氟苯尼考及氟苯尼考胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用

摘要

本发明提供一种氟苯尼考及氟苯尼考胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。所述氟苯尼考及氟苯尼考胺半抗原的结构如式(I)所示：本发明利用计算机分子模拟技术获得FF和FFA的最优抗原决定簇团模型，明确了抗原的公共识别表位，通过虚拟筛选从构建的数据库中预测能产生较强免疫效果的半抗原。通过免疫原合成和动物免疫过程，实现了FF和FFA广谱单克隆抗体的制备，该方法具有较强的预测能力，并有节约时间和资金的优点。

权利要求

1.氟苯尼考及氟苯尼考胺的半抗原，其特征在于，其结构如式(I)所示：

2.权利要求1中式(I)所示半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、以2‑5mL的THF为溶剂，加入100‑200mg 5‑羟基‑2‑硝基苯甲醛，搅拌溶解，冰浴条件下加入28.7‑57.4mg NaH，再加入175‑350mg 4‑溴丁酸乙酯，搅拌，待反应完全后，将反应液缓慢滴入冰水中，加水和乙酸乙酯，萃取，旋干乙酸乙酯得到干燥的黄色固体；

S2、将步骤S1的产物加入2mL甲醇中，加入1mol/L的氢氧化钠水溶液20‑50μL，60±1℃反应2h后倒入水中，加盐酸调节至中性，析出固体后抽滤并干燥；

S3、以甲醇10‑20mL为溶剂，加入120±0.5mg步骤S2的产物、100mg氟苯尼考胺，回流反应3h，随后倒入水中，抽滤后真空干燥即得。

3.氟苯尼考及氟苯尼考胺的人工抗原，其特征在于，由权利要求1中所述半抗原与载体蛋白偶联后得到；其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

4.根据权利要求3所述的人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。

5.权利要求3或4所述人工抗原的制备方法，其特征在于，采用碳二亚胺法将载体蛋白偶联于权利要求1中所述半抗原的羧基端。

6.权利要求1所述半抗原或权利要求3或4所述人工抗原的以下任一应用：(1)用于制备抗氟苯尼考及氟苯尼考胺特异性抗体；

(2)用于检测抗氟苯尼考及氟苯尼考胺特异性抗体；

(3)用于制备氟苯尼考及氟苯尼考胺检测试剂。

7.由权利要求3或4所述人工抗原制备的特异性抗体，其特征在于，包括多克隆抗体和单克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的特异性抗体，其特征在于，所述特异性抗体为单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No.23867的小鼠杂交瘤细胞株FF‑A#分泌产生。

9.由权利要求7或8所述特异性抗体制备的氟苯尼考及氟苯尼考胺检测试剂或试剂盒。

10.权利要求7或8所述特异性抗体的以下任一应用：(i)用于氟苯尼考及氟苯尼考胺检测；

(ii)用于制备氟苯尼考及氟苯尼考胺的免疫层析试纸条；

(iii)用于制备氟苯尼考及氟苯尼考胺检测试纸或试剂盒。

说明书

氟苯尼考及氟苯尼考胺半抗原和人工抗原及其制备方法与

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及抗生素检测技术领域，具体地说，涉及氟苯尼考及氟苯尼考胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] FF(Florfenicol，FF)，又名氟甲砜霉素，是一种兽医专用氯霉素类广谱抗菌药，被广泛用于畜禽和水产养殖中。FF在体内具有较长消除半衰期，容易在体内蓄积，在体内代谢为FFA(Florfenicol amine，FFA)；此外，繁殖试验表明，FF具有一定的胚胎毒性，因此临床上的滥用及不合理使用，易造成动物源性食品中的药物残留，严重威胁消费者健康安全。欧盟、美国及中国已制定了FF在动物源性食品中的最大残留限量为100‑2500μg/kg，产蛋期和泌乳期畜禽禁用，残留标示物为FF和FFA残留量总和。因此，加强动物源性食品中FF和FFA的残留监测十分必要。

