肝癌的标记物在制备肝癌检测产品中的用途及检测试剂盒转让专利
申请号 : CN202111582152.3
文献号 : CN114164275B
文献日 : 2022-12-09
发明人 : 张玮 , 周谛晗 , 李国强
申请人 : 武汉艾米森生命科技有限公司
摘要 :
本发明公开了肝癌的标记物在制备肝癌检测产品中的用途及检测试剂盒，涉及肝癌诊断技术领域。本发明提供了肝癌的标记物在制备肝癌检测产品中的新用途，该标记物为：GNB4基因CpG位点和Riplet基因CpG位点。GNB4基因和Riplet基因的组合构成的标志物具有协同增效，可以极大程度上提升肝癌的检测灵敏度和特异性。本发明为肝癌的无创诊断提供了一种新思路。
权利要求 :
1.核酸组合在制备肝癌检测产品中的用途，其特征在于，所述核酸组合包括：用于检测GNB4基因甲基化的第一核酸组合和用于检测Riplet基因甲基化的第二核酸组合；所述第一核酸组合包括引物对1和探针1，所述引物对1的碱基序列为SEQ ID NO.1‑2所示的碱基序列，所述探针1的碱基序列为SEQ ID NO.5所示的碱基序列；
所述第二核酸组合包括引物对2和探针2，所述引物对2的碱基序列为SEQ ID NO.3‑4所示的碱基序列；所述探针2的碱基序列为SEQ ID NO.6所示的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肝癌检测产品选自如下产品中的至少一种：试剂、试剂盒、芯片和测序文库。
3.一种肝癌检测的核酸组合，其特征在于，其包括用于检测GNB4基因甲基化的第一核酸组合和用于检测Riplet基因甲基化的第二核酸组合；
所述第一核酸组合包括引物对1和探针1，所述引物对1的碱基序列为SEQ ID NO.1‑2所示的碱基序列，所述探针1的碱基序列为SEQ ID NO.5所示的碱基序列；
所述第二核酸组合包括引物对2和探针2，所述引物对2的碱基序列为SEQ ID NO.3‑4所示的碱基序列；所述探针2的碱基序列为SEQ ID NO.6所示的碱基序列。
4.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求3所述的肝癌检测的核酸组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、内参基因的检测引物、内参基因的检测探针、DNA聚合酶和缓冲液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因为ACTB基因。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为血液样本；
所述血液样本选自血浆样本、或血清样本。
说明书 :
肝癌的标记物在制备肝癌检测产品中的用途及检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及肝癌诊断技术领域，具体而言，涉及肝癌的标记物在制备肝癌检测产品中的用途及检测试剂盒。
背景技术
[0002] 原发性肝癌是我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因。原发性肝癌主要包括肝细胞癌、肝内胆管癌和肝细胞癌‑肝内胆管癌混合型3种不同病理学类型，其中肝细胞
癌占85%～90%，其风险因素包括乙型/丙型肝炎病毒（HBV/HCV）感染、肥胖引起的非酒精性
脂肪肝疾病、慢性酒精滥用等，这些因素可能直接导致肝硬化的发展，肝硬化患者每年发生
肝癌的比率为2%‑4%。
癌占85%～90%，其风险因素包括乙型/丙型肝炎病毒（HBV/HCV）感染、肥胖引起的非酒精性
脂肪肝疾病、慢性酒精滥用等，这些因素可能直接导致肝硬化的发展，肝硬化患者每年发生
肝癌的比率为2%‑4%。
[0003] 由于肝细胞癌早期症状不明显，往往诊断时已经到达中晚期，失去了手术机会。早筛早诊早治是降低肝细胞癌发病率与死亡率的有效方法，方便、安全、快捷、高通量的筛查
方法尤为重要。
方法尤为重要。
[0004] AFP是目前唯一可用的检测和监测肝癌的血液标志物，当以20ng/ml为截断值时，AFP的敏感性只有约60%，特异性只有80%多，难以满足肝细胞癌早筛早诊的临床需求。而目
前已报道的肝细胞癌血液标记物很少，且检测准确性有待提高。如现有文献
CN201780053034.和Qiu X, Hu B, Huang Y, Deng Y, Wang X, Zheng F.
