抑制CHCHD2活性的物质在制备治疗NASH和肝损伤所致肝纤维化的产品中的应用

摘要

本发明公开了抑制CHCHD2活性的物质在制备治疗NASH和肝损伤所致肝纤维化的产品中的应用。本发明还公开了抑制CHCHD2活性的物质在制备抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展、改善非酒精性脂肪性肝炎或肝损伤所致肝纤维化的产品中的应用，以及增强或提高CHCHD2活性的物质在制备促进肝脏纤维化的产品中的应用。本发明对于非酒精性脂肪性肝炎或肝纤维化的发病机制以及治疗具有重要意义。

权利要求

1.抑制CHCHD2基因表达的物质或敲除CHCHD2基因的物质在如下a1）‑a3）任一种中的应用：a1）制备抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的产品；

a2）制备改善非酒精性脂肪性肝炎所致肝纤维化的产品；

a3）制备改善肝损伤所致肝纤维化的产品；

所述抑制CHCHD2基因表达的物质为沉默CHCHD2基因或干扰CHCHD2基因表达的miRNA、siRNA、dsRNA或shRNA；

所述敲除CHCHD2基因的物质为锌指蛋白ZFN基因编辑系统或TALENs基因编辑系统或CRISPR/Cas9基因编辑系统。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝损伤所致肝纤维化为化学因素所致肝纤维化。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展或改善非酒精性脂肪性肝炎所致肝纤维化体现在降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体或肝纤维化患病机体肝脏中的纤维化标记物的表达量。

4.一种构建非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的动物模型的方法，包括如下步骤：增加或提高动物中的CHCHD2蛋白含量和/或活性，从而获得所述非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的动物模型。

说明书

抑制CHCHD2活性的物质在制备治疗NASH和肝损伤所致肝纤维

化的产品中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学技术领域，具体涉及抑制CHCHD2活性的物质在制备治疗NASH和肝损伤所致肝纤维化的产品中的应用。

背景技术

[0002] 非酒精性脂肪性肝病(Non‑alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以肝内脂肪堆积为特征，包含一系列组织学改变的疾病，主要有单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化/肝硬化和肝癌。其发病率在发达国家为30％，发展中国家近10％，在一般人群中占20‑30％，肥胖人群中为75‑100％，是目前认为最普遍的肝脏疾病之一，可发展成终末期肝脏疾病。肥胖、高血压、血脂异常和胰岛素抵抗与NAFLD有密切关系。单纯性脂肪肝可逆转为正常肝脏，而进展到NASH后，脂肪变性将伴随炎症、肝细胞凋亡以及不同程度的肝纤维化。肝脏纤维化与终末期肝病的发生高度相关。目前，临床上尚缺乏治疗NASH和肝脏纤维化的有效手段。

[0003] CHCHD2(coiled‑coil‑helix‑coiled‑coil‑helix domain 2)是一种线粒体和细胞核双定位的蛋白。近年来，国内外学者对其进行了一定的研究。据报道：CHCHD2基因位点突变与帕金森氏病和Huntington等中枢神经系统变性疾病发生关系密切；而其编码蛋白可以调控肺癌细胞系和肾癌转移能力、乳腺癌能量代谢水平，还可作为滤泡样甲状腺癌的候选诊断标志物。但目前CHCHD2在肝脏中的作用鲜有报道。