[0003] 免疫分析方法是一种基于抗原与抗体特异性反应的定性定量分析方法，该方法特异性强、灵敏度高，反应快速，操作简单，适合现场大量样本的实时检测。抗体是免疫分析方法中的核心试剂，而半抗原的设计对抗体的特异性及亲和力等性能起到关键性作用，因此设计高质量FF半抗原，开发高亲和力且广谱识别FF和FFA的抗体，对实现FF药物残留的快速检测十分重要。

[0004] 传统半抗原设计多采用“试错法”，在靶标物的活性基团位点上引入间隔臂从而实现半抗原改造。该方法仅关注到小分子的二维结构，而增加了间隔臂的半抗原在三维构象、电荷分布方面与靶标物相比可能存在较大差异，从而导致制备的抗体性能不佳，因此该方法具有一定的经验性、随机性和盲目性。分子模拟技术是利用计算机以原子水平的分子模型来模拟分子的结构与行为，已被成功应用于生命科学的多个领域，包括药物设计，生物科学，材料学等领域。目前，国内基于抗原决定簇团进行FF和FFA通用性半抗原设计的研究尚无报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供氟苯尼考及氟苯尼考胺半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。

[0006] 本发明利用分子模拟技术获得FF和FFA抗原决定簇团来筛选半抗原的方法。首先利用Discovery Studio软件中的Powell能量梯度法计算，优化了FF和FF胺的空间结构，获得其三维构象。然后利用HipHop算法生成两个化合物的抗原决定簇团模型。通过虚拟筛选技术从Compound Database数据库中筛选出候选化合物；最后通过比较候选化合物与两个靶标化合物的空间构象、电荷分布以及理化性质获得最佳半抗原用于抗体制备。该方法具有较强的预测能力，大大降低合成时间和成本。

[0007] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种氟苯尼考及氟苯尼考胺半抗原，其结构如式(I)所示：

[0008]

[0009] 第二方面，本发明提供式(I)所示半抗原的制备方法，包括如下步骤：

[0010] S1、以2‑5mL的THF为溶剂，加入100‑200mg 5‑羟基‑2‑硝基苯甲醛，搅拌溶解，冰浴条件下加入28.7‑57.4mg NaH，再加入175‑350mg 4‑溴丁酸乙酯，搅拌，待反应完全后，将反应液缓慢滴入冰水中，加水和乙酸乙酯，萃取，旋干乙酸乙酯得到干燥的黄色固体；

[0011] S2、将步骤S1的产物加入2mL甲醇中，加入1mol/L的氢氧化钠水溶液20‑50μL，60±1℃反应2h左右后倒入水中，加盐酸调节至中性，析出固体后抽滤并干燥；

[0012] S3、以甲醇10‑20mL为溶剂，加入120±0.5mg步骤S2的产物、100mg氟苯尼考胺，回流反应3h，随后倒入水中，抽滤后真空干燥即得。

[0013] 第三方面，本发明提供一种氟苯尼考及氟苯尼考胺人工抗原，由式(I)所示半抗原与载体蛋白偶联后得到；其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白，优选钥孔血蓝蛋白。

[0014] 第四方面，本发明提供所述人工抗原的制备方法，采用碳二亚胺法将载体蛋白偶联于所述半抗原的羧基端。

[0015] 第五方面，本发明提供所述半抗原或所述人工抗原的以下任一应用：

[0016] (1)用于制备抗氟苯尼考及氟苯尼考胺特异性抗体；

[0017] (2)用于检测抗氟苯尼考及氟苯尼考胺特异性抗体；

[0018] (3)用于制备氟苯尼考及氟苯尼考胺检测试剂。

[0019] 第六方面，本发明提供由所述人工抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。

[0020] 第七方面，本发明提供一种氟苯尼考及氟苯尼考胺单克隆抗体(抗体A)，由保藏编号为CGMCC No.23867的小鼠杂交瘤细胞株FF‑A#分泌产生。该杂交瘤细胞株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2021 年11月12日。