Hypermethylation of ACP1, BMP4, and TSPYL5 in Hepatocellular Carcinoma and
Their Potential Clinical Significance. Digestive diseases and sciences. 2016;
61:149‑57.公开了ACP1和TSPYL5的甲基化可用于肝细胞癌的检测，这两个基因的灵敏度在
60%‑85%之间。
前已报道的肝细胞癌血液标记物很少，且检测准确性有待提高。如现有文献
CN201780053034.和Qiu X, Hu B, Huang Y, Deng Y, Wang X, Zheng F.
Hypermethylation of ACP1, BMP4, and TSPYL5 in Hepatocellular Carcinoma and
Their Potential Clinical Significance. Digestive diseases and sciences. 2016;
61:149‑57.公开了ACP1和TSPYL5的甲基化可用于肝细胞癌的检测，这两个基因的灵敏度在
60%‑85%之间。
[0005] 鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供肝癌的标记物在制备肝癌检测产品中的用途及检测试剂盒以解决上述技术问题。
[0007] 本发明是这样实现的：
[0008] 本发明提供了肝癌的标记物在制备肝癌检测产品中的新用途，标记物为：GNB4基因CpG位点和Riplet基因CpG位点。
[0009] 发明人研究发现，单独的GNB4基因和Riplet基因在肝癌样本中的检测灵敏度均大于80%，特异性均大于90%；而将GNB4基因和Riplet基因组合进行检测，发现二者在肝癌样本
中的检测灵敏度达96%以上，特异性超出90%。GNB4基因和Riplet基因的组合后的肝癌检测
灵敏度和特异性均超出GNB4+ACP1组合、GNB4+TSPYL1组合、Riplet+ACP1组合、Riplet+
TSPYL1组合、ACP1+TSPYL1组合、Riplet+TSPYL1组合、Riplet+HOXA1组合、Riplet+BMP4组
合、ACP1+TSPYL1组合、ACP1+HOXA1组合、ACP1+BMP4组合、TSPYL1+HOXA1组合、TSPYL1+BMP4
组合和HOXA1+BMP4组合。GNB4基因和Riplet基因的组合具有协同增效，可以极大程度上提
升肝癌的检测灵敏度和特异性。
中的检测灵敏度达96%以上，特异性超出90%。GNB4基因和Riplet基因的组合后的肝癌检测
灵敏度和特异性均超出GNB4+ACP1组合、GNB4+TSPYL1组合、Riplet+ACP1组合、Riplet+
TSPYL1组合、ACP1+TSPYL1组合、Riplet+TSPYL1组合、Riplet+HOXA1组合、Riplet+BMP4组
合、ACP1+TSPYL1组合、ACP1+HOXA1组合、ACP1+BMP4组合、TSPYL1+HOXA1组合、TSPYL1+BMP4
组合和HOXA1+BMP4组合。GNB4基因和Riplet基因的组合具有协同增效，可以极大程度上提
升肝癌的检测灵敏度和特异性。
[0010] 上述肝癌包括肝细胞癌、肝内胆管癌和肝细胞癌‑肝内胆管癌混合型三种。上述标记物可以用于上述三种类型的原发性肝癌的早筛检测。
[0011] 上述组合能有效避免肝脏其他疾病的干扰导致的假阳性，具有很高的特异性。本发明为肝癌的无创诊断提供了一种新思路。
[0012] 在一种可选的实施方式中，上述标记物的甲基化水平既可以区分正常样本与原发性肝癌样本，也可以区分原发性肝癌和肝硬化。
[0013] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述肝癌检测产品选自如下产品中的至少一种：试剂、试剂盒、芯片和测序文库。
[0014] 试剂的形态包括不限于：液体、粉剂、颗粒剂、乳液、悬浮液。
[0015] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述GNB4基因CpG位点为位于如下至少一种CpG岛区域内至少包含一个CpG位点的核酸分子：区域1和区域2。
[0016] 其中，区域1选自Chr3:179450948‑179451805正链，区域2选自Chr3:179451805‑179450948负链。
[0017] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述Riplet基因CpG位点为位于如下至少一种CpG岛区域内至少包含一个CpG位点的核酸分子：区域3和区域4。
[0018] 其中，区域3选自Chr17:30971029‑30971588正链，区域4选自Chr17:30971588‑30971029负链。
