本发明公开了一种检测小麦品种纯度的SNP分子标记组合及其应用。本发明通过筛选出一套共21个高质量和高多态性的SNP标记，可用于来源不同的小麦品种纯度的精准检测，具有广泛的应用普适性；标记为共显性标记，特异性、灵敏度和分辨力高；标记不受环境条件影响，能够使用种子或任何类型的植物组织，检测结果准确、重复性和稳定性好。
1.一种检测小麦品种纯度的SNP分子标记组合在鉴定或辅助鉴定小麦品种纯度中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记组合由以下SNP分子标记组成：第一SNP分子标记，所述第一SNP分子标记位于小麦参考基因组第1A染色体第
534265581位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为G或A；
第二SNP分子标记，所述第二SNP分子标记位于小麦参考基因组第1B染色体第
643102010位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为A或C；
第三SNP分子标记，所述第三SNP分子标记位于小麦参考基因组第1D染色体第3958512位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为G或A；
第四SNP分子标记，所述第四SNP分子标记位于小麦参考基因组第2A染色体第16865489位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为C或T；
第五SNP分子标记，所述第五SNP分子标记位于小麦参考基因组第2B染色体第12076633位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为T或G；
第六SNP分子标记，所述第六SNP分子标记位于小麦参考基因组第2D染色体第69251621位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为A或G；
第七SNP分子标记，所述第七SNP分子标记位于小麦参考基因组第3A染色体第61219689位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为A或C；
第八SNP分子标记，所述第八SNP分子标记位于小麦参考基因组第3B染色体第
749024987位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为G或A；
第九SNP分子标记，所述第九SNP分子标记位于小麦参考基因组第3D染色体第
578414376位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为T或C；
第十SNP分子标记，所述第十SNP分子标记位于小麦参考基因组第4A染色体第
715512695位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为T或C；
第十一SNP分子标记，所述第十一SNP分子标记位于小麦参考基因组第4B染色体第
159349087位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为G或A；
第十二SNP分子标记，所述第十二SNP分子标记位于小麦参考基因组第4D染色体第
456087457位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为C或T；
第十三SNP分子标记，所述第十三SNP分子标记位于小麦参考基因组第5A染色体第
533072137位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为G或A；
第十四SNP分子标记，所述第十四SNP分子标记位于小麦参考基因组第5B染色体第
601419406位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为T或C；
第十五SNP分子标记，所述十五SNP分子标记位于小麦参考基因组第5D染色体第
562098034位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为A或G；
第十六SNP分子标记，所述第十六SNP分子标记位于小麦参考基因组第6A染色体第
595564056位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为T或C；
第十七SNP分子标记，所述第十七SNP分子标记位于小麦参考基因组第6B染色体第
704974282位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为C或T；
第十八SNP分子标记，所述第十八SNP分子标记位于小麦参考基因组第6D染色体第
454587758位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为C或T；
第十九SNP分子标记，所述第十九SNP分子标记位于小麦参考基因组第7A染色体第
54723172位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为G或A；
第二十SNP分子标记，所述第二十SNP分子标记位于小麦参考基因组第7B染色体第
706809043位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为C或T；
第二十一SNP分子标记，所述第二十一SNP分子标记位于小麦参考基因组第7D染色体第
629330949位核苷酸，该位点的核苷酸碱基为G或A；
其中，所述小麦参考基因组为小麦Triticum aestivum IWGSC RefSeq v1.0版本参考基因组。
2.用于扩增如权利要求1中所述的检测小麦品种纯度的SNP分子标记组合的引物组。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物组均独立地包括两条特异性引物和1条通用引物，所述两条特异性引物连接有不同的荧光基团标签序列。