[0021] 第八方面，本发明提供由所述特异性抗体制备的氟苯尼考及氟苯尼考胺检测试剂或试剂盒。

[0022] 第九方面，本发明提供所述特异性抗体的以下任一应用：

[0023] (i)用于氟苯尼考及氟苯尼考胺检测；

[0024] (ii)用于制备氟苯尼考及氟苯尼考胺的免疫层析试纸条；

[0025] (iii)用于制备氟苯尼考及氟苯尼考胺检测试纸或试剂盒。

[0026] 第十方面，本发明提供式(I)所示化合物在作为氟苯尼考及氟苯尼考胺半抗原中的应用。

[0027] 进一步地，本发明的目的是采用以下的技术方案来实现的：

[0028] 免疫半抗原的化学结构决定着抗体的识别特性。本发明基于抗原决定簇团筛选半抗原的方法，用于氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺广谱单克隆抗体的制备。本发明首先采用Powell能量梯度法计算、优化了氟苯尼考和氟苯尼考胺的空间结构，获得其三维构象。然后基于分子共同特征药效团(HipHop)算法构建了氟苯尼考和氟苯尼考胺胺的抗原决定簇团(epitopephore)模型，明确了两个化合物的抗原表位。依据最佳的抗原决定簇团模型，从Compound database(14408mol)数据库中筛选出8632 个hits，以Fitvalue值排名前50的Hits作为分析对象，通过观察分子构象及原子组成从 50个Hits中选出结构相似度较高的5个化合物作为候选半抗原。最后基于M06‑2X密度泛函理论和TZVP基组对化合物分子进行几何优化，从输出文件中提取出候选半抗原的电荷参数和理化参数。通过比较靶标化合物与候选半抗原的空间结构、电荷分布以及理化性质，筛选出了FFA‑NP‑BBA新型半抗原。采用碳二亚胺法(EDC)将两个半抗原偶联载体蛋白合成人工抗原免疫实验动物，通过血清筛选，细胞融合及腹水诱生步骤，制备出了氟苯尼考和氟苯尼考胺的高亲和力、广谱性单克隆抗体。从而证明了该方法具有很强的预测能力，为快速、廉价、灵敏、简便的氟苯尼考及氟苯尼考胺检测方法的建立奠定基础，并为今后免疫学的分析研究提供新思路。

[0029] 进一步地，本发明提供一种FF半抗原的设计方法，根据FF和FFA的公共分子结构筛选半抗原，利用Chem Draw软件绘制FF和FFA的化学结构，保存格式为.mol。FF 和FFA的2D结构如下：

[0030]

[0031] 进一步地，利用Discovery Studio2019中Small Molecules模块下的Prepare Ligands 和Full Minimization工具对化合物进行处理，添加CHARMm力场，构建FF和FFA能量最小化的三维结构。

[0032] 进一步地，以FF和FFA为训练集，定义两个分子的Principal和MaxOmitFeat属性分别为2和1，利用Pharmacophore模块下的Feature Mapping工具构建出可能的药效团特征元素，然后利用Common Feature Pharmacophore Generation工具产生抗原决定簇团模型。依据FF和FFA的公共结构分子叠合情况以及药效团模型的FitValue值选择候选3D抗原决定簇团模型。优选地，以FitValue值最高的模型作为候选3D抗原决定簇团模型，其结构如图9所示。

[0033] 进一步地，为了制备FF和FFA广谱单克隆抗体，基于“最大公约数原则”暴露目标物的公共结构，并考虑到半抗原结构中间隔臂的引入等因素会降低其与药效团特征元素的匹配率，本发明在式2的基础上只保留1个芳香环中心，1个氢键构体特征和 1个氢键供体特征，其模型结构如图10所示，以该模型作为最佳3D药效团模型用于虚拟筛选。

[0034] 进一步地，根据所述最佳3D抗原决定簇团模型，利用Pharmacophore模块下的 Search，Screen and Profile工具分别对Compound database(14408mol)小分子化合物数据库进行虚拟筛选。在计算结果的表格浏览器中，FitValue值可以评价小分子与药效团的匹配情况，FitValue值越高，代表小分子与抗原决定簇团的匹配度越好。优选地，从每个数据库的筛选结果中选出FitValue值排名前50的小分子作为分析对象。