发明内容

[0004] 第一方面，本发明保护抑制CHCHD2蛋白活性的物质的新用途。

[0005] 本发明保护抑制CHCHD2蛋白活性的物质在如下a1)‑a8)任一种中的应用：

[0006] a1)制备预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎或肝纤维化的产品；

[0007] a2)预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎或肝纤维化；

[0008] a3)制备抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的产品；

[0009] a4)抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展；

[0010] a5)制备改善非酒精性脂肪性肝炎所致肝纤维化的产品；

[0011] a6)改善非酒精性脂肪性肝炎所致肝纤维化；

[0012] a7)制备改善肝损伤所致肝纤维化的产品；

[0013] a8)改善肝损伤所致肝纤维化。

[0014] 第二方面，本发明保护抑制CHCHD2基因表达的物质或敲除CHCHD2基因的物质的新用途。

[0015] 本发明保护抑制CHCHD2基因表达的物质或敲除CHCHD2基因的物质在如下a1)‑a8)任一种中的应用：

[0016] a1)制备预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎或肝纤维化的产品；

[0017] a2)预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎或肝纤维化；

[0018] a3)制备抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的产品；

[0019] a4)抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展；

[0020] a5)制备改善非酒精性脂肪性肝炎所致肝纤维化的产品；

[0021] a6)改善非酒精性脂肪性肝炎所致肝纤维化；

[0022] a7)制备改善肝损伤所致肝纤维化的产品；

[0023] a8)改善肝损伤所致肝纤维化。

[0024] 上述a1)或a2)所述的应用中，所述肝纤维化为肝损伤所致肝纤维化，具体可为化学因素所致肝纤维化(如硫代乙酰胺诱导的肝纤维化)。

[0025] 上述a3)‑a8)所述应用中，所述抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展或改善非酒精性脂肪性肝炎所致肝纤维化或改善肝损伤所致肝纤维化体现在降低非酒精性脂肪性肝炎患病机体或肝纤维化患病机体肝脏中的纤维化标记物的表达量或胶原沉积量。

[0026] 进一步的，所述肝脏中的纤维化标记物为如下标记物中的至少一种：Des、Col1a1、Col3a1、TIMP1、TGFβ。

[0027] 更进一步的，所述非酒精性脂肪性肝炎患病机体可为患有非酒精性脂肪性肝炎的人或动物模型。

[0028] 在本发明的一个具体实施例中，所述非酒精性脂肪性肝炎患病机体为MCD饮食联合高脂饮食(MCD/HFD)诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型。

[0029] 在本发明的另一个具体实施例中，所述非酒精性脂肪性肝炎患病机体为高果糖高软脂酸高胆固醇(FPC)诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型。

[0030] 所述肝纤维化患病机体可为患有肝纤维化的人或动物模型。在本发明的一个具体实施例中，所述肝纤维化患病机体为硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠模型。

[0031] 上述a8)所述应用中，所述肝损伤所致肝纤维化可为化学因素所致肝纤维化，具体可为硫代乙酰胺诱导的肝纤维化。

[0032] 第三方面，本发明保护增强或提高CHCHD2蛋白活性的物质的新用途。

[0033] 本发明保护增强或提高CHCHD2蛋白活性的物质在如下b1)‑b6)任一种中的应用：

[0034] b1)制备促进非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的产品；

[0035] b2)促进非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展；

[0036] b3)制备促进肝脏纤维化的产品；

[0037] b4)促进肝脏纤维化；

[0038] b5)制备提高肝细胞中osteopontin表达水平(如蛋白质表达水平)或促进肝细胞分泌osteopontin的产品；

[0039] b6)提高肝细胞中osteopontin表达水平(如蛋白质表达水平)或促进肝细胞分泌osteopontin。

[0040] 上述b1)‑b4)所述应用中，所述促进非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展或促进肝脏纤维化体现在提高非酒精性脂肪性肝炎患病机体肝脏中的纤维化标记物的表达量或胶原沉积量。

[0041] 进一步的，所述肝脏中的纤维化标记物为如下标记物中的至少一种：Col3a1、TIMP1、Col1a1、CTGF。

[0042] 更进一步的，所述非酒精性脂肪性肝炎患病机体可为患有非酒精性脂肪性肝炎的人或动物模型。

[0043] 在本发明的一个具体实施例中，所述非酒精性脂肪性肝炎患病机体为MCD饮食联合高脂饮食(MCD/HFD)诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型。

[0044] 上述b1)‑b4)所述应用中，所述增强或提高CHCHD2蛋白活性的物质通过促进肝细胞分泌osteopontin进而促进肝脏纤维化或非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展。

[0045] 上述b1)‑b6)所述应用中，所述增强或提高CHCHD2蛋白活性的物质为过表达CHCHD2的物质。在本发明的一个具体实施例中，所述过表达CHCHD2的物质为过表达CHCHD2的腺相关病毒。

[0046] 第四方面，本发明保护一种构建非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的动物模型的方法。

[0047] 本发明保护的构建非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的动物模型的方法包括如下步骤：增加或提高动物中的CHCHD2蛋白含量和/或活性，从而获得所述非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的动物模型。进一步的，所述动物模型为小鼠模型。