4.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物组包括：第一SNP引物组，用于扩增所述第一SNP分子标记，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物，还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的通用引物；
第二SNP引物组，用于扩增所述第二SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.6所示的通用引物核苷酸序列；
第三SNP引物组，用于扩增所述第三SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.9所示的通用引物核苷酸序列；
第四SNP引物组，用于扩增所述第四SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.12所示的通用引物核苷酸序列；
第五SNP引物组，用于扩增所述第五SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.15所示的通用引物核苷酸序列；
第六SNP引物组，用于扩增所述第六SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.18所示的通用引物核苷酸序列；
第七SNP引物组，用于扩增所述第七SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.21所示的通用引物核苷酸序列；
第八SNP引物组，用于扩增所述第八SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.24所示的通用引物核苷酸序列；
第九SNP引物组，用于扩增所述第九SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.27所示的通用引物核苷酸序列；
第十SNP引物组，用于扩增所述第十SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.30所示的通用引物核苷酸序列；
第十一SNP引物组，用于扩增所述第十一SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.33所示的通用引物核苷酸序列；
第十二SNP引物组，用于扩增所述第十二SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.36所示的通用引物核苷酸序列；
第十三SNP引物组，用于扩增所述第十三SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.39所示的通用引物核苷酸序列；
第十四SNP引物组，用于扩增所述第十四SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.42所示的通用引物核苷酸序列；
第十五SNP引物组，用于扩增所述第十五SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.45所示的通用引物核苷酸序列；
第十六SNP引物组，用于扩增所述第十六SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.48所示的通用引物核苷酸序列；
第十七SNP引物组，用于扩增所述第十七SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.51所示的通用引物核苷酸序列；
第十八SNP引物组，用于扩增所述第十八SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.54所示的通用引物核苷酸序列；
第十九SNP引物组，用于扩增所述第十九SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.57所示的通用引物核苷酸序列；
第二十SNP引物组，用于扩增所述第二十SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.60所示的通用引物核苷酸序列；
第二十一SNP引物组，用于扩增所述第二十一SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.63所示的通用引物核苷酸序列。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求2‑4任一项所述的引物组。
6.如权利要求2‑4任一项所述的引物组或权利要求5所述的试剂盒的以下任一应用：（1）在鉴定或辅助鉴定小麦品种纯度中的应用；
7.利用如权利要求1中所述的SNP分子标记组合进行小麦品种纯度检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S2、对步骤S1中提取的基因组DNA中的所述SNP分子标记组合进行多态性检测，得到待测小麦样品的基因型；
S3、统计分析步骤S2获得的待测小麦样品个体的基因型，鉴别杂株，根据杂株个体数目和检测总数计算品种纯度。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，若某一待测小麦样品的基因型，在2个及以上SNP位点上，不同于其他多数待测个体，则判定所述待测小麦个体为杂株。
9.一种小麦育种方法，包括如下步骤：利用如权利要求7或8所述的小麦品种纯度检测的方法，选择小麦进行后续育种。
一种检测小麦品种纯度的SNP分子标记组合及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于农业分子生物学领域，具体涉及一种检测小麦品种纯度的SNP分子标记组合及其应用。
背景技术
[0002] 小麦是主要的粮食作物；小麦主要的生产来源于常规品种和杂交种。随着小麦育种技术的不断发展和小麦的大面积的推广应用，品种的纯度检测成为小麦育种研发、种子
生产以及种子交易必不可少的质量保证。
[0003] 现在小麦品种纯度鉴定主要依赖于传统的田间小区种植鉴定方法（Grow‑out Test）。田间种植鉴定把品种种植于田间测试小区，通过观察植株不同生长时期（苗期、生
长、花期、成熟期以及种子）的植物学形态特征（如植株的高矮及大小、分蘖、叶色、叶形、种
子大小、种皮颜色等）和生物学特性（如植株的生育期、光周期、抗病性、抗旱性、种子落粒性