[0035] 进一步地，通过观察分子构象及原子组成选择FitValue值较高且结构叠合度较高的5个化合物作为候选半抗原。

[0036] 进一步地，基于M06‑2X密度泛函理论和TZVP基组对上述5个化合物分子进行几何优化，从输出文件中提取出候选半抗原的电荷参数和理化参数。通过比较靶标化合物与候选半抗原的空间结构、电荷分布以及理化性质，筛选出一个新型半抗原 FFA‑NP‑BBA，结构如式(I)所示。

[0037] 进一步地，由小分子化合物FFA‑NP‑BBA作为半抗原合成免疫原。优选地，选用钥孔血蓝蛋白(KLH)作为载体蛋白，采用碳二亚胺法(EDC)合成人工抗原。

[0038] 进一步地，由FFA作为半抗原合成包被原，优选地，选用鸡卵清白蛋白(OVA) 作为载体蛋白，采用戊二醛法(GLU)合成人工抗原。

[0039] 进一步地，由上述免疫原免疫实验动物制备FF和FFA抗体，优选地，实验动物为 Balb/c雌性小鼠，所制备的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体。

[0040] 进一步地，所述抗体采用间接竞争酶联免疫吸附法进行测定。

[0041] 进一步地，本发明提供所述半抗原、所述人工抗原或所述抗体的以下任一应用：

[0042] (1)在小分子靶标新型半抗原设计中的应用；

[0043] (2)在检测FF及FFA中的应用；

[0044] (3)在制备FF及FFA检测试剂盒中的应用；

[0045] (4)在制备FF及FFA免疫层析试纸条中的应用。

[0046] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

[0047] 本发明利用计算机分子模拟技术获得FF和FFA的最优抗原决定簇团模型，明确了抗原的公共识别表位，通过虚拟筛选从构建的Compound database(14408mol)数据库中预测能产生较强免疫效果的半抗原。通过免疫原合成和动物免疫过程，实现了 FF和FFA广谱性抗体的制备，该方法具有较强的预测能力，并有节约时间和资金的优点。

[0048] 利用本发明提供的半抗原与载体蛋白的偶联物制备FF和FFA抗体，制备过程简单、经济，抗体对FF和FFA的检测灵敏度分别为2.4ng/mL和5.5ng/mL，在FF和FFA 残留检测中具有良好的应用前景。

附图说明

[0049] 图1为本发明较佳实施例中基于抗原决定簇团的FF及FFA半抗原设计流程图。

[0050] 图2为本发明较佳实施例中FF和FFA的三维构象图。

[0051] 图3为本发明较佳实施例中HipHop产生的FF和FFA的最佳抗原决定簇团模型。

[0052] 图4为本发明较佳实施例中Fitvalue值排名前50的候选化合物与抗原决定簇团模型的叠合图。

[0053] 图5为本发明较佳实施例中候选半抗原a～e(Hapten‑a～Hapten‑e)的结构及其与抗原决定簇团模型的叠合图。

[0054] 图6为本发明较佳实施例中候选半抗原与FF和FFA的部分原子电荷分布。

[0055] 图7为本发明较佳实施例中人工抗原FFA‑NP‑BBA‑KLH的UV‑vis光谱图。

[0056] 图8为本发明较佳实施例中单克隆抗体检测FF和FFA的标准曲线图。

[0057] 图9为本发明以FitValue值最高的模型作为候选3D抗原决定簇团模型的结构。

[0058] 图10为本发明最佳3D抗原决定簇团模型的结构。

具体实施方式

[0059] 本发明提供一种基于计算机分子模拟技术的FF及其代谢物FFA的半抗原设计及应用，借助计算机分子模拟技术构建FF和FFA的最低能量3D构象和抗原决定簇团模型，并从小分子化合物数据库中筛选半抗原结构。

