一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子及其制备方法

摘要

本发明公开了一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子及其制备方法。本发明通过曼尼希反应一步合成组氨酸改性木质素，再通过乙酰化反应降低木质素的电负性，最后通过真空旋蒸法高效制备乙酰化组氨酸改性木质素纳米粒子，由于纳米粒子的整体电负性减小，在微酸性条件下，组氨酸咪唑基的质子化作用可以抵消更多的负电荷直至达到正电，因此该纳米粒子具有在微酸性条件下电荷反转的功能，负载抗癌药物后的纳米载药粒子呈现出显著的pH响应性能，在药物控释领域有良好的应用前景。

权利要求

1.一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将一定量木质素和组氨酸分散溶解在碱性溶液中，在60～90℃下加入一定量甲醛并反应1～4 h，结束反应，纯化，得到组氨酸改性木质素；

（2）将一定量组氨酸改性木质素溶于冰醋酸中，加入乙酰化试剂，在45～65℃下反应1～3 h，结束反应，纯化，得到乙酰化组氨酸改性木质素；

（3）将一定量乙酰化组氨酸改性木质素和抗癌药物溶解于丙酮水溶液中，混合均匀后，经旋蒸去除丙酮，在溶剂蒸发的过程中木质素自组装形成胶束，抗癌药物被原位包封于胶束内部，得到乙酰化组氨酸改性载药纳米粒子；

步骤（1）所述木质素、组氨酸和甲醛的质量比为1：（1～1.8）：（1～3）；

步骤（2）所述组氨酸改性木质素和乙酰化试剂的质量体积比为0.1～0.3 g：3 mL；

步骤（3）所述乙酰化组氨酸改性木质素和抗癌药物的质量比为1：（0.1～0.3）；

步骤（3）所述的抗癌药物为姜黄素、阿霉素、多西紫杉醇和羟基喜树碱中的至少一种；

步骤（3）所述乙酰化组氨酸改性木质素在丙酮水溶液中的浓度为0.5～2 mg/mL；

步骤（3）所述丙酮水溶液中，丙酮的体积含量为70～90%；

步骤（1）所述木质素为硫酸盐法制浆黑液中的硫酸盐木质素、碱法制浆黑液中的碱木质素和生物精炼乙醇残渣中酶解木质素的至少一种；

步骤（2）所述乙酰化试剂为乙酰溴和乙酰氯中的至少一种；

步骤（1）所述木质素加入碱性溶液中配置成浓度为5～20 mg/mL的木质素溶液，所述组氨酸加入碱性溶液中配置成浓度为5～36 mg/mL的组氨酸溶液，将木质素溶液和组氨酸溶液混合得到混合溶液；

步骤（1）所述甲醛以甲醛溶液的形式滴加到木质素和组氨酸混合溶液中，滴加时间为

20～40 min，滴加完后继续保温1.5～3.5小时；所述甲醛溶液的浓度为30～40%；

步骤（2）所述氨酸改性木质素与冰醋酸的质量体积比为0.1～0.3 g：57 mL；

步骤（1）所述碱性溶液为10～30 wt%的氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液和氢氧化钾溶液中的至少一种。

2.根据权利要求1所述一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述木质素、组氨酸和甲醛的质量比为1：（1.1～1.5）：（1.5～2）；

步骤（2）所述组氨酸改性木质素和乙酰化试剂的质量体积比为0.2 g：3 mL。

3.根据权利要求1所述一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述反应的温度为65～85℃，时间为2～4 h；

步骤（2）所述反应的温度为55℃，时间为2 h。

4.根据权利要求1所述一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述旋蒸的条件为：真空度不超过0.098Mpa，水浴温度25～35℃；冷凝温度‑15～‑5℃；转速10～80 rpm。

5.权利要求1～4任一项所述方法制得的一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子。

说明书

一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于高分子材料和纳米医药技术领域，具体涉及一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子及其制备方法。

背景技术

[0002] 随着生物医药和纳米技术的不断进步，近年来关于刺激响应性的纳米药物载体的研究不断被报道并逐渐成为关注热点。刺激响应性纳米药物载体改善了传统纳米载体中靶向性差，泄漏量高，药物累计释放率低的问题，载体通过接收某种因素刺激后在特定部位释放药物，提高了药物的生物利用度，实现按需给药的功能。生物体内不同的组织和细胞的pH环境存在差异，与正常生理组织pH 7.4的环境相比，肿瘤组织的胞外微酸环境在pH 6.0，这种pH差异可作为纳米载体响应生物体内环境变化的重要信号。