[0019] 上述标记物的区域是以hg38基因组为参比基因组，发明人发现，肝癌组织、血液样本在上述区域的CpG位点存在高甲基化，通过检测这个区域的甲基化水平，即可判断该样本
是否为肝癌。
是否为肝癌。
[0020] 本发明还提供了一种肝癌检测的核酸组合，其包括用于检测GNB4基因甲基化的第一核酸组合和用于检测Riplet基因甲基化的第二核酸组合；
[0021] 第一核酸组合包括引物对1，引物对1的碱基序列与SEQ ID NO.1‑2所示的碱基序列具有至少90%（例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%、100%）的一致性；
[0022] 第二核酸组合包括引物对2，引物对2的碱基序列与SEQ ID NO.3‑4所示的碱基序列具有至少90%（例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%、100%）的一致性。
[0023] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一核酸组合还包括探针1，探针1的碱基序列与SEQ ID NO.5所示的碱基序列具有至少90%（例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、
96%、97%、98%、99%、100%）的一致性；
96%、97%、98%、99%、100%）的一致性；
[0024] 第二核酸组合还包括探针2，探针2的碱基序列与SEQ ID NO.6所示的碱基序列具有至少90%（例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%、100%）的一致性。
[0025] 上述核酸序列如下所示：
[0026] GNB4上游引物：TTGTGTCGCGTTTAGTTGTTACG，SEQ ID NO.1，GNB4下游引物：TACAAAACTTAAACCGCCGA，SEQ ID NO.2，GNB4探针：AATTGGTTTTACGATCGTCGGCGTA；SEQ ID
NO.5，Riplet上游引物：CTAGGACGATTTCGGTTGTATTATT，SEQ ID NO.3，Riplet下游引物：
CTCCCTAACGACAAATAAAACAAAC，SEQ ID NO.4，Riplet探针：TTGTTGGATTGGTTCGTTACGTTGT，
SEQ ID NO.6。
NO.5，Riplet上游引物：CTAGGACGATTTCGGTTGTATTATT，SEQ ID NO.3，Riplet下游引物：
CTCCCTAACGACAAATAAAACAAAC，SEQ ID NO.4，Riplet探针：TTGTTGGATTGGTTCGTTACGTTGT，
SEQ ID NO.6。
[0027] 在一种可选的实施方式中，在上述探针的5’端标记有荧光报告基团，在上述探针的3’端标记有荧光猝灭基团，通过荧光标记以便于更好的实现信号的放大，实现高灵敏度
地检测。一种实施方式中，上述探针为Taqman探针。
地检测。一种实施方式中，上述探针为Taqman探针。
[0028] 上述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。
[0029] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述甲基化水平通过如下至少一种的方法进行检测：甲基化特异性PCR法、测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异
性高分辨率溶解曲线法、甲基化特异性微阵列法、甲基化敏感性限制性内切酶法和flap
endonuclease 法。
性高分辨率溶解曲线法、甲基化特异性微阵列法、甲基化敏感性限制性内切酶法和flap
endonuclease 法。
[0030] 上述测序法选自亚硫酸氢盐测序法、全基因组甲基化测序法或焦磷酸测序法。
[0031] 上述flap endonuclease 法是一种依赖于酶切产生的瓣膜（Flap）序列的荧光定量PCR方法，通常包括三个反应，FEN1酶切产生Flap序列的反应、PCR反应、Flap 序列结合到
FRET cassette上产生荧光，具体参见文献US8361720B2和Allawi,et al., “Invader Plus
Method Detects Herpes Simplex Virus in Cerebrospinal Fluid and Simultaneously
Differentiates Types 1 and 2”, J Clin Microbiol., 2006,44:3443‑7。
