高表达IL7R、TCF7、LEF1、CCR7和
SELL基因）。
T细胞进行无监督聚类分析，发现这些癌细胞杀伤性CD8 T细胞可以分为4个亚群（如图4所
示），包括增殖性T细胞（高表达MKI67和STMN1等基因）、耗竭T细胞（高表达HAVCR2、ENTPD1、
LAYN、PDCD1、TIGIT、LAG3和CTLA4等基因）和非耗竭性前体T细胞，非耗竭性前体T细胞可以
进一步分为GZMK阳性前体T细胞和IL7R阳性前体T细胞（高表达IL7R、TCF7、LEF1、CCR7和
SELL基因）。
[0085] 实施例4
[0086] 本实施例对33个患者的9个肿瘤样本的单细胞测序数据以及对应的9个外周血TCR测序数据进行了分析，分别计算了非耗竭性前体T细胞在肿瘤中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞
的比例，及该群细胞对应的在外周血中具有相同TCR序列的克隆在T细胞中的整体比例，发
现外周血中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞的比例与肿瘤中的比例显著相关（如图5所示），表明
可以通过检测外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞的变化，从而判断肿瘤中的癌细胞杀伤性CD8
T细胞的变化。
的比例，及该群细胞对应的在外周血中具有相同TCR序列的克隆在T细胞中的整体比例，发
现外周血中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞的比例与肿瘤中的比例显著相关（如图5所示），表明
可以通过检测外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞的变化，从而判断肿瘤中的癌细胞杀伤性CD8
T细胞的变化。
[0087] 进一步比较了治疗期间有响应阶段的癌症患者外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞的比例，以及这群细胞在患者出现获得性耐药或无响应阶段外周血中具有相同TCR序列的克
隆的整体比例，发现当患者出现获得性耐药时，外周血中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞的比例
显著降低（如图6所示）。
隆的整体比例，发现当患者出现获得性耐药时，外周血中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞的比例
显著降低（如图6所示）。
[0088] 并计算了肿瘤当中癌细胞杀伤性CD8 T细胞的4个亚群的比例，发现非耗竭性前体T细胞（包括GZMK阳性前体T细胞和IL7R阳性前体T细胞）在癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中
的比例在治疗后有响应的肿瘤中较高，而在治疗后出现获得性耐药的肿瘤中以及治疗后无
响应的肿瘤中比例较低（如图7所示），表明了肿瘤中非耗竭性前体T细胞在癌细胞杀伤性
CD8 T细胞中的比例结合外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞的比例变化可以很好地对患者是
否对免疫治疗产生了获得性耐药进行早期筛查。
的比例在治疗后有响应的肿瘤中较高，而在治疗后出现获得性耐药的肿瘤中以及治疗后无
响应的肿瘤中比例较低（如图7所示），表明了肿瘤中非耗竭性前体T细胞在癌细胞杀伤性
CD8 T细胞中的比例结合外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞的比例变化可以很好地对患者是
否对免疫治疗产生了获得性耐药进行早期筛查。
[0089] 实施例5
[0090] 本实施例提供一种免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置，所述免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置包括：
[0091] 测序模块：取治疗有效期间的活检组织进行10×Genomics 5’单细胞转录组建库测序，得到单细胞的基因表达数据和T细胞受体测序数据，根据T细胞受体序列对细胞进行
分类，并计算每个基因表达量的平均值；
分类，并计算每个基因表达量的平均值；
[0092] 筛选模块：根据CD8A和CXCL13表达量的阈值，筛选出CD8A和CXCL13双阳性的克隆，即为癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆；
[0093] 聚类分析模块：对所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆进行无监督聚类分析，筛选出非耗竭性前体T细胞，并计算所述非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆
中的比例，记为A1；
中的比例，记为A1；
[0094] 监控模块：对外周血进行10×Genomics 5’单细胞转录组建库测序，筛选出CD8A和CXCL13双阳性且与活检组织中的癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆具有相同的T细胞受体序列
的克隆，即为外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆，计算所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细
胞克隆的比例，并进行监控；
的克隆，即为外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆，计算所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细
胞克隆的比例，并进行监控；
[0095] 分析模块：所述外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例相比于治疗有效期间的比例下降大于或等于50%时，再次取活检组织进行10×Genomics 5’单细胞转录组建库测
序，计算非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例，记为A2，根据A1
与A2的差值，判断样本对免疫治疗的获得性耐药情况，所述判断的标准为：
序，计算非耗竭性前体T细胞在所述癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例，记为A2，根据A1
与A2的差值，判断样本对免疫治疗的获得性耐药情况，所述判断的标准为：
[0096] 所述A1与A2的差值大于或等于0.39，样本对免疫治疗产生获得性耐药；
[0097] 所述A1与A2的差值小于0.39，样本未对免疫治疗产生获得性耐药。
[0098] 实施例6
[0099] 本实施例使用实施例5中的免疫治疗获得性耐药的早期筛查装置，对15个免疫治疗后有响应且未耐药的样本和15个免疫治疗有响应后出现耐药或治疗无响应的样本进行
分析，对结果的准确性进行评价。结果如图8所示，采用所述免疫治疗获得性耐药的早期筛
查装置对样本的免疫治疗获得性耐药的情况进行预测，准确率达到93.3%。
分析，对结果的准确性进行评价。结果如图8所示，采用所述免疫治疗获得性耐药的早期筛
查装置对样本的免疫治疗获得性耐药的情况进行预测，准确率达到93.3%。
[0100] 综上所述，本发明通过监控外周血癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆的比例变化，并结合活检样本中非耗竭性前体T细胞在癌细胞杀伤性CD8 T细胞克隆中的比例的变化，可以对
样本是否对免疫治疗产生了获得性耐药进行极早期筛查，方便及时调整治疗方案，操作简
便，结果准确，并且可以缓解患者的痛苦，具有极高的应用价值。
样本是否对免疫治疗产生了获得性耐药进行极早期筛查，方便及时调整治疗方案，操作简
便，结果准确，并且可以缓解患者的痛苦，具有极高的应用价值。
[0101] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的
技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的
添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的
添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。