[0048] 第五方面，本发明保护一种产品；所述产品的活性成分为抑制CHCHD2蛋白活性的物质或抑制CHCHD2基因表达的物质或敲除CHCHD2基因的物质；

[0049] 所述产品具有如下c1)‑c4)任一种功能：

[0050] c1)预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎或肝纤维化；

[0051] c2)抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展；

[0052] c3)改善非酒精性脂肪性肝炎所致肝纤维化；

[0053] c4)改善肝损伤所致肝纤维化。

[0054] 第五方面，本发明保护CHCHD2作为靶点的新用途。

[0055] 本发明保护CHCHD2作为靶点在如下d1)‑d4)任一种中的应用：

[0056] d1)开发或制备预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎或肝纤维化的产品；

[0057] d2)开发或制备抑制非酒精性脂肪性肝炎向肝纤维化进展的产品；

[0058] d3)开发或制备改善非酒精性脂肪性肝炎所致肝纤维化的产品；

[0059] d4)开发或制备改善肝损伤所致肝纤维化的产品。

[0060] 上述任一所述应用或产品中，所述抑制CHCHD2蛋白活性的物质可为以任何方式实现机体中CHCHD2蛋白失去活性的物质，如抑制CHCHD2蛋白合成或促进CHCHD2蛋白降解或抑制CHCHD2蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物等。所述小分子化合物具体可为CHCHD2蛋白活性抑制剂。

[0061] 所述抑制CHCHD2基因表达的物质可为以任何方式实现机体中CHCHD2基因无法表达的物质，具体方式可为去除或改变调节组分(如启动子编辑)使得CHCHD2基因序列不被转录、通过与mRNA的结合阻止翻译等。进一步的，所述抑制CHCHD2基因表达的物质可为沉默CHCHD2基因或干扰CHCHD2基因表达的miRNA、siRNA、dsRNA或shRNA。

[0062] 所述敲除CHCHD2基因的物质可为以任何方式实现机体不产生CHCHD2基因功能性蛋白质产物的物质，具体方式可为去除全部或部分CHCHD2基因序列、在CHCHD2基因中引入缺失突变和/或插入突变和/或碱基替换等。通常，敲除在基因组DNA水平上进行，使得细胞的后代也永久地携带敲除。进一步的，所述敲除CHCHD2基因的物质可为敲除CHCHD2基因的基因编辑系统，如锌指蛋白ZFN基因编辑系统或TALENs基因编辑系统或CRISPR/Cas9基因编辑系统等。更进一步的，所述敲除CHCHD2基因的物质为CRISPR/Cas9基因编辑系统。在本发明的具体实施例中，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统中的sgRNA识别的靶序列为序列5所示所示的DNA分子和序列6所示的DNA分子。

[0063] 上述任一所述应用或产品中，所述CHCHD2蛋白可为来源于人的CHCHD2蛋白(氨基酸序列如序列表中序列1所示)或来源于小鼠的CHCHD2蛋白(氨基酸序列如序列表中序列2所示)。所述CHCHD2基因可为序列表中序列3所示的基因组DNA分子或序列4第64‑519位所示的cDNA分子。

[0064] 上述任一所述应用或产品中，所述产品为药物。

[0065] 本发明首先通过研究发现CHCHD2在NAFLD病人肝脏与NASH小鼠肝脏中高表达，并随着肝纤维化程度加重其表达量有明显增加趋势。然后进一步通过构建CHCHD2敲除小鼠模型发现CHCHD2敲除可以改善NASH相关的肝纤维化和肝损伤所致的肝纤维化。再进一步通过构建过表达CHCHD2腺相关病毒发现肝细胞特异性过表达CHCHD2促进肝脏纤维化。最后为了研究CHCHD2过表达促进肝纤维化的机制，发现CHCHD2表达上调可通过促进肝细胞分泌osteopontin进而促进肝脏纤维化。本发明对于非酒精性脂肪性肝炎或肝纤维化的发病机制以及治疗具有重要意义。

附图说明

[0066] 图1为NAFLD病人肝脏中CHCHD2的表达水平。A、NAFLD病人和健康对照肝脏的H&E染色和Masson染色；B、NAFLD病人和健康对照肝脏组织切片的CHCHD2免疫组化染色；C‑D、统计图1B中累积光密度以反映CHCHD2的蛋白表达水平：比较健康对照与NAFLD病人CHCHD2表达量(C)；比较不同程度纤维化肝脏中CHCHD2的表达量(D)。S：肝纤维化等级；*P<0.05。

[0067] 图2为MCD/HFD诱导NASH小鼠肝脏中CHCHD2的表达水平。A、肝脏H&E染色及CHCHD2免疫组化染色；B‑C、western blot检测肝脏中CHCHD2的表达水平；D、qPCR检测肝脏中CHCHD2的mRNA表达水平；E‑F、western blot检测肝脏核蛋白和胞浆蛋白中CHCHD2的表达水平；G‑H、western blot检测肝脏线粒体蛋白中CHCHD2的表达水平。A‑D：n＝4；E‑H、n＝3；*P<0.05。

[0068] 图3为FPC诱导NASH小鼠肝脏中CHCHD2的表达水平。野生型C57BL/6雄鼠FPC或ND饮食喂养24周，western blot检测肝脏中CHCHD2的表达水平。n＝4‑5，*P<0.05。