[0003] 载体的安全性和可降解性是用于纳米医药研究的基本保障，生物基大分子由于其良好的生物相容性和可降解性，获得研究学者们的广泛青睐。木质素是自然界存在最广泛的芳基聚合物，由疏水的苯丙烷单元通过碳碳键和碳氧键连接而成，具有酚羟基、羧基等丰富的亲水官能团。木质素天然的两亲性结构，使其无需改性就可自组装形成胶束，是制备纳米载药粒子的良好候选材料。

[0004] 目前已有研究利用木质素作为载体用于肿瘤药物的输送，现有的专利分析如下：中国专利申请(CN111743862A)公开了一种多生物活性改性木质素的制备方法，首先利用酸酐酰化改性木质素，再通过酯化反应将活性化合物如白藜芦醇等与改性木质素进行化学连接，然后采用纳米沉淀法制备胶束，具体是将合成的木质素接枝生物活性化合物溶于乙醇等有机溶剂，然后缓慢滴加蒸馏水，自组装成纳米胶束，内部疏水核可进一步负载阿霉素或布洛芬等疏水药物。该发明申请采用了化学键合与物理包封两种方式负载药物，前者需要对木质素原料进行改性才能与药物进行化学连接，而连接位点有限导致载药效率不高，后者是通过在有机溶剂中滴加蒸馏水将疏水药物包封于疏水核中，这一制备过程用时较长且需要耗费大量的水。中国专利申请(CN108578387)公开了一种靶向叶酸‑聚乙二醇‑木质素结合物载药纳米粒子及其制备方法，以碱木质素为原料，叶酸作为靶向分子，利用氨基‑聚乙二醇‑羧基将两者化学键合，将结合物溶于DMSO中，滴加蒸馏水制备纳米粒子，其疏水内核可用于包封10‑羟基喜树碱。该发明申请通过酯键将木质素与叶酸‑聚乙二醇羧基结合物进行连接，然而酯键不稳定易水解，这将影响改性木质素分子的得率和稳定性。专利申请(CN107537039)公开了一种叶酸类化合物‑木质素基载药纳米粒子及其制备方法，通过化学键将叶酸、木质素与紫杉醇等药物进行连接，将结合物溶于甲醇中，滴加蒸馏水搅拌制备载药纳米粒子。该发明申请需要对药物进行活化和化学改性才能与木质素结合，工艺过程复杂且化学改性可能会对药物本身的药理产生影响。

[0005] 组氨酸是人体的必需氨基酸，其咪唑基侧链的pKa为6.0，接近肿瘤微酸环境，在酸性条件下咪唑基质子化产生正电荷，分子之间产生静电排斥，并由疏水转变为亲水(Chinese Chemical Letters，2020，31(6):1345‑1356.)，有研究利用组氨酸修饰生物基材料构建pH响应的纳米载药粒子。

[0006] Yao等人(Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2014，121:36–43)将葡聚糖进行胆固醇疏水改性，利用组氨酸的羧基与葡聚糖‑g‑胆固醇的羟基进行脱水缩合，以阿霉素为模型药物，通过透析法制备具有pH响应的载药纳米胶束。该研究使用的葡聚糖原料需要进行疏水改性，采用的胶束制备方法用时较长，有机溶剂无法回收，且制备出来的纳米胶束形貌不规整。Wang等人(Scientific reports，2017，7:4751)以黑木耳多糖为原料，利用组氨酸衍生物进行酯化改性，采用有机溶剂蒸发法原位包封紫杉醇制备载药纳米胶束，空白胶束的Zeta电位为0.0269mv，在pH 5.0、6.5和7.4下的体外释放量分别为88％、71％和70％。该研究采用的黑木耳多糖为水溶性多糖，由于胶束内核与疏水药物的相互作用较弱，导致其载药率较低为1.6％，且其在弱碱性条件下泄漏量高达70％。木质素的优势在于具有天然的两亲性结构，无需对其进行疏水改性就可形成胶束。中国发明专利申请(CN108653238A)公开了一种具有pH响应的木质素‑组氨酸载药纳米粒子及其制备方法。该发明申请利用碱木质素为原料，以二乙烯三胺为胺化试剂，首先通过曼尼希反应得到胺化木质素，然后通过酰胺键连接组氨酸，合成具有pH响应的木质素‑组氨酸结合物，其载药粒子的制备方法为纳米沉淀法，需要消耗大量的水，制备时间较长，溶剂无法回收，纳米载体未实现在酸性条件下的电荷反转，体外释放量差异不显著，呈现出的pH响应性能欠佳。该专利申请涉及到利用曼尼希反应对木质素进行胺化改性，并接枝组氨酸以达到木质素pH响应的效果，但是实现的响应效果仍不够好。