FRET cassette上产生荧光，具体参见文献US8361720B2和Allawi,et al., “Invader Plus
Method Detects Herpes Simplex Virus in Cerebrospinal Fluid and Simultaneously
Differentiates Types 1 and 2”, J Clin Microbiol., 2006,44:3443‑7。
[0032] 本发明还提供了一种试剂盒，其包括上述的肝癌检测的核酸组合。
[0033] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、内参基因的检测引物、内参基因的检测探针、DNA聚合酶和缓冲液的一种或多种。
[0034] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述内参基因为ACTB基因。
[0035] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒的检测样本为血液样本；
[0036] 血液样本选自血浆样本、血清样本、全血样本或血细胞样本。
[0037] 术语“甲基化水平”与一般理解相同，指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念，又
代表定量的概念。举例来说，如果核酸序列内的胞嘧啶(C)残基为甲基化的，则可将其称为
“高甲基化的”或具有“增加的甲基化”在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标
比较DNA甲基化水平，如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较，在一些情况下，可
计算出样本中标记物的甲基化比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数）×
100，然后再进行比较，在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最
终的判定指标。
代表定量的概念。举例来说，如果核酸序列内的胞嘧啶(C)残基为甲基化的，则可将其称为
“高甲基化的”或具有“增加的甲基化”在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标
比较DNA甲基化水平，如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较，在一些情况下，可
计算出样本中标记物的甲基化比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数）×
100，然后再进行比较，在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最
终的判定指标。
[0038] 本发明具有以下有益效果：
[0039] 本发明为肝癌早筛提供了良好的标志物，GNB4基因和Riplet基因的组合构成的标志物具有协同增效，可以极大程度上提升肝癌的检测灵敏度和特异性。本发明具有早筛准
确度高、无创、方便、安全、快捷、高通量的优势。本发明提供的分子标志物有望提高我国原
发性肝癌高风险人群的早诊比例，实现早发现早治疗，降低原发性肝癌发病率与死亡率。
GNB4基因和Riplet基因的组合能有效避免肝脏其他疾病的干扰导致的假阳性，具有很高的
特异性。本发明为肝癌的无创诊断提供了一种新思路。
确度高、无创、方便、安全、快捷、高通量的优势。本发明提供的分子标志物有望提高我国原
发性肝癌高风险人群的早诊比例，实现早发现早治疗，降低原发性肝癌发病率与死亡率。
GNB4基因和Riplet基因的组合能有效避免肝脏其他疾病的干扰导致的假阳性，具有很高的
特异性。本发明为肝癌的无创诊断提供了一种新思路。
具体实施方式
[0040] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建
议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产
品。
议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产
品。
[0041] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0042] 实施例1
[0043] 本实施例提供了一种肝癌检测的核酸组合，其包括用于检测GNB4基因甲基化的第一核酸组合和用于检测Riplet基因甲基化的第二核酸组合；
[0044] 第一核酸组合包括引物对1（包括上游引物和下游引物）和探针1，引物对1的碱基序列如SEQ ID NO.1‑2所示；