[0069] 图4为CHCHD2敲除小鼠情况。A、western blot检测CHCHD2敲除小鼠和对照野生型小鼠肝脏中CHCHD2的蛋白表达水平；B、肝脏H&E染色；C、体重；D、肝脏、腹股沟脂肪和附睾脂肪组织重量。A‑B：n＝3；C：n＝10‑16；D：n＝3‑5，*P<0.05。

[0070] 图5为CHCHD2敲除对MCD/HFD饮食诱导NASH小鼠肝脏脂质沉积、炎症和纤维化的影响。CHCHD2敲除小鼠和野生型对照小鼠给予MCD/HFD饮食喂养4周：A、western blot检测肝脏中CHCHD2的表达水平；B、血浆ALT和AST水平；C、肝脏油红O染色、H&E染色、F4/80免疫组化染色；D、肝脏胆固醇和甘油三酯水平；E、肝脏天狼星红染色；F、qPCR检测肝脏中Des、Col1a1、Col3a1、TIMP1和CTGF的mRNA表达水平。n＝7‑8，*P<0.05。

[0071] 图6为western blot检测肝脏、附睾脂肪、腹股沟脂肪以及胰腺组织中flag的表达水平。

[0072] 图7为肝细胞特异性过表达CHCHD2对肝脏的影响。野生型小鼠给予AAV‑CHCHD2和AAV‑Ctrl尾静脉注射，注射AAV10天后继续给予正常饮食喂养4周：A、western blot检测肝脏中CHCHD2的表达水平；B、血浆ALT和AST水平；C、小鼠体重和肝脏重量；D、肝脏油红O染色、H&E染色、F4/80免疫组化染色；E、肝脏天狼星红染色；F、qPCR检测肝脏中Col1a1、Col3a1、TIMP1和CTGF的mRNA表达水平。n＝12‑13，*P<0.05。

[0073] 图8为肝细胞特异性过表达CHCHD2对MCD/HFD饮食诱导的NASH小鼠肝脏脂质沉积、炎症和纤维化的影响。野生型小鼠给予AAV‑CHCHD2和AAV‑Ctrl尾静脉注射，注射AAV10天后继续给予MCD/HFD饮食喂养4周：A、western blot检测肝脏中CHCHD2的表达水平；B、血浆ALT和AST水平；C、小鼠体重和肝脏重量；D、肝脏油红O染色、H&E染色、F4/80免疫组化染色；E、肝脏天狼星红染色；F、qPCR检测肝脏中Col1a1、Col3a1、TIMP1和CTGF的mRNA表达水平。n＝12‑13，*P<0.05。

[0074] 图9为CHCHD2敲除对TAA诱导小鼠肝纤维化的影响。A、野生型C57BL/6雄鼠腹腔注射TAA或生理盐水，western blot检测肝脏中CHCHD2的蛋白表达水平；B‑C、CHCHD2敲除小鼠和对照小鼠腹腔注射TAA：肝脏切片天狼星红染色；C、qPCR检测纤维化标记物的mRNA表达水平。A：n＝7‑8；B‑C：n＝6‑7，*P<0.05。

[0075] 图10为CHCHD2可上调osteopontin(OPN)的表达水平。A、小鼠原代肝细胞中用腺病毒过表达CHCHD2，48小时后western blot检测osteopontin(OPN)的蛋白表达水平；B、野生型小鼠给予AAV‑CHCHD2和AAV‑Ctrl尾静脉注射，注射AAV10天后继续给予正常饮食喂养4周，western blot检测肝脏中osteopontin(OPN)的蛋白表达水平。A：n＝5；B：n＝12‑13，*P<0.05。

具体实施方式

[0076] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

[0077] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0078] 实施例1、CHCHD2在NAFLD病人肝脏与NASH小鼠肝脏中高表达

[0079] 一、CHCHD2在NAFLD病人肝脏中高表达，且随着肝纤维化程度加重其表达量有明显增加趋势

[0080] 1、试验材料与方法

[0081] 从首都医科大学附属北京地坛医院收集了42例肝组织样本，然后由临床医生进行临床诊断、2名病理学专家独立进行病理学诊断。上述所有标本均明确排除病毒性肝炎、药物性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病、胆汁淤积性肝病和遗传性代谢性肝病。诊断为NAFLD患者的肝组织学评分根据NASH‑CRN系统，具体包括脂肪变性评分0～3、小叶炎症评分0～3、气球样变评分0～2和肝纤维化评分0～4等4个方面。每个肝组织样品均以5μm厚度切片，然后进行苏木素/伊红(H&E)染色和Masson染色，并对其进行CHCHD2免疫组织化学分析。
本研究共收集了38例NAFLD/NASH患者和4例健康人的肝脏组织标本。根据NASH‑CRN系统中纤维化等级(S)，将样本分为4组，即健康对照(HC)组、NAFLD S0组、NAFLD S1‑2组和NAFLD S3‑4组。38例患者中男性12例(32％)、女性26例(68％)，平均年龄45.5岁(28～70岁)。