[0007] 纳米载体的表面电荷影响药物的释放以及肿瘤细胞的摄取率，保持纳米载体在血液循环中带负电荷，进入肿瘤组织后变为正电荷，有利于细胞的摄取和药物的快速有效释放(Journal of Controlled Release,2020,326:350‑364.)。然而由于单个组氨酸的咪唑基在微酸性条件下质子化的正电性不强，无法使纳米载体在微酸性条件下达到电荷反转，导致纳米载体的pH响应性能欠佳，这在上述pH响应纳米载体的文献中得以证明。

[0008] 在这个问题的基础上有研究利用聚组氨酸来修饰载体材料。Liu等人(Journal of Controlled Release,2011,152:49–56)将聚(L‑丙交酯)与聚乙二醇‑聚组氨酸进行偶联合成两亲性的嵌段共聚物，其制备的纳米颗粒具有良好的pH响应特性，在pH小于6.1后发生了电荷反转，zeta电位由负到正，负载阿霉素后的载药颗粒在pH 5.0的环境下释放了80％的药物。Wang等人(ACS Nano,2020,14(12):17405‑17418)在人血清白蛋白的分离端引入聚组氨酸(18个组氨酸链段)、多肽和金属蛋白酶，以紫杉醇为模型药物，自组装成载药纳米颗粒RHMH18NPs，该纳米颗粒在pH 7.4变化为pH 5.0时，发生了电荷反转，药物释放由原来的5％增大到60％；该研究还揭示了聚组氨酸的长度对质子化程度有影响，链段越长其药物的累计释放量越高。以上研究的纳米载体在酸性条件下能够实现电荷反转是由于：聚组氨酸是组氨酸的聚合形式，其分子链中有丰富的咪唑基团，使聚组氨酸在小于pKa 6.0的情况下，能够质子化产生大量的正电荷，直至发生电荷反转，触发大量的药物释放。然而聚组氨酸的价格昂贵，该制备方法成本高，难以实现批量化生产。

[0009] 综上所述，在纳米胶束制备方法这一方面：许多研究采用的是纳米沉淀或是溶剂蒸发法，存在制备用时较长，需要耗费大量的水以及溶剂无法回收的问题；在肿瘤药物载体这一方面：以木质素为原料制备出具有pH响应性的药物载体研究很少，且迄今为止，利用组氨酸修饰木质素制备的纳米载体粒子实现电荷反转的研究尚未报道。

发明内容

[0010] 为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子的制备方法。

[0011] 本发明通过曼尼希反应一步合成组氨酸改性木质素，随后进一步通过乙酰化反应降低木质素的电负性，然后通过真空旋蒸法高效制备乙酰化组氨酸改性木质素纳米粒子，由于纳米粒子的整体电负性减小，在微酸性条件下，组氨酸咪唑基的质子化作用可以抵消更多的负电荷直至达到正电，因此该纳米粒子具有在微酸性条件下电荷反转的功能，负载姜黄素后的纳米载药粒子呈现出显著的pH响应性能，在药物控释领域有良好的应用前景。

[0012] 本发明乙酰化组氨酸改性木质素两步法合成过程见下式：

[0013]

[0014] 本发明提供上述方法制得的一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子。

[0015] 本发明目的通过以下技术方案实现：

[0016] 一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子的制备方法，包括以下步骤：

[0017] (1)将一定量木质素和组氨酸分散溶解在碱性溶液中，在60～90℃下加入一定量甲醛并反应1～4h，结束反应，纯化，得到组氨酸改性木质素；

[0018] (2)将一定量组氨酸改性木质素溶于冰醋酸中，加入乙酰化试剂，在45～65℃下反应1～3h，结束反应，纯化，得到乙酰化组氨酸改性木质素；

[0019] (3)将一定量乙酰化组氨酸改性木质素和抗癌药物共同溶解于丙酮水溶液中，混合均匀后，经旋蒸去除丙酮，在溶剂蒸发的过程中木质素自组装形成胶束，抗癌药物被原位包封于胶束内部，得到乙酰化组氨酸改性载药纳米粒子。