[0060] 本发明一方面利用Discovery Studio软件，采用Powell能量梯度法获得FF和FFA的最低能量构象，并基于分子共同特征药效团(HipHop)算法构建出FF和FFA的抗原决定簇团模型，如式2所示，基于“最大公约数原则”暴露目标物的公共结构，并考虑到半抗原结构中间隔臂的引入会降低与药效团特征元素的匹配率，本发明在式2的基础上只保留1个芳香环中心，1个氢键构体特征和1个氢键供体特征作为最佳抗原决定簇团模型进行虚拟筛选，其模型结构如式3所示。

[0061] 本发明另一方面依据上述式3抗原决定簇团模型从Compound  database(14408mol) 小分子化合物数据库中筛选候选化合物。

[0062] 进一步地，选取FitValue值排名前50的化合物利用分子叠合技术与FF和FFA进行分子叠合，选取相似度排名前5的化合物作为候选半抗原用于构象、电荷分布及理化性质分析。

[0063] 进一步地，基于M06‑2X密度泛函理论和TZVP基组对FF和FFA以及候选半抗原进行几何优化，从计算结果中提取候选半抗原的电荷参数，包括最高占有轨道能量 (EHOMO)、最低空轨道能量(ELUMO)和原子电荷等；以及理化参数，包括能量(E)、偶极矩(μ)、范德华表面积(SA)、相对脂水分配系数(cLogP)以及溶剂可及表面积等(SASA)。通过比较靶标化合物与候选半抗原的上述参数，筛选出一个新型半抗原 FFA‑NP‑BBA。

[0064] 进一步地，本发明提供FF人工抗原的制备方法，采用EDC法将载体蛋白与所述FF 半抗原的羧基端偶联制得人工抗原。

[0065] 进一步地，本发明提供由所述FF人工抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体、单克隆抗体，优选单克隆抗体。所述单克隆抗体可由FF人工抗原免疫实验动物(如新西兰大白兔、小鼠等)后进行细胞融合所得。

[0066] 进一步地，本发明提供所述FF半抗原筛选方法的以下任一应用：

[0067] (1)在设计FF和FFA半抗原中的应用；

[0068] (2)在设计其他小分子化合物半抗原中的应用。

[0069] 第八方面，本发明提供所述FF人工抗原的以下任一应用：

[0070] (1)在制备抗FF及FFA特异性抗体中的应用；

[0071] (2)在检测抗FF及FFA特异性抗体中的应用。

[0072] 进一步地，本发明提供由所述特异性抗体制备的FF和FFA检测试剂或试剂盒。

[0073] 进一步地，本发明提供所述广谱性抗体的以下任一应用：

[0074] (1)在检测FF及FFA中的应用；

[0075] (2)在制备FF及FFA检测试剂盒中的应用；

[0076] (3)在制备FF及FFA免疫层析试纸条中的应用。

[0077] 此外，本发明还提供基于上述多克隆抗体所建立的快速、灵敏、特异的FF及FFA 酶联免疫分析方法。

[0078] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

[0079] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中所用的磷酸盐缓冲液(简称PBS)均为pH 7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液，所用碳酸盐缓冲液(简称CB)均为pH 9.6、0.05M的碳酸钠缓冲液。

[0080] 实施例1氟苯尼考及氟苯尼考胺半抗原的设计

[0081] 基于抗原决定簇团的FF及FFA半抗原设计流程见图1。

[0082] 一、抗原决定簇团模型的构建

[0083] 1、使用Chem draw软件中画出FF和FFA的分子结构式。利用Discovery Studio软件的Small Molecules模块下的Full Minimization工具对小分子化合物添加CHARMm 力场进行能量最小化，FF和FFA的最优三维结构见图2。

[0084] 2、以FF和FFA作为训练集分子，定义Principal和MaxOmitFeat属性分别为2和1，然后利用Feature Mapping工具选择要匹配的药效团特征元素，包括氢键受体 (Acceptor)、氢键供体(Donor)、疏水中心(Hydrophobe)、正离子中心(Ionizable Positive)及芳香环中心(Ring Aromatic)五种特征元素类型。