等）的不同来鉴定该小麦品种的纯度。此方法取决于对植物在田间的形态特征和生物学特
性的视觉识别，判断标准往往很难精确量化，主观性强，检测灵敏度和分辨力低；易受环境
和栽培条件影响，准确性和稳定性差；耗时长、时效性差；需投入大量人力、物力，成本高。
[0004] DNA分子标记法是现在作物品种纯度检测最常用方法。DNA分子标记是直接反应DNA差异（多态性）的一种遗传标记，主要包括SSR（Simple Sequence Repeat, 简单重复序
列）和SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）等。SSR目前已经成为纯度
和品种真实性检测的主要方法之一，在多种作物如水稻，小麦、大豆等都有SSR的国标，目前
SSR大面积使用有它的优势，包括具有实验室操作简单，成本低，重复性较好，结果真实可靠
等。比较起SSR标记法，SNP标记法技术更简单，易于自动化，检测通量高，速度快；单位数据
点检测成本低；不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性；是
快速、简便、灵敏、准确、稳定、低成本鉴定品种纯度的最常用方法。但是目前基于SNP标记的
小麦纯度检测方法鲜见报道。
发明内容
[0005] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测小麦纯度的SNP分子标记组合。
[0006] 本发明还提出用于扩增上述SNP分子标记组合的引物组。
[0007] 本发明还提出一种试剂盒。
[0008] 本发明还提出一种基因芯片。
[0009] 本发明还提出上述SNP分子标记组合、引物组、试剂盒和/或基因芯片的应用。
[0010] 本发明还提出利用上述SNP分子标记组合进行小麦品种纯度检测的方法。
[0011] 在本发明的第一方面，提出了一种检测小麦纯度的SNP分子标记组合，由以下SNP分子标记组成：
[0012] 第一SNP分子标记，所述第一SNP分子标记位于小麦参考基因组第1A染色体第534265581位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为G
或A；
[0013] 第二SNP分子标记，所述第二SNP分子标记位于小麦参考基因组第1B染色体第643102010位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A
或C；
[0014] 第三SNP分子标记，所述第三SNP分子标记位于小麦参考基因组第1D染色体第3958512位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为G或
A；
[0015] 第四SNP分子标记，所述第四SNP分子标记位于小麦参考基因组第2A染色体第16865489位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C或
T；
[0016] 第五SNP分子标记，所述第五SNP分子标记位于小麦参考基因组第2B染色体第12076633位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为T或
G；
[0017] 第六SNP分子标记，所述第六SNP分子标记位于小麦参考基因组第2D染色体第69251621位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或
G；
[0018] 第七SNP分子标记，所述第七SNP分子标记位于小麦参考基因组第3A染色体第61219689位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A或
C；
[0019] 第八SNP分子标记，所述第八SNP分子标记位于小麦参考基因组第3B染色体第749024987位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为G
或A；
[0020] 第九SNP分子标记，所述第九SNP分子标记位于小麦参考基因组第3D染色体第578414376位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为T
或C；
[0021] 第十SNP分子标记，所述第十SNP分子标记位于小麦参考基因组第4A染色体第715512695位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为T
或C；
[0022] 第十一SNP分子标记，所述第十一SNP分子标记位于小麦参考基因组第4B染色体第159349087位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为G
或A；
[0023] 第十二SNP分子标记，所述第十二SNP分子标记位于小麦参考基因组第4D染色体第456087457位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C
或T；
[0024] 第十三SNP分子标记，所述第十三SNP分子标记位于小麦参考基因组第5A染色体第533072137位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为G
或A；
[0025] 第十四SNP分子标记，所述第十四SNP分子标记位于小麦参考基因组第5B染色体第601419406位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为T
或C；
[0026] 第十五SNP分子标记，所述十五SNP分子标记位于小麦参考基因组第5D染色体第562098034位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为A
或G；
[0027] 第十六SNP分子标记，所述第十六SNP分子标记位于小麦参考基因组第6A染色体第595564056位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为T
或C；
[0028] 第十七SNP分子标记，所述第十七SNP分子标记位于小麦参考基因组第6B染色体第704974282位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C