[0082] 2、试验结果

[0083] H&E和Masson染色结果显示，NAFLD/NASH患者肝组织中胶原沉积明显增加、气球样变性和炎性细胞浸润存在，而在HC组肝组织未见到类似表现(图1A)。

[0084] 免疫组织化学分析结果显示，CHCHD2在HC组中呈低水平表达，而在NAFLD/NASH患者肝组织中表达水平升高，且随着肝纤维化程度加重其表达量有明显增加趋势(图1B‑D)。数据分析显示，NAFLD S3‑4组与HC、S0、S3‑4组之间均存在显著统计学差异。上述结果提示，CHCHD2的表达可能参与了NAFLD中肝纤维化的发生和发展。

[0085] 二、CHCHD2在NASH小鼠肝脏中高表达

[0086] 1、试验材料与方法

[0087] 以野生型C57BL/6雄鼠为试验材料，参照文献“Hepatocyte‑specific IL11cis‑signaling drives lipotoxicity and underlies the transition from NAFLD to NASH(DOI:10.1038/s41467‑020‑20303‑z)”中的方法用MCD饮食联合高脂饮食(MCD/HFD)喂养小鼠4周诱导NASH，得到MCD/HFD诱导NASH小鼠模型。

[0088] 以野生型C57BL/6雄鼠为试验材料，参照文献“Hepatocyte TAZ/WWTR1 Promotes Inflammation and Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis(DOI:10.1016/j.cmet.2016.09.016)”中的方法，用高果糖高软脂酸高胆固醇(FPC)饮食喂养小鼠24周诱导NASH，得到FPC诱导NASH小鼠模型。

[0089] 检测NASH小鼠模型肝脏及肝脏核蛋白、胞浆蛋白和线粒体蛋白中CHCHD2表达水平。同时以正常饮食(ND)喂养4周的野生型小鼠作为正常对照组。

[0090] 2、试验结果

[0091] 与正常对照相比，NASH小鼠肝脏中CHCHD2的总蛋白水平显著增加(图2A‑C)，但mRNA水平没有变化(图2D)。由于CHCHD2是线粒体和细胞核双定位蛋白。分离了肝脏的核蛋白和胞浆蛋白，发现CHCHD2的表达均增加(图2E‑F)；进一步提取肝脏中的线粒体蛋白，发现线粒体中CHCHD2表达显著增加(图2G‑H)。在高果糖高软脂酸高胆固醇(FPC)饮食喂养24周的NASH小鼠肝脏中同样发现CHCHD2的蛋白表达上调(图3)。

[0092] 以上研究表明，NASH小鼠肝脏中CHCHD2蛋白表达增加。

[0093] 实施例2、CHCHD2敲除改善NASH相关的肝纤维化

[0094] 一、CHCHD2敲除小鼠的构建

[0095] 为了研究CHCHD2在NASH中的作用，构建CHCHD2敲除小鼠。具体步骤如下：

[0096] 1、T7 Chchd2 sgRNA表达质粒的构建

[0097] 根据CHCHD2基因第一个至第三外显子碱基序列，设计针对CHCHD2基因的sgRNA(single guide RNA)，构建sgRNA表达质粒。具体步骤如下：

[0098] 1)设计sgRNA

[0099] 根据脱靶概率和切割效率选择sgRNA。在第一个编码区内设计2条sgRNA，优先使用脱靶评分和切割效率评分较高的sgRNA，分别命名为usgRNA1和usgRNA2；在第三个内含子设计2条sgRNA，优先使用脱靶评分和切割效率评分较高的sgRNA，分别命名为dsgRNA1和dsgRNA2。sgRNA序列信息见表1。

[0100] 表1、sgRNA序列信息

[0101] sgRNA名称 序列(5’‑3’)Chchd2 usgRNA1 ACCTGGCCGGAGGAGTCACCCGG
Chchd2 usgRNA2 CGAGGGTCTCACCTGGCCGGAGG
Chchd2 dsgRNA1 CACTACAGCATGAGGGCCTAAGG
Chchd2 dsgRNA2 GGGAGGGCGGTGAGGTATTTAGG