[0020] 优选的，步骤(1)所述木质素、组氨酸和甲醛的质量比为1：(1～1.8)：(1～3)；更优选为1：(1.1～1.5)：(1.5～2)。

[0021] 优选的，步骤(1)所述碱性溶液为10～30wt％的氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液和氢氧化钾溶液中的至少一种。

[0022] 优选的，步骤(1)所述木质素加入碱性溶液中配置成浓度为5～20mg/mL的木质素溶液，其浓度更优选为10mg/mL；所述组氨酸加入碱性溶液中配置成浓度为5～36mg/mL的组氨酸溶液，其浓度更优选为15mg/mL，将木质素溶液和组氨酸溶液混合得到混合溶液。

[0023] 优选的，步骤(1)所述甲醛以甲醛溶液的形式滴加到木质素和组氨酸混合溶液中，滴加时间为20～40min，更优选为30min，滴加完后继续保温1.5～3.5h；所述甲醛溶液的质量浓度为30～40％。

[0024] 优选的，步骤(1)所述反应的温度为65～85℃，时间为2～4h(包括滴加时间和保温时间)。

[0025] 优选的，步骤(1)所述木质素为硫酸盐法制浆黑液中的硫酸盐木质素(SKL)、碱法制浆黑液中的碱木质素(AL)和生物精炼乙醇残渣中酶解木质素(EL)的至少一种。

[0026] 优选的，步骤(1)所述纯化的方法为：向产物混合液中滴加0.1mol/L的盐酸，将pH值调至3～5使产物沉淀析出，水洗沉淀至中性后溶解在N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)中，置入透析袋并在水中透析至少为2天，冷冻干燥。

[0027] 优选的，步骤(2)所述组氨酸改性木质素和乙酰化试剂的质量体积比为0.1～0.3g：3mL；更优选为0.2g：3mL。

[0028] 优选的，步骤(2)所述氨酸改性木质素与冰醋酸的质量体积比为0.1～0.3g：57mL；更优选为0.2g：57mL。

[0029] 优选的，步骤(2)所述乙酰化试剂为乙酰溴和乙酰氯中的至少一种。

[0030] 优选的，步骤(2)所述反应的温度为55℃，时间为2h。

[0031] 优选的，步骤(2)所述加入乙酰化试剂后，超声分散至少30min，使其与组氨酸改性木质素混合均匀。

[0032] 优选的，步骤(2)所述纯化的方法为：将产物混合液进行旋蒸去除冰醋酸和未反应的乙酰化试剂，然后水洗至中性，冷冻干燥。

[0033] 优选的，步骤(3)所述的抗癌药物为姜黄素(CUR)、阿霉素(DOX)、多西紫杉醇(DTX)和羟基喜树碱(HCPT)中的至少一种。

[0034] 优选的，步骤(3)所述乙酰化组氨酸改性木质素和抗癌药物的质量比为1：(0.1～0.3)。

[0035] 优选的，步骤(3)所述乙酰化组氨酸改性木质素在丙酮水溶液中的浓度为0.5～2mg/mL；更优选为1mg/mL。

[0036] 优选的，步骤(3)所述丙酮水溶液中，丙酮的体积含量为70～90％；更优选为80％。

[0037] 优选的，步骤(3)所述旋蒸采用雅马拓RE202旋转蒸发仪进行，真空泵采用巩义市予华SHZ‑D(Ⅲ)型循环水真空泵(最大真空度0.098MPa)，冷凝器采用上海霄汉实业公司XHDL‑20型低温冷凝循环泵；真空旋蒸的条件为：真空度不超过0.098Mpa，水浴温度25～35℃，更优选30℃；冷凝温度‑15～‑5℃，更优选‑15℃；转速10～80rpm，更优选40rpm。

[0038] 上述方法制得的一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子。

[0039] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

[0040] (1)木质素作为纳米载体的生物基原料，来源广泛，廉价易得，官能团丰富易于改性。利用生物相容性好的组氨酸作为咪唑基供体修饰木质素，通过曼尼希反应一步合成了组氨酸改性木质素，赋予木质素pH响应性，工艺简单，绿色环保。