或T；
[0029] 第十八SNP分子标记，所述第十八SNP分子标记位于小麦参考基因组第6D染色体第454587758位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C
或T；
[0030] 第十九SNP分子标记，所述第十九SNP分子标记位于小麦参考基因组第7A染色体第54723172位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为G或
A；
[0031] 第二十SNP分子标记，所述第二十SNP分子标记位于小麦参考基因组第7B染色体第706809043位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为C
或T；
[0032] 第二十一SNP分子标记，所述第二十一SNP分子标记位于小麦参考基因组第7D染色体第629330949位核苷酸，或其品种间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基
为G或A；
[0033] 其中，所述小麦参考基因组为小麦Triticum aestivum IWGSC RefSeq v1.0版本参考基因组。
[0034] 在本发明的第二方面，提出了用于扩增上述SNP分子标记组合的引物组。
[0035] 在本发明的一些实施方式中，所述引物组均独立地包括两条特异性引物和1条通用引物，所述两条特异性引物连接有不同的荧光基团标签序列。
[0036] 在本发明的一些实施方式中，所述荧光基团标签序列选自FAM、HEX。
[0037] 在本发明的一些实施方式中，所述引物组包括：第一SNP引物组，用于扩增所述第一SNP分子标记，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物，还包括
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的通用引物；
[0038] 第二SNP引物组，用于扩增所述第二SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.6所示的通用引物核苷酸序列；
[0039] 第三SNP引物组，用于扩增所述第三SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.9所示的通用引物核苷酸序列；
[0040] 第四SNP引物组，用于扩增所述第四SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.12所示的通用引物核苷酸序列；
[0041] 第五SNP引物组，用于扩增所述第五SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.15所示的通用引物核苷酸序列；
[0042] 第六SNP引物组，用于扩增所述第六SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.18所示的通用引物核苷酸序列；
[0043] 第七SNP引物组，用于扩增所述第七SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.21所示的通用引物核苷酸序列；
[0044] 第八SNP引物组，用于扩增所述第八SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.24所示的通用引物核苷酸序列；
[0045] 第九SNP引物组，用于扩增所述第九SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.27所示的通用引物核苷酸序列；
[0046] 第十SNP引物组，用于扩增所述第十SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.30所示的通用引物核苷酸序列；
[0047] 第十一SNP引物组，用于扩增所述第十一SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.33所示的通用引物核苷酸序
列；
[0048] 第十二SNP引物组，用于扩增所述第十二SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.36所示的通用引物核苷酸序
列；
[0049] 第十三SNP引物组，用于扩增所述第十三SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.39所示的通用引物核苷酸序
列；
[0050] 第十四SNP引物组，用于扩增所述第十四SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.42所示的通用引物核苷酸序
列；
[0051] 第十五SNP引物组，用于扩增所述第十五SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.45所示的通用引物核苷酸序
列；
[0052] 第十六SNP引物组，用于扩增所述第十六SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.48所示的通用引物核苷酸序
列；
[0053] 第十七SNP引物组，用于扩增所述第十七SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.51所示的通用引物核苷酸序
列；
[0054] 第十八SNP引物组，用于扩增所述第十八SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.54所示的通用引物核苷酸序
列；
[0055] 第十九SNP引物组，用于扩增所述第十九SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.57所示的通用引物核苷酸序
列；
[0056] 第二十SNP引物组，用于扩增所述第二十SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.60所示的通用引物核苷酸序
列；