[0102] 2)设计引物

[0103] 设计的引物序列如表2所示。其中，上游引物从5’至3’依次为：T7 RNA聚合酶启动子、sgRNA序列以及与sgRNA vector模板结合的序列。

[0104] 表2、sgRNA PCR扩增的引物序列

[0105]

[0106]

[0107] 3)退火

[0108] 合成步骤2)设计的引物序列，并将上下游引物序列分别稀释至浓度为100μmol/L后，分别按以下体系进行程序性退火：T7 sgRNA F(100μmol/L)10μL、T7 sgRNA R(100μmol/L)10μL、NEB酶切buffer2 5μL、水25μL，分别得到退火产物。

[0109] 4)酶切质粒载体

[0110] 将T7 sgRNA质粒载体(该质粒载体记载于文献“genome engineering using the crispr‑cas9 system”中)用BsaI内切酶37℃酶切后，用DNA纯化回收试剂盒进行回收，用水洗脱后，将浓度稀释至100ng/μL，得到酶切后的T7 sgRNA载体。

[0111] 5)连接

[0112] 向0.5μL步骤4)获得的酶切后的T7 sgRNA载体(100ng/μL)中加入1μL步骤3)获得的退火产物、1μL T4 DNA Ligase、1μL T4 DNA Ligase Buffer(10×)、6.5μL水，16℃连接3h，分别得到连接产物。

[0113] 6)测序鉴定

[0114] 将步骤5)获得的连接产物转化、涂平板，37℃培养10‑12小时后挑取单菌落，用M13F‑47测序，每个菌板上挑2个单菌落即可。将测序结果与设计的序列进行比对，连接正确的即可进行中提，分别得到T7 Chchd2 sgRNA表达质粒。

[0115] 2、sgRNA和Cas9 mRNA的制备

[0116] 分别以步骤1中制备的T7 Chchd2 sgRNA表达质粒为模板，利用T7 RNA聚合酶进行体外转录，得到sgRNA，共如下四种：usgRNA1、usgRNA2、dsgRNA1和dsgRNA2。

[0117] 以cas9质粒载体(该质粒载体记载于文献“genome engineering using the crispr‑cas9 system”中)为模板，利用T7 RNA聚合酶进行体外转录，得到Cas9 mRNA。

[0118] 3、显微注射

[0119] 参照文献《小鼠胚胎操作实验手册》(第三版)中的方法将Cas9 mRNA、usgRNA1和dsgRNA2(Cas9 mRNA、usgRNA1和dsgRNA2的质量比为2:1:1)对野生型C57BL/6小鼠的受精卵进行显微注射，然后进行胚胎移植，移植后20天，小鼠产仔，得到F0代小鼠。

[0120] 4、CHCHD2敲除小鼠品系的建立

[0121] 1)F0代小鼠的基因型鉴定

[0122] 测序检测F0代小鼠CHCHD2基因的突变情况，得到F0代CHCHD2+/‑小鼠(杂合)。

[0123] 2)F1代小鼠的获得

[0124] 将F0代CHCHD2+/‑雄鼠和野生型C57BL/6雌鼠进行交配，获得F1代CHCHD2+/‑小鼠(杂合)，并对其CHCHD2基因进行测序检测。

[0125] 和野生型C57BL/6小鼠相比，F1代CHCHD2+/‑小鼠两条同源染色体中的一条同源染色体上的CHCHD2基因发生了大小为14bp的片段插入和大小为5271bp的片段缺失，片段插入的位置位于序列3第253位和第254位之间，插入的片段序列具体如下：TGAGGTATTTAGGA；该缺失片段位于序列2第254‑5524位。

[0126] 3)CHCHD2敲除小鼠的获得及鉴定

[0127] 将CHCHD2+/‑雌鼠和CHCHD2+/‑雄鼠进行交配，获得同窝出生的野生型小鼠和CHCHD2敲除小鼠(纯合)。

[0128] western blot检测CHCHD2敲除小鼠和野生型对照小鼠肝脏中的CHCHD2蛋白表达水平，以及检测CHCHD2敲除小鼠和野生型对照小鼠肝脏组织学形态，体重，肝脏、附睾脂肪和腹股沟脂肪组织重量。

[0129] 结果显示：CHCHD2敲除小鼠中的CHCHD2基因被成功敲除(图4A)。CHCHD2敲除对小鼠肝脏组织学形态(图4B)以及小鼠体重、肝重、附睾脂肪和腹股沟脂肪重量均无影响(图4C‑D)，且CHCHD2敲除小鼠精神状态正常。