[0045] 第二核酸组合包括引物对2和探针2，引物对2的碱基序列如SEQ ID NO.3‑4所示。
[0046] 探针1的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；探针2的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
[0047] 上述核酸序列如下所示：
[0048] GNB4上游引物：TTGTGTCGCGTTTAGTTGTTACG，SEQ ID NO.1；GNB4下游引物：TACAAAACTTAAACCGCCGA，SEQ ID NO.2；GNB4探针：AATTGGTTTTACGATCGTCGGCGTA；SEQ ID
NO.5；Riplet上游引物：CTAGGACGATTTCGGTTGTATTATT，SEQ ID NO.3；Riplet下游引物：
CTCCCTAACGACAAATAAAACAAAC，SEQ ID NO.4；Riplet探针：TTGTTGGATTGGTTCGTTACGTTGT，
SEQ ID NO.6。
NO.5；Riplet上游引物：CTAGGACGATTTCGGTTGTATTATT，SEQ ID NO.3；Riplet下游引物：
CTCCCTAACGACAAATAAAACAAAC，SEQ ID NO.4；Riplet探针：TTGTTGGATTGGTTCGTTACGTTGT，
SEQ ID NO.6。
[0049] 实施例2
[0050] 本实施例采用甲基化特异性PCR方法检测基因在血液样本中的甲基化水平，具体步骤包括：
[0051] （1）血液cfDNA的提取
[0052] 采用天根生化科技（北京）有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒（DP709）进行血浆cfDNA提取，所用血浆体积为1.5 mL，具体操作参见试剂盒说明书，提取完
成后，用50µL纯化水进行洗脱。
成后，用50µL纯化水进行洗脱。
[0053] （2）亚硫酸盐的转化
[0054] 将提取好的全部基因组进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂（鄂汉械备20200843），具体实验操作参见试剂盒说明书，
转化完成后，用30µL纯化水进行洗脱。
转化完成后，用30µL纯化水进行洗脱。
[0055] （3）甲基化特异性PCR反应
[0056] 将亚硫酸氢盐转化后的DNA进行甲基化特异性PCR反应以检测目的基因GNB4、Riplet、ACP1、TSPYL5、HOXA1和BMP4基因在组织样本和血液样本中的甲基化水平，每个基因
单独进行检测，即一个PCR管中每次只加入一个基因的检测引物和探针，同时加入内参基因
ACTB的检测探针。各个基因的上下游引物及探针序列如表1所示。
单独进行检测，即一个PCR管中每次只加入一个基因的检测引物和探针，同时加入内参基因
ACTB的检测探针。各个基因的上下游引物及探针序列如表1所示。
[0057] 表1 各目的基因引物探针序列
[0058] 基因 上游引物（ 5’‑3’ ） 下游引物（ 5’‑3’ ） 探针 （ 5’‑3’ ）名
GNB4 TTGTGTCGCGTTTAGTTGTTACG TACAAAACTTAAACCGCCGA AATTGGTTTTACGATCGTCGGCGTA
Riple CTAGGACGATTTCGGTTGTATTATT CTCCCTAACGACAAATAAAACAAAC TTGTTGGATTGGTTCGTTACGTTGT
t
ACP1 GCGCGTTGTTTCGTTTCG SEQ ID NO. 7 CGTCACCTACCGCAAATACG SEQ ID NO. 8 CCACGGACGGCGGATAAGGAG SEQ ID NO. 9TSPYL GCGCGGGAGGATTTTCG SEQ ID NO. 10 CCGCCACCATAAACGACC SEQ ID NO. 11 CCACGGACGCGAAATCGAAAT SEQ ID NO. 12
5
HOXA1 GTACGTGACGGTGTTAGTTAATGGT SEQ ID NO. ACGACGAAACGCCGAAAAT SEQ ID NO. 14 AGTTTGTCGGTTTTCGTAGTGATGG SEQ ID
13 NO. 15
BMP4 TTCGTTGGAAGAAGTTTGTAGG SEQ ID NO. 16ACGCTTATTCCTACGATATCGTATC SEQ ID ACGGGAATTTTTTTCGTCGGTTTC SEQ ID NO. NO. 17 18
ACTB AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG SEQ ID NO. AATAACACCCCCACCCTGC SEQ ID NO. 20 GGAGTGGTTTTTGGGTTTG SEQ ID NO. 21