[0057] 第二十一SNP引物组，用于扩增所述第二十一SNP分子标记，包括如SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62所示的特异性引物核苷酸序列，还包括如SEQ ID NO.63所示的通用引物核
苷酸序列。
[0058] 在本发明的第三方面，提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。
[0059] 在本发明的第四方面，提出了一种基因芯片，所述基因芯片包括上述引物组。
[0060] 在本发明的第五方面，提出了上述SNP分子标记组合、引物组、试剂盒和/或基因芯片的以下任一应用：
[0061] （1）在鉴定或辅助鉴定小麦品种纯度中的应用；
[0062] （2）在小麦分子标记辅助育种中的应用；
[0063] （3）在小麦育种中的应用；
[0064] （4）在制备小麦育种的产品中的应用。
[0065] 在本发明的第六方面，提出了利用上述SNP分子标记组合进行小麦品种纯度检测的方法，所述方法包括如下步骤：
[0066] S1、从待测小麦样品中提取基因组DNA；
[0067] S2、对步骤S1中提取的基因组DNA中的所述SNP分子标记组合进行多态性检测，得到待测小麦样品的基因型；
[0068] S3、统计分析步骤S2获得的待测小麦样品个体的基因型，鉴别杂株，根据杂株个体数目和检测总数计算品种纯度。
[0069] 在本发明的一些实施方式中，品种纯度的公式为：纯合度%=（检测总数‑杂株数）/检测总数×100%。
[0070] 在本发明的一些实施方式中，待测小麦样品个体数为大于95个。
[0071] 在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，小麦中提取基因组DNA采用简化CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法）。
[0072] 在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，用KASP（竞争性等位基因特异性PCR）技术对SNP分子标记组合进行检测。
[0073] 在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，若某一待测小麦样品的基因型，在2个及以上SNP位点上，不同于其他多数待测个体，则判定所述待测小麦个体为杂株。
[0074] 一种小麦育种方法，包括如下步骤：利用上述小麦品种纯度检测的方法，选择小麦进行后续育种。
[0075] 根据本发明实施方式的检测小麦SNP分子标记组合，至少具有如下有益效果：通过筛选出一套（1 SNP/染色体）共21个高质量和高多态性的SNP标记，可用于来源不同的小麦
品种（系）纯度的精准检测，具有广泛的应用普适性；标记为共显性标记，特异性、灵敏度和
分辨力高；标记不受环境条件影响，能够使用种子或任何类型的植物组织，检测结果准确、
重复性和稳定性好；不同检测实验室和不同的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适
的可比性；本发明利用基于Douglas Array Tape平台的KASP技术对所开发的SNP标记进行
基因分型，技术简单，易于自动化，速度快，自动化程度高，极大减少了实验室的人力及人为
错误；单位数据点检测成本低，检测通量高，加快小麦品种的选育进程。
[0076] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0077] 图1为本发明实施例的位点开发流程图；
[0078] 图2为本发明实施例的SNP分子标记WH90016的基因型分型示意图；
[0079] 图3为本发明实施例的SNP分子标记WH90021的基因型分型示意图。
具体实施方式
[0080] 以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施
例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前
提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特
殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂
和材料。
[0081] 本发明实施例为：用于小麦品种纯度检测的SNP分子标记组合
[0082] 本发明实施例的位点的设计过程，如图1所示，通过利用小麦的660K芯片和小麦相关的文献收集小麦SNP位点信息，在布里斯托尔小麦基因组标记库进行位点比对和筛选得
到用于小麦品种纯度检测的120个SNP位点，提取SNP位点和侧翼序列，通过设计和合成标记
的引物序列，再对标记进行验证和检测得到本申请方案的21个SNP分子标记，具体如下：
[0083] 1 21个用于小麦品种纯度检测的SNP分子标记的筛选
[0084] 通过利用小麦的660K芯片和小麦相关的文献，对小麦的功能基因所在区域所涉及的SNP位点进行筛选，对收集到的4万个功能相关的位点，在布里斯托尔小麦基因组标记库
进行位点比对，得到2000个完全匹配位点的小麦验证的KASP标记，得到超过4万个SNP位点。
进一步对2000个获得的KASP标记对小麦的参考基因组（Triticum aestivum IWGSC RefSeq
v1.0）进行序列比对，得到120个特异性最好的标记位点，根据这120个SNP位点设计KASP引
物，选取144份小麦各类资源进行基因分型验证，选出一套标记最少，并能够区分所有材料
的标记组合，最终挑选出21个用于小麦品种纯度检测的SNP标记，所述21个分子标记均为高
质量、单拷贝、高多态性 (144份小麦材料中的PIC值都高于>=0.35)、数据检出率>98%的SNP
标记。上述21个SNP分子标记的基本信息如表1所示。
[0085] 表1. 用于小麦品种纯度检测的SNP分子标记的物理位置
[0086]
[0087] 2 引物设计
[0088] KASP标记的设计：利用BatchPrimer3（http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/）对筛选出的21个SNP分子标记进行KASP引物设计。每个KASP标记由三条引
物组成，包括两条等位基因特异性引物 X（Primer_X；特异性引物X以引物名‑X的形式命名）