[0085] 3、利用HipHop算法下的Common Feature Pharmacophore Generation模块构建药效团模型，其中，Conformation Generation参数设置为Best，Maximum Conformation(构象上限数)设为200，能量阈值Energy Threshild设置为10后进行运算，结果共产生了 10个药效团模型，均包含1个芳香环中心，1个氢键构体特征，2个氢键供体特征和1 和疏水特征，每个药效团的详细信息见表1，其中药效团模型9的FitValue最高，其空间结构排布方式详见式2。

[0086] 表1 HipHop生成的10个药效团模型的详细参数

[0087]

[0088] 二、半抗原的虚拟筛选

[0089] 1、为获得广谱单克隆抗体，在上述获得的3D抗原决定簇团模型的基础上只保留 1个芳香环中心，1个氢键构体特征和1个氢键供体特征三个特征元素作为最佳抗原决定簇团模型，如图3所示，基于该抗原决定簇团模型进行虚拟筛选。利用Pharmacophore 模块下的Search，Screen and Profile工具分别Compound database(14408mol)小分子化合物数据库进行虚拟筛选，Search method栏中选择Best。结果显示，四个数据库中分别筛选出8632个符合抗原决定簇团模型的分子结构。FitValue栏目中的数值评价小分子与药效团的匹配情况，FitValue值越高，则小分子与特征元素的匹配度越好。优选地，从筛选结果中选择FitValue值较高的50个小分子作为候选化合物用于后续分析 (图4)。

[0090] 三、最佳半抗原的确定

[0091] 1、通过观察分子构象及原子组成从上述候选化合物中选择Fitvalue值以及结构相似度均比较高的5个化合物(Hapten‑a～Hapten‑e)进行作为候选半抗原，其叠合结果如图5所示。Hapten‑a～Hapten‑e的结构如下：

[0092]

[0093]

[0094] 2、基于M06‑2X密度泛函理论和TZVP基组对FF和FFA以及候选半抗原进行几何优化，从计算结果中提取候选半抗原的结构参数，包括键长、键角和二面角；电荷参数，包括最高占有轨道能量(EHOMO)、最低空轨道能量(ELUMO)和原子电荷(图6)等；以及理化参数(表2)，包括，能量(E)、偶极矩(μ)、范德华表面积(SA)、相对脂水分配系数(cLogP)以及溶剂可及表面积等(SASA)。通过比较靶标化合物与候选半抗原的上述参数，筛选出一个新型半抗原FFA‑NP‑BBA，其结构如式(I)所示：

[0095]

[0096] 式(I)所示半抗原的制备方法如下：

[0097] S1、以5mL的THF(四氢呋喃)为溶剂，加入200mg 5‑羟基‑2‑硝基苯甲醛，搅拌溶解，冰浴条件下加入NaH 57.4mg，再加入4‑溴丁酸乙酯350mg，搅拌，待反应完全后，将反应液缓慢滴入冰水中，加水和乙酸乙酯，萃取，旋干乙酸乙酯得到干燥的黄色固体；

[0098] S2、将步骤S1的产物加入2mL甲醇中，加入1mol/L的氢氧化钠水溶液23μL，60℃反应2h后倒入水中，加盐酸调节至中性，析出固体后抽滤并干燥；

[0099] S3、以10mL甲醇为溶剂，加入120mg步骤S2的产物、100mg氟苯尼考胺，回流反应3h，随后倒入水中，抽滤后真空干燥即得式(I)氟苯尼考半抗原。

[0100] 表2 FF、FFA以及候选半抗原的电性及理化参数

[0101]

[0102] 注：a代表R1‑C1之间的键长；b代表C5‑S8‑R2之间的键角；c代表R1‑C1‑C2‑C7之间的二面角。Hapten‑a～Hapten‑e的结构见图5。