[0041] (2)通过对接枝改性木质素的进一步乙酰化，降低木质素的电负性，协同咪唑基的质子化作用，使制备的纳米粒子在微酸性条件下就可实现电荷反转现象，不仅提高了木质素对pH的敏感强度，还极大地降低了材料的成本。

[0042] (3)本发明采用真空旋蒸法制备纳米(载药)粒子，工艺简单，溶剂可回收，制备参数(起始浓度、转速、温度)易于调控。

[0043] (4)本发明制备的乙酰化组氨酸改性木质素通过真空旋蒸自组装可同步高效负载姜黄素等疏水药物，并在体外释放试验中呈现酸性条件下大量释放药物、弱碱性环境泄漏量较低的效果。pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子这一良好的控释性能，为木质素在肿瘤载药领域的高值化应用研究提供了初步的线索。

附图说明

[0044] 图1为实施例1中硫酸盐木质素、组氨酸改性木质素和乙酰化组氨酸改性木质素的核磁氢谱。

[0045] 图2为实施例1和对比例1‑2中木质素基纳米粒子和载药纳米粒子的扫描电镜图。

[0046] 图3为实施例1和对比例1‑2中木质素基纳米粒子在不同pH下的Zeta电位图。

[0047] 图4为实施例1和对比例1‑2中木质素基载药纳米粒子的体外释放曲线。

具体实施方式

[0048] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0049] 本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0050] 本申请实施例和对比例中所用真空旋蒸仪的产家及型号为雅马拓RE202旋转蒸发仪。

[0051] 实施例1

[0052] (1)称取5g硫酸盐木质素分散溶解于50mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中。同样地，称取5g的L‑组氨酸分散溶解于50mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中，将组氨酸溶液与上述木质素溶液混合均匀后加入到三口烧瓶。然后，在65℃下将13.5g的质量浓度为37％的甲醛溶液用蠕动泵泵入三口烧瓶中(控制在30min加完)，继续在65℃保温反应1.5h，反应过程不断搅拌溶液，冷凝回流。反应完成后，滴加0.1mol/L盐酸调pH至3使产物析出，水洗沉淀至中性，将沉淀溶解于DMF，置入1000Da的透析袋，在纯水中透析2天，透析完成后，冷冻干燥得到SKL‑HIS(1)。

[0053] (2)取0.2g步骤(1)产物溶于57mL的冰醋酸中，加入3mL乙酰溴，超声分散混合溶液30min，置于45℃的油浴锅中反应2h。反应结束后旋蒸除去剩余的乙酰溴和冰醋酸，将产物水洗至中性，冷冻干燥，得到Ace‑SKL‑HIS(1)。

[0054] (3)取10mg步骤(2)产物与1mg的CUR共同溶解于10mL丙酮体积含量为80％的丙酮水溶液中，超声溶解均匀后，真空旋转蒸发丙酮溶剂，水浴温度为25℃，冷凝温度‑15℃，转速10rpm。旋蒸结束后，冷冻干燥得到载药纳米粒子Ace‑SKL‑HIS(1)@CUR。未负载姜黄素的空白纳米粒子制备过程同上，区别仅在于不加入CUR，命名为Ace‑SKL‑HIS(1)NPs。

[0055] 实施例2

[0056] (1)称取7.5g硫酸盐木质素分散溶解于50mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中。同样地，称取13.5g的L‑组氨酸分散溶解于50mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中。将组氨酸溶液与上述木质素溶液混合均匀后加入到三口烧瓶。然后，在75℃下将60.8g的质量浓度为37％的甲醛溶液用蠕动泵泵入三口烧瓶中(控制在30min加完)，继续在75℃保温反应3.5h，反应过程中不断搅拌溶液，冷凝回流。反应完成后，滴加0.1mol/L盐酸调pH至5使产物析出，水洗沉淀至中性，将沉淀溶解于DMF，置入1000Da的透析袋，在纯水中透析2天，透析完成后，冷冻干燥得到SKL‑HIS(2)。

[0057] (2)取0.3g步骤(1)产物溶于57mL的冰醋酸中，加入3mL乙酰溴，超声分散混合溶液30min，置于55℃的油浴锅中反应3h。反应结束后旋蒸除去剩余的乙酰溴和冰醋酸，将产物水洗至中性，冷冻干燥，得到Ace‑SKL‑HIS(2)。