和Y（Primer Y；特异性引物Y以引物名‑Y的形式命名）以及一条通用引物C（Primer_C；通用
引物C以引物名‑C的形式命名）。两条等位基因特异性引物分别连接FAM和HEX荧光基团标签
序列。如果样品中只检测到FAM荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因X (Allele_X)；如
果只检测到HEX荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因Y (Allele_Y)；如果同时检测到
FAM和HEX荧光，则该样品的基因型为杂合（同时带有等位基因 X和Y）。21个用于小麦品种纯
度检测的KASP标记的等位基因型和引物序列见表2。
[0089] 表2.引物序列表
[0090]
[0091]
[0092]
[0093] 3 KASP检测
[0094] DNA提取：从小麦中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。
[0095] KASP标记检测流程：KASP标记的验证和检测用Douglas Scientific 的Array Tape系统进行。Array Tape基因型分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的
SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。
[0096] PCR反应体系：用NEXAR进行PCR反应体系的自动组装，PCR反应体系如下表3所示。
[0097] PCR扩增：用SOELLEX进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度
降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，30个循环。
[0098] 信号扫描和基因型分型：PCR反应完成后用ARAYA进行反应体系荧光信号扫描；然后用INTELLICS进行基因型分型和数据分析。在KASP标记基因型分型检测中，样品的基因型
分成3簇，分别为X簇、Y簇以及杂合基因型簇（见图2）。其中X簇表示样品在这个KASP标记位
点含有纯合X等位基因（分型图中标为红色，位于图形左上角），Y簇表示样品在这个KASP标
记位点含有纯合Y等位基因型（分型图中标为蓝色，位于图形右下角），杂合基因型簇表示样
品在这个KASP标记位点含有X和Y杂合等位基因型（分型图中标为紫色）。典型的KASP标记基
因型分型图如图2‑3所示。
[0099] 表3. KASP检测的PCR反应体系
[0100]
[0101] 4 21个用于小麦品种纯度检测的SNP分子标记验证
[0102] 21个用于小麦品种纯度检测的KASP标记的基因型分型质量验证：根据上述检测方法，用144个小麦多样性材料对21个KASP标记进行验证。
[0103] 结果如图2‑3所示，图2为WH90016 KASP标记基因型分型图，图3为WH90021 KASP标记基因型分型图，从图中可以看出KASP标记的二个纯合和杂合簇分型好、紧凑，位点为单拷
贝且检出率都高于98%，与测序结果一致，其他位点的结果同WH90016和WH90021一致。结果
表明，本申请方案的21个KASP标记的基因型分型质量完全能满足小麦品种纯度的精准检测。
[0104] 5 小麦品种纯度的计算
[0105] 小麦品种纯度的计算包括以下步骤：
[0106] (1)统计分析待测184个小麦（中国春）样品21个SNP分子标记的基因型。若某一待测个体中存在2个及以上位点不同于其他多数待测个体，则判定所述待测小麦个体为杂株。
结果如表4（表4包括表4‑1和表4‑2）所示，177个个体在21个SNP位点（SNP分子标记）的基因
型一致，为纯株；样品编号为12的个体在WH90005、WH900021 2个SNP位点上不同于其他183
个个体，判断为杂株；样品编号为24的个体在WH90005、WH900021 2个SNP位点上不同于其他
183个个体，判断为杂株；样品编号为33的个体在WH90009、WH900013等3个SNP位点上不同于
其他183个个体，判断为杂株；样品编号为44的个体在WH90009、WH900013等3个SNP位点上不
同于其他183个个体，判断为杂株；样品编号为75的个体在WH90005、WH900021 2个SNP位点
上不同于其他183个个体，判断为杂株；样品编号为138的个体在WH90005、WH900021 2个SNP
位点上不同于其他183个个体，判断为杂株；样品编号为173的个体在WH90009、WH900013等4
个SNP位点上不同于其他183个个体，判断为杂株。
[0107] (2)根据步骤(1)中杂株个体数目和检测总数计算品种纯度。
[0108] 纯合度的计算为：纯合度%=（检测总数‑杂株数）/检测总数×100%。
[0109] 所述待测小麦品种中国春的品种纯度为：（184‑7）/184×100%=96.20%。
[0110] 表4‑1
[0111]
[0112]
[0113]
[0114]
[0115]
[0116]
[0117] 表4‑2
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122]
[0123] 综上所述，本发明提供21个SNP分子标记组合，可用于来源不同的小麦品种和遗传材料纯度的精准检测，具有广泛的应用普适性，并且能追溯推测不纯样品的污染来源；具有
共显性标记，特异性、灵敏度和分辨力高；标记不受环境条件影响，能够使用种子或任何类
型的植物组织，检测结果准确、重复性和稳定性好；技术简单，易于自动化，检测通量高，速
度快。单位数据点检测成本低；不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普
适的可比性。
[0124] 本发明中使用的Douglas Array Tap基因分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS，与其配套试
剂耗材均购于英国LGC公司。
[0125] 上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作
出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