19
GNB4 TTGTGTCGCGTTTAGTTGTTACG TACAAAACTTAAACCGCCGA AATTGGTTTTACGATCGTCGGCGTA
Riple CTAGGACGATTTCGGTTGTATTATT CTCCCTAACGACAAATAAAACAAAC TTGTTGGATTGGTTCGTTACGTTGT
t
ACP1 GCGCGTTGTTTCGTTTCG SEQ ID NO. 7 CGTCACCTACCGCAAATACG SEQ ID NO. 8 CCACGGACGGCGGATAAGGAG SEQ ID NO. 9TSPYL GCGCGGGAGGATTTTCG SEQ ID NO. 10 CCGCCACCATAAACGACC SEQ ID NO. 11 CCACGGACGCGAAATCGAAAT SEQ ID NO. 12
5
HOXA1 GTACGTGACGGTGTTAGTTAATGGT SEQ ID NO. ACGACGAAACGCCGAAAAT SEQ ID NO. 14 AGTTTGTCGGTTTTCGTAGTGATGG SEQ ID
13 NO. 15
BMP4 TTCGTTGGAAGAAGTTTGTAGG SEQ ID NO. 16ACGCTTATTCCTACGATATCGTATC SEQ ID ACGGGAATTTTTTTCGTCGGTTTC SEQ ID NO. NO. 17 18
ACTB AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG SEQ ID NO. AATAACACCCCCACCCTGC SEQ ID NO. 20 GGAGTGGTTTTTGGGTTTG SEQ ID NO. 21
19
[0059] 检测目标基因的探针均为Taqman探针，5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，内参基因ACTB探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。
[0060] PCR反应体系各组分配方如表2所示。
[0061] 表2.PCR反应体系中各组分配方成分表
[0062] 组分 规格 体积（ µL ）Taq Pro HS Probe Master Mix （货号： QN111‑01 ，含镁离子） 2× 25
dNTP dATP 、 dCTP 、 dTTP 和 dGTP 各 2.5mM 5
目的基因上游引物 10 μM 1.5
目的基因下游引物 10 μM 1.5
目的基因探针 10 μM 1
ACTB 上游引物 10 μM 1.5
ACTB 下游引物 10 μM 1.5
ACTB 探针 10 μM 1
热启动 DNA 聚合酶 5U/μL 0.6
转化后粪便 / 血液样本 DNA / 10
纯化水 / 补至 50
dNTP dATP 、 dCTP 、 dTTP 和 dGTP 各 2.5mM 5
目的基因上游引物 10 μM 1.5
目的基因下游引物 10 μM 1.5
目的基因探针 10 μM 1
ACTB 上游引物 10 μM 1.5
ACTB 下游引物 10 μM 1.5
ACTB 探针 10 μM 1
热启动 DNA 聚合酶 5U/μL 0.6
转化后粪便 / 血液样本 DNA / 10
纯化水 / 补至 50
[0063] PCR反应条件如表3所示。
[0064] 表3 PCR反应条件。
[0065]
[0066] 阴性对照和阳性对照：在对各个目的基因分别进行检测时，应在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测。阴性对照为纯化水。阳性对照为人工合成的质粒。
[0067] 阳性对照的制备方法为：将完全甲基化的各目的基因的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列（即各扩增区域中除了CG二核苷酸中的C保持不变外，其余位置的C均变
成T，其他三种碱基的种类和位置保持不变）进行人工合成，并克隆至载体pUC57，形成人工
3
合成质粒，将质粒稀释到10拷贝/微升。
成T，其他三种碱基的种类和位置保持不变）进行人工合成，并克隆至载体pUC57，形成人工
3
合成质粒，将质粒稀释到10拷贝/微升。
[0068] Ct值读取：PCR 完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1‑2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