[0058] (3)取15mg步骤(2)产物与4.5mg的CUR共同溶解于10mL丙酮体积含量为70％的丙酮水溶液中，超声溶解均匀后，真空旋转蒸发丙酮溶剂，水浴温度为35℃，冷凝温度‑10℃，转速50rpm。旋蒸结束后，冷冻干燥得到载药纳米粒子Ace‑SKL‑HIS(2)@CUR。未负载姜黄素的空白纳米粒子制备过程同上，区别仅在于不加入CUR，命名为Ace‑SKL‑HIS(2)NPs。

[0059] 实施例3

[0060] (1)称取10g硫酸盐木质素分散溶解于50mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中。同样地，称取15g的L‑组氨酸分散溶解于50mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中。将组氨酸溶液与上述木质素溶液混合均匀后加入到三口烧瓶。然后，在85℃下将54g的质量浓度为37％的甲醛溶液用蠕动泵泵入三口烧瓶中(控制在30min加完)，继续在85℃保温反应2.5h，反应过程中不断搅拌溶液，冷凝回流。反应完成后，滴加0.1mol/L盐酸调pH至4使产物析出，水洗沉淀至中性，将沉淀溶解于DMF，置入1000Da的透析袋，在纯水中透析2天，透析完成后，冷冻干燥得到SKL‑HIS(3)。

[0061] (2)取0.1g步骤(1)产物溶于57mL的冰醋酸中，加入3mL乙酰溴，超声分散混合溶液30min，置于65℃的油浴锅中反应1h。反应结束后旋蒸除去剩余的乙酰溴和冰醋酸，将产物水洗至中性，冷冻干燥，得到Ace‑SKL‑HIS(3)。

[0062] (3)取20mg步骤(2)产物与4mg的DOX共同溶解于10mL丙酮体积含量为90％的丙酮水溶液中，超声溶解均匀后，真空旋转蒸发丙酮溶剂，水浴温度为30℃，冷凝温度‑5℃，转速80rpm。旋蒸结束后，冷冻干燥得到载药纳米粒子Ace‑SKL‑HIS(3)@CUR。未负载姜黄素的空白纳米粒子制备过程同上，区别仅在于不加入CUR，命名为Ace‑SKL‑HIS(3)NPs。

[0063] 实施例4

[0064] (1)称取2.5g碱木质素(AL)分散溶解于50mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中。同样地，称取3.75g的L‑组氨酸分散溶解于50mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中。将组氨酸溶液与上述木质素溶液混合均匀后加入到三口烧瓶。然后，在75℃下将13.5g的质量浓度为37％的甲醛溶液用蠕动泵泵入三口烧瓶中(控制在30min加完)，继续在75℃保温反应2.5h，反应过程中不断搅拌溶液，冷凝回流。反应完成后，滴加0.1mol/L盐酸调pH至4使产物析出，水洗沉淀至中性，将沉淀溶解于DMF，置入1000Da的透析袋，在纯水中透析2天，透析完成后，冷冻干燥得到AL‑HIS。

[0065] (2)取0.1g步骤(1)产物溶于57mL的冰醋酸中，加入3mL乙酰氯，超声分散混合溶液30min，置于55℃的油浴锅中反应3h。反应结束后旋蒸除去剩余的乙酰溴和冰醋酸，将产物水洗至中性，冷冻干燥，得到Ace‑AL‑HIS。

[0066] (3)取5mg步骤(2)产物与0.5mg的DTX共同溶解于10mL丙酮体积含量为70％的丙酮水溶液中，超声溶解均匀后，真空旋转蒸发丙酮溶剂，水浴温度为30℃，冷凝温度‑10℃，转速40rpm。旋蒸结束后，冷冻干燥得到载药纳米粒子Ace‑SKL‑HIS@CUR。未负载姜黄素的空白纳米粒子制备过程同上，区别仅在于不加入CUR，命名为Ace‑AL‑HIS NPs。

[0067] 实施例5

[0068] (1)称取10g酶解木质素(EL)分散溶解于50mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中。同样地，称取18g的L‑组氨酸分散溶解于50mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中。将组氨酸溶液与上述木质素溶液混合均匀后加入到三口烧瓶。然后，在85℃下将81.1g的质量浓度为37％的甲醛溶液用蠕动泵泵入三口烧瓶中(控制在30min加完)，继续在85℃保温反应3.5h，反应过程中不断搅拌溶液，冷凝回流。反应完成后，滴加0.1mol/L盐酸调pH至5使产物析出，水洗沉淀至中性，将沉淀溶解于DMF，置入1000Da的透析袋，在纯水中透析2天，透析完成后，冷冻干燥得到EL‑HIS。