[0103] 实施例2氟苯尼考及氟苯尼考胺人工抗原的制备

[0104] 1、免疫原的制备：以钥孔血蓝蛋白(KLH)为载体蛋白，采用碳二亚胺法合成免疫原：称取8.64mg FFA‑NP‑BBA溶于2mL DMF中，加入10.3mg EDC和6.2mg NHS，室温条件下磁力搅拌反应10h，得到溶液A。将20mg KLH溶于10mL PBS缓冲液中，得到溶液B。将A液逐滴加到B液中，室温搅拌，过夜反应，得到反应产物即为FF免疫原FFA‑NP‑BBA‑KLH，其UV‑vis光谱图见图7。将反应产物在PBS中透析72h，中间换6次水。透析后将反应产物分装于2mL离心管中，‑20℃保存备用。

[0105] 2、包被原的制备：以鸡卵清白蛋白(OVA)为载体蛋白，采用戊二醛法合成包被原。称取7.57mg FF和20mg OVA蛋白，溶于8mL CB溶液中，搅拌溶解，加入1.73 μL的甲醛溶液，过夜反应。将反应产物在PBS中透析72h，中间换6次水。透析后将反应产物分装于2mL离心管中，‑20℃保存备用。

[0106] 3、将上述合成的产物采用UV‑vis鉴定免疫原是否偶联成功。如/7所示，λmax(FFA‑NP‑BBA‑KLH)与λmax(KLH)相比发生了蓝移，与λmax(FFA‑NP‑BBA)相比发生了蓝移，表明免疫原合成成功。

[0107] 实施例3氟苯尼考及氟苯尼考胺单克隆抗体的制备

[0108] 1、动物免疫：首次免疫，取免疫原FFA‑NP‑BBA‑KLH与弗氏完全佐剂按照体积比1:1进行乳化，免疫8周龄Balb/c雌性小鼠各8只；间隔1个月后，免疫原与弗氏不完全佐剂按照体积比1:1乳化进行加强免疫，免疫3次后，小鼠眼静脉丛采血，采用间接竞争ELISA检查抗血清抑制水平。

[0109] 2、抗体制备：制备效价高抑制好的小鼠脾细胞悬液与sp2/0瘤细胞进行杂交瘤细胞融合，采用有限稀释法进行亚克隆，采用间接竞争ELISA法筛选细胞上清，最终获得单克隆细胞株。采用腹水诱生法制备单克隆抗体，免疫原FFA‑NP‑BBA‑KLH获得的单克隆抗体命名为抗体A(由保藏编号为CGMCC No.23867的小鼠杂交瘤细胞株 FF‑A#分泌产生)，保存于‑20℃备用。

[0110] 3、抗体灵敏度的测定

[0111] 采用间接竞争ELISA方法，对抗体A进行鉴定。具体操作步骤如下：

[0112] (a)包被：用CB液将FF包被原稀释系列浓度，每孔100μL加至酶标板，37℃孵育2h；

[0113] (b)洗涤：倾去孔内液体，用洗涤液洗3遍，甩干；

[0114] (c)封闭：每孔加入150μL封闭液，37℃孵育1h，将孔内液体甩干；

[0115] (d)加样：每孔加入50μL PBS稀释的系列浓度的FF或FFA标准品和50μL工作浓度的抗体，37℃孵育30min，洗涤；

[0116] (e)加二抗：每孔加入100μL HRP‑羊抗鼠IgG，37℃孵育30min，洗涤四次，甩干；

[0117] (f)显色：每孔加入100μL新鲜配制的TMB溶液，37℃避光显色15min；

[0118] (g)终止：每孔加入50μL浓度为2mol/L的H2SO4溶液终止反应；

[0119] (h)读数：用酶标仪读取各孔的OD450nm值；

[0120] (i)建立标准曲线：以FF或FFA标准品浓度的对数值为横坐标，以各个浓度对应的OD值为纵坐标，绘制标准抑制曲线，并计算IC50值。

[0121] 通过杂交瘤技术获得的单克隆抗体的鉴定结果如图8所示，由标准曲线计算得到单克隆抗体对FF和FFA的IC50分别为2.4ng/mL和5.5ng/mL。

[0122] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。