[0130] 二、CHCHD2敲除对MCD/HFD饮食诱导的肝脏脂质沉积、炎症和纤维化的影响[0131] 将10周龄野生型对照小鼠和CHCHD2敲除小鼠喂养MCD/HFD饮食4周诱导NASH，检测并分析CHCHD2敲除对MCD/HFD饮食诱导的肝脏脂质沉积、炎症和纤维化的影响。

[0132] 结果显示：CHCHD2敲除NASH小鼠中的CHCHD2基因被成功敲除(图5A)。与对照小鼠相比，CHCHD2敲除对血浆ALT、AST水平没有影响(图5B)；对肝脏脂质沉积、炎症也无明显影响(图5C‑D)。但天狼星红染色显示肝脏纤维化得到改善(图5E)。肝脏纤维化多个标记物表达水平显著下调，包括Des、Col1a1、Col3a1、TIMP1(图5F)。

[0133] 以上结果表明：CHCHD2敲除可改善NASH所致肝纤维化。

[0134] 实施例3、肝细胞特异性过表达CHCHD2促进肝脏纤维化

[0135] 一、过表达CHCHD2小鼠的构建

[0136] 1、过表达CHCHD2腺相关病毒的构建

[0137] 构建TBG启动子过表达CHCHD2(带flag标签)的腺相关病毒，具体步骤如下：将序列4所示的CHCHD2基因片段(NM_016139.4)克隆至GV625载体(上海吉凯基因医学科技股份有限公司，货号为AAV8CON308，载体中主要元件顺序如下：TBGp‑MCS‑3Flag‑SV40 PolyA)中，得到重组表达载体GV625‑CHCHD2。然后将重组表达载体GV625‑CHCHD2与pHelper载体(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)和pAAV‑RC载体(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)共同转染进AAV‑293细胞进行包装，然后收获病毒并离心、超滤纯化，得到过表达CHCHD2腺相关病毒(AAV‑CHCHD2，简称AAV‑D2)。

[0138] 按照上述方法，将重组表达载体GV625‑CHCHD2替换为空载体GV625，得到阴性对照病毒(AAV‑Ctrl)。

[0139] 2、注射小鼠

[0140] 将步骤1构建的腺相关病毒以每只小鼠1.0×1011v.g的剂量通过尾静脉注射。注射2周后，通过检测肝脏、胰腺、附睾脂肪以及腹股沟脂肪组织中的flag表达水平以显示外源性CHCHD2的表达水平。

[0141] 结果表明：只有肝脏中过表达了CHCHD2(图6)。

[0142] 二、过表达CHCHD2对MCD/HFD饮食诱导NASH小鼠肝脏脂质沉积、炎症和纤维化的影响

[0143] 将野生型C57BL/6小鼠注射AAV‑CHCHD2和AAV‑Ctrl，按照1.0×1011v.g/每只小鼠的剂量通过尾静脉注射，于病毒注射后10天开始给予正常饮食或MCD/HFD饮食喂养4周，检测并分析CHCHD2过表达对MCD/HFD饮食诱导的肝脏脂质沉积、炎症和纤维化的影响。

[0144] 结果表明：在正常饮食喂养下，血浆ALT、AST水平，体重、肝脏重量、肝脏脂质含量以及巨噬细胞浸润情况均无变化(图7A‑D)。但天狼星红染色显示，CHCHD2过表达增加了肝脏中的胶原沉积(图7E)，并且肝脏纤维化标记物Col3a1和TIMP1表达显著增加(图7F)，表明在正常饮食时，CHCHD2过表达即可以导致肝脏胶原沉积增加。

[0145] 在MCD/HFD喂养小鼠下，CHCHD2过表达同样对血浆ALT、AST水平(图8A‑B)；体重、肝脏重量(图8C)；肝脏脂质沉积和巨噬细胞浸润没有显著影响(图8D)。但天狼星红染色显示肝脏纤维化显著加重(图8E)，并且也增加了肝脏纤维化标记物Col3a1、TIMP1、Col1a1以及CTGF的表达(图8F)。

[0146] 以上研究表明，CHCHD2表达增加可导致正常饮食喂养小鼠肝脏胶原沉积增加且在NASH发生时CHCHD2表达增加可促进肝纤维化。

[0147] 实施例4、CHCHD2敲除显著改善了硫代乙酰胺诱导的肝脏纤维化

[0148] 一、TAA诱导肝纤维化后对小鼠肝脏中CHCHD2蛋白表达水平的影响

[0149] 以野生型C57BL/6雄鼠为试验材料，参照文献“Tissue Transglutaminase Does Not Affect Fibrotic Matrix Stability or Regression of Liver Fibrosis in Mice(DOI:10.1053/j.gastro.2011.01.040)”中的方法用腹腔注射硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)的方式构建化学因素导致肝损伤进而引发肝纤维化的小鼠模型。同时以注射生理盐水为对照。western blot检测TAA小鼠模型和对照小鼠肝脏中CHCHD2的蛋白表达水平。