[0069] 质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照的Ct值均应在26‑30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤33，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有
效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
[0070] （4）PCR结果分析
[0071] 若某一目的基因在样本上的Ct值≤43，则认为该目的基因在该样本中为甲基化阳性，若某一目的基因在样本上的Ct值>43，则认为该目的基因在该样本中为甲基化阴性。当
评价两个基因联合时的检测效果时，只要至少一个基因在样本中为甲基化阳性，则认为该
基因组合在该样本中为甲基化阳性，当两个基因在样本中均为甲基化阴性时，则认为该基
因组合在该样本中为甲基化阴性，将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲
基化检测的灵敏度和特异性：
评价两个基因联合时的检测效果时，只要至少一个基因在样本中为甲基化阳性，则认为该
基因组合在该样本中为甲基化阳性，当两个基因在样本中均为甲基化阴性时，则认为该基
因组合在该样本中为甲基化阴性，将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲
基化检测的灵敏度和特异性：
[0072] 在本实施例中，灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
[0073] 实验例1
[0074] 从郑州某医院共搜集到118例肝癌患者的血液样本、55例肝硬化患者的血液样本和191例健康人血液样本，按照实施例2中的方法进行血浆cfDNA提取、亚硫酸氢盐转化，并
用转化后的DNA作为模板分别检测基因GNB4、Riplet、ACP1、TSPYL1、HOXA1和BMP4基因的甲
基化水平。分别统计6个基因在三类样本中的PCR阳性数/阴性数，并计算敏感性和特异性，
结果如下表4所示：
用转化后的DNA作为模板分别检测基因GNB4、Riplet、ACP1、TSPYL1、HOXA1和BMP4基因的甲
基化水平。分别统计6个基因在三类样本中的PCR阳性数/阴性数，并计算敏感性和特异性，
结果如下表4所示：
[0075] 表4 血液样本统计结果表。
[0076]
[0077] 由表4的结果可以看出，6个基因中，除了ACP1、HOXA1和BMP4对118例肝癌样本的检测灵敏度低于80%以外，GNB4、Riplet和TSPYL1这三个基因的灵敏度均大于80%，其中GNB4的
灵敏度最高，为86.44%。6个基因在肝硬化样本中的特异性均大于90%，GNB4、Riplet、
TSPYL1、ACP1和BMP4这6个基因在191例健康人血浆样本中的特异性均大于96%。
灵敏度最高，为86.44%。6个基因在肝硬化样本中的特异性均大于90%，GNB4、Riplet、
TSPYL1、ACP1和BMP4这6个基因在191例健康人血浆样本中的特异性均大于96%。
[0078] 进一步地，评估6个基因两两组合时对于118例肝癌患者血液样本、55例肝硬化患者血液样本和191例健康人血液样本的检测灵敏度和特异性，结果如表5所示。
[0079] 表5 两个基因组合在血液样本中的检测灵敏度和特异性统计结果表。
[0080]
[0081] 从表5的结果可以看出，当基因两两组合时，15对组合对118例肝癌样本的灵敏度均有提升。其中有两个组合的灵敏度提升到90%以上，这两个组合分别为GNB4+Riplet的组
合，及GNB4+TSPYL1的组合，而GNB4+Riplet组合的灵敏度提升最为明显，为96.61%。
合，及GNB4+TSPYL1的组合，而GNB4+Riplet组合的灵敏度提升最为明显，为96.61%。
[0082] 在55例肝硬化样本中，特异性大于90%的组合有9组，其中包括GNB4+Riplet组合，15个组合在191例健康人血样样本中的特异性均大于90%。综合来看，GNB4+Riplet的检测灵
敏度和特异性均较优。
敏度和特异性均较优。
[0083] 综上，在血浆样本中，GNB4基因甲基化的检测灵敏度和特异性最优，优于Riplet、ACP1、TSPYL1、HOXA1和BMP4这五个基因，当GNB4和Riplet组合时，能显著提升灵敏性，且不
降低特异性，因此GNB4和Riplet基因组合的甲基化检测可应用于血液样本中，可以提高检
测试剂的普及性，本发明为肝癌的无创检测以及早期筛查提供了一种新的思路。
降低特异性，因此GNB4和Riplet基因组合的甲基化检测可应用于血液样本中，可以提高检
测试剂的普及性，本发明为肝癌的无创检测以及早期筛查提供了一种新的思路。
[0084] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。