[0069] (2)取0.3g步骤(1)产物溶于57mL的冰醋酸中，加入3mL乙酰氯，超声分散混合溶液30min，置于65℃的油浴锅中反应1h。反应结束后旋蒸除去剩余的乙酰溴和冰醋酸，将产物水洗至中性，冷冻干燥，得到Ace‑EL‑HIS。

[0070] (3)取20mg步骤(2)产物与6mg的HCPT共同溶解于10mL丙酮体积含量为90％的丙酮水溶液中，超声溶解均匀后，真空旋转蒸发丙酮溶剂，水浴温度为35℃，冷凝温度‑5℃，转速80rpm。旋蒸结束后，冷冻干燥得到载药纳米粒子Ace‑SKL‑HIS@CUR。未负载姜黄素的空白纳米粒子制备过程同上，区别仅在于不加入CUR，命名为Ace‑EL‑HIS NPs。

[0071] 对比例1(未改性的硫酸盐木质素)

[0072] (1)取10mg硫酸盐木质素溶解于10mL丙酮体积含量为80％的丙酮水溶液中，超声溶解均匀后，真空旋转蒸发丙酮溶剂，水浴温度为25℃，冷凝温度‑15℃，转速10rpm。旋蒸结束后，冷冻干燥得到SKL NPs。

[0073] (2)将10mg的硫酸盐木质素与1mg的CUR共同溶解于10mL丙酮体积含量为80％的丙酮水溶液中，其余过程同步骤(1)，得到载药纳米粒子SKL@CUR。

[0074] 对比例2(组氨酸改性的硫酸盐木质素)

[0075] (1)称取5g硫酸盐木质素分散溶解于50mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中。同样地，称取5g的L‑组氨酸分散溶解于50mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中。将组氨酸溶液与上述木质素溶液混合均匀后加入到三口烧瓶。然后，在65℃下将13.5g的质量浓度为37％的甲醛溶液用蠕动泵泵入三口烧瓶中(控制在30min加完)，继续在65℃保温反应1.5h，反应过程中不断搅拌溶液，冷凝回流。反应完成后，滴加0.1mol/L盐酸调pH至3使产物析出，水洗沉淀至中性，将沉淀溶解于DMF，置入1000Da的透析袋，在纯水中透析2天，透析完成后，冷冻干燥得到SKL‑HIS。

[0076] (2)称取10mg步骤(1)产物与1mg的CUR共同溶解于10mL丙酮体积含量为80％的丙酮水溶液中，超声溶解均匀后，真空旋转蒸发丙酮溶剂，水浴温度为25℃，冷凝温度‑15℃，转速10rpm。旋蒸结束后，冷冻干燥得到载药纳米粒子SKL‑HIS@CUR。未负载姜黄素的空白纳米粒子制备过程同上，区别仅在于不加入CUR，命名为SKL‑HIS NPs。

[0077] 对比例3(先乙酰化改性后组氨酸改性的木质素)

[0078] (1)称取硫酸盐木质素2g，溶于570mL的冰醋酸中，加入30mL乙酰溴，超声分散混合溶液30min，置于45℃的油浴锅中反应2h。反应结束后旋蒸除去剩余的乙酰溴和冰醋酸，将产物水洗至中性，冷冻干燥，得到乙酰化改性木质素，Ace‑SKL。

[0079] (2)称取1g步骤(1)产物分散溶解于10mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中。同样地，称取1g的L‑组氨酸分散溶解于10mL质量浓度为20wt％的氢氧化钠水溶液中，将组氨酸溶液与上述木质素溶液混合均匀后加入到三口烧瓶。然后，在65℃下将2.7g的质量浓度为37％的甲醛溶液用蠕动泵泵入三口烧瓶中(控制在30min加完)，继续在65℃保温反应
1.5h，反应过程不断搅拌溶液，冷凝回流。反应完成后，滴加0.1mol/L盐酸调pH至3使产物析出，水洗沉淀至中性，将沉淀溶解于DMF，置入1000Da的透析袋，在纯水中透析2天，透析完成后，冷冻干燥得到组氨酸乙酰化改性木质素，HIS‑Ace‑SKL。