[0150] 结果表明：与对照小鼠相比，TAA小鼠模型肝脏中CHCHD2蛋白表达水平显著提高(图9A)。

[0151] 二、CHCHD2敲除对TAA诱导的肝纤维化的影响

[0152] 分别以野生型C57BL/6雄鼠和CHCHD2敲除小鼠为试验材料，参照文献“Tissue Transglutaminase Does Not Affect Fibrotic Matrix Stability or Regression of Liver Fibrosis in Mice(DOI:10.1053/j.gastro.2011.01.040)”中的方法用腹腔注射硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)的方式构建化学因素导致肝损伤进而引发肝纤维化的小鼠模型。检测并分析CHCHD2敲除对TAA诱导的肝脏纤维化的影响。

[0153] 结果表明：TAA腹腔注射7周后，与对照小鼠相比，CHCHD2敲除小鼠显著改善了TAA诱导的肝纤维化(图9B)。肝纤维化的标记物Des、Col1a1、Col3a1、TIMP1和TGFβ表达水平均降低(图9C)。

[0154] 以上结果表明：CHCHD2敲除可改善肝损伤所致肝纤维化。

[0155] 实施例5、CHCHD2可增加肝细胞中osteopontin(OPN)的表达

[0156] 肝细胞中OPN分泌增加可通过旁分泌的方式激活肝星形细胞，是肝脏纤维化发生发展的关键环节，文献“Hepatocyte Notch activation induces liver fibrosis in nonalcoholic steatohepatitis”(doi:10.1126/scitranslmed.aat0344.)研究表明：肝细胞中OPN表达增加可促进肝纤维化。为了研究CHCHD2过表达促进肝纤维化的机制，分别检测过表达CHCHD2的原代肝细胞和过表达CHCHD2的小鼠肝脏中的OPN表达水平。具体步骤如下：

[0157] 一、过表达CHCHD2的原代肝细胞中的OPN表达水平

[0158] 1、过表达CHCHD2腺病毒的构建

[0159] 具体步骤如下：

[0160] 将序列4所示的CHCHD2基因片段(NM_016139.4)克隆至GV138载体(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)，载体中主要元件顺序如下：CMV‑MCS‑3FLAG，得到重组表达质粒GV138‑CHCHD2。将重组表达质粒与腺病毒包装辅助质粒(PBHG)(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)共转染HEK293细胞进行包装。然后对腺病毒进行扩增和纯化，得到过表达CHCHD2腺病毒。

[0161] 2、过表达CHCHD2的原代肝细胞的制备

[0162] 1)用胶原酶灌注的方法制备小鼠原代肝细胞。具体步骤如下：麻醉5‑6周龄的雄性小鼠，经下腔静脉依次用肝素钠、灌流液Ⅰ(Kreb溶液+0.1mM EGTA)、灌流液Ⅱ(Kreb溶液+2.74mM CaCl2+0.05％胶原酶Ⅰ)灌注肝脏，灌注后的肝脏用预冷的1640培养基冲洗以过滤网(直径为38微米)，收集肝细胞并在含10％血清的1640培养基中培养。

[0163] 2)4‑6小时后换液，加入感染复数为10的CHCHD2腺病毒感染步骤1)制备的原代肝细胞。6小时后换掉带病毒的培养基，42小时后western blot检测过表达CHCHD2的原代肝细胞中的OPN蛋白表达水平。同时以阴性对照病毒(AAV‑Ctrl)作为对照。

[0164] 结果表明：与对照相比，过表达CHCHD2的原代肝细胞中的OPN蛋白表达水平显著增加(图10A)。

[0165] 二、过表达CHCHD2的小鼠肝脏中的OPN表达水平

[0166] 过表达CHCHD2小鼠的构建参照实施例3的步骤一。western blot检测过表达CHCHD2小鼠肝脏中的OPN蛋白表达水平。同时尾静脉注射阴性对照病毒(AAV‑Ctrl)的小鼠作为对照。

[0167] 结果表明：与对照相比，过表达CHCHD2的小鼠肝脏中的OPN表达水平也显著增加(图10B)。

[0168] 以上结果表明：CHCHD2表达上调可通过促进肝细胞分泌OPN进而促进肝纤维化。

[0169] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。