[0080] (3)取10mg步骤(2)产物与1mg的CUR共同溶解于10mL丙酮体积含量为80％的丙酮水溶液中，超声溶解均匀后，真空旋转蒸发丙酮溶剂，水浴温度为25℃，冷凝温度‑15℃，转速10rpm。旋蒸结束后，冷冻干燥得到载药纳米粒子HIS‑Ace‑SKL@CUR。

[0081] 实施例效果说明

[0082] 表1是上述实施例制备的乙酰化组氨酸改性纳米载药颗粒与对比例制备的样品在载药性能和pH控释效果方面的比较。

[0083] 表1乙酰化组氨酸改性纳米载药颗粒与对比例1～3的载药和pH响应性能[0084]

[0085] 由表1可以看出，实施例1～5制备的乙酰化组氨酸改性素与未经改性的对比例1和仅组氨酸改性的对比例2相比，粒径有所增大，粒径范围约在120～150nm之间，包封效率都在66％以上。此外，实施例1～5在微酸条件pH 5.0下的Zeta电位都实现了正电反转，在pH 5.7下120h的药物累计释放率达到了80％，呈现了良好的响应性能。这可能是由于乙酰化后降低了组氨酸改性木质素的电负性，在弱酸性条件下，咪唑基质子化，胶束的静电排斥增强，随着正电荷的增多逐渐达到等电点，胶束结构失稳从而触发大量药物的释放。对比例3为先乙酰化改性后组氨酸改性的样品，其在pH 5.0下的Zeta电位仍带负电荷，未实现了正电反转，在微酸性环境下的药物释放率仅为40.3％。

[0086] 对实施例1制备的乙酰化组氨酸改性木质素、对比例2制备的组氨酸改性木质素(对应实施例1步骤(1)产物)以及对比例1的硫酸盐木质素(对应实施例1原料)进行了结构1
表征，其 H‑NMR如图1所示；对所制备的木质素基纳米粒子和载药纳米粒子的形貌进行表征，如图2所示；对木质素基纳米粒子的Zeta电位进行测试，结果见图3；为研究载药纳米粒子的pH控释性能，对其进行体外释放试验，结果如图4所示。

[0087] 图1为硫酸盐木质素、组氨酸改性木质素和乙酰化组氨酸改性的核磁氢谱，从图可明显看出，SKL‑HIS与Ace‑SKL‑HIS的图谱在化学位移δ7.90ppm、δ2.73和δ2.89ppm处皆出现明显的吸收，分别归属于咪唑基的C‑H、组氨酸上的‑CH2质子峰，在Ace‑SKL‑HIS图谱中，观察到了δ1.89‑2.22ppm处明显的特征峰，对应于乙酰基的质子峰。由此可见，组氨酸改性木质素和乙酰化组氨酸改性成功合成。

[0088] 图2是木质素基纳米粒子/载药纳米粒子(SKL NPs、SKL‑HIS NPs、Ace‑SKL‑HIS(1)NPs、SKL@CUR、SKL‑HIS@CUR、Ace‑SKL‑HIS(1)@CUR)的扫描电镜图，由图可见纳米粒子和载药粒子皆呈现良好的球形，分散较为均匀。纳米粒子粒径在50‑100nm，载药粒子粒径在100‑150nm。

[0089] 图3为木质素基纳米粒子在不同pH下的Zeta电位图，硫酸盐木质素及组氨酸改性木质素的Zeta电位皆随着pH的降低而减小，组氨酸改性木质素由于咪唑基的存在，使其负电位低于硫酸盐木质素，然而在图中的pH范围内，并未达到电荷反转。对于乙酰化组氨酸改性，其Zeta电位随着pH的降低先减小后增大，出现电荷反转的现象，等电点在5.5。这是由于乙酰化组氨酸改性中的部分酚羟基被屏蔽，电负性减弱，随着pH的降低，协同咪唑基的质子化作用，达到了电荷反转的效果。

[0090] 载药粒子的体外释放曲线如图4所示，未经改性的硫酸盐木质素在酸碱性条件下的释放量无明显差异，不具响应性，而改性后的木质素皆呈现出一定的pH响应性能。相对于组氨酸改性木质素载药粒子，乙酰化组氨酸改性载药粒子呈现出更为显著的pH响应特性，在pH 5.7的PBS缓冲液中，120h小时的累计释放量接近80％，而pH 7.4条件下泄漏量仅为13％。这是由于乙酰化组氨酸改性载药粒子实现了电荷反转的功能，在酸性条件下触发了大量药物的释放。

[0091] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。