RABGGTB在诊断和治疗肌萎缩侧索硬化中的应用

摘要

本发明属于生物医学领域，具体涉及RABGGTB在诊断和治疗肌萎缩侧索硬化中的应用。本发明还提供了RABGGTB在制备治疗肌萎缩侧索硬化的药物、保护运动神经元中的应用；具体地，所述RABGGTB是指表达RABGGTB、或促进RABGGTB表达的生物材料、或含所述生物材料的组合物。

权利要求

1.表达RABGGTB或促进RABGGTB表达的生物材料或含所述生物材料的组合物在制备治疗SOD1突变型肌萎缩侧索硬化的产品或者制备保护SOD1突变型运动神经元的产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SOD1突变是SOD1‑G93A突变。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物材料包括表达基因、表达盒、重组载体、细胞、或蛋白质。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述保护运动神经元是指提高神经元细胞活力、抑制神经元细胞凋亡、减少神经元细胞中的SOD1聚集、减少神经元细胞自噬、改善神经元细胞中的自噬流障碍、和/或增加神经元细胞中的Rab7的膜定位；所述神经元是NSC‑34小鼠神经元细胞。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述神经元是表达SOD1‑G93A的NSC‑34小鼠神经元细胞。

6.检测RABGGTB的表达量的试剂在制备诊断SOD1突变型肌萎缩侧索硬化的产品或者制备判断SOD1突变型神经元细胞活性的产品中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述神经元细胞活性包括以下特征：细胞活力、细胞凋亡程度、SOD1聚集程度、自噬、自噬流是否有障碍、和/或Rab7的膜定位。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测RABGGTB表达量的试剂包括检测蛋白表达量和/或mRNA表达量的试剂。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测RABGGTB蛋白表达量的试剂是蛋白质印迹方法中所使用的试剂，或者是以下方法中所使用试剂：酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱检测法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分析技术和蛋白质芯片法。

10.一种保护体外的SOD1突变型运动神经元的方法，所述方法包括使用表达RABGGTB的生物材料、或使用促进RABGGTB表达的物质。

11.一种判断体外的SOD1突变型神经元细胞活性的方法，所述方法包括通过RABGGTB表达量的检测结果进行判断。

说明书

RABGGTB在诊断和治疗肌萎缩侧索硬化中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学领域，具体涉及RABGGTB在诊断和治疗肌萎缩侧索硬化中的应用。

背景技术

[0002] 肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种原因不明进行性加重的神经系统变性疾病，主要累及脊髓前角、脑干及大脑皮质的运动神经元，也称为运动神经元病。临床表现为进行性加重的肌无力、肌肉萎缩，言语不利、吞咽困难，腱反射亢进病理征阳性，多在发病3‑5年后因呼吸肌麻痹、呼吸衰竭死亡。研究表明4% SALS和20% FALS患者中有SOD1（超氧化物歧化酶1，Superoxide Dismutase 1）突变。突变的SOD1蛋白容易错误折叠并在运动神经元中形成聚集体，这些聚集体需要通过自噬来降解。自噬是一种高度保守的细胞内途径，负责长寿命蛋白质和受损细胞器的降解。新的证据表明，自噬功能不全与ALS有关，包括自噬的过度诱导，自噬体成熟和与溶酶体融合障碍。

[0003] Rab7蛋白属于小GTP酶家族，在自噬体与溶酶体的融合进程中发挥重要的作用，介导自噬体成熟及与溶酶体的融合和胞内囊泡运输。

[0004] RABGGTB是Rab异戊二烯基转移酶GGTase Ⅱ的β亚基，GGTase Ⅱ能对Rab7进行异戊二烯化修饰使其活化上膜而调节自噬。以往关于GGTase Ⅱ的研究主要是抑制其活性而应用于肿瘤和多发性硬化等免疫性疾病的治疗方面，而在肌萎缩侧索硬化的研究中未曾涉及。

[0005]  ALS 仍是一种无法治愈的疾病，目前缺乏有效的治疗方法，美国FDA认证的力如太、依达拉奉对其治疗作用非常有限，因此迫切需要早期诊断，早期治疗，寻找有效的治疗靶点开发药物来延缓疾病的进程，延长生存期。治疗中除使用延缓病情发展的药物外，还应包括营养管理、呼吸支持和心理治疗等综合治疗。

发明内容

[0006] 为提供ALS的诊断标志物，并提供可能的ALS治疗方法，本发明验证了RABGGTB在对照细胞和SOD1突变细胞中的差异表达，进一步验证了在SOD1突变细胞中过表达RABGGTB后的细胞特性。本发明的研究表明GGTase Ⅱ可能作为ALS的治疗靶点，并且对研究和筛选特异性的GGTase Ⅱ激活剂或者诱导剂来治疗ALS提供了依据。

[0007] 治疗应用

[0008] 一方面，本发明提供了RABGGTB在治疗肌萎缩侧索硬化、保护运动神经元中的应用。

[0009] 本发明所述RABGGTB也可以称为GGTase II‑β，也就是Rab异戊二烯基转移酶（GGTase Ⅱ，Type II Protein Geranyl‑Geranyltransferase）的β亚基，其Ensembl ID是ENSG00000137955。

[0010] 本发明所述“肌萎缩侧索硬化”即amyotrophic lateral sclerosis，通常缩写为ALS，亦称为运动神经元病（motor neuron disease，MND），后一名称英国常用，法国又叫夏科（Charcot）病，而美国也称卢伽雷（Lou Gehrig）病。我国通常将肌萎缩侧索硬化和运动神经元病混用。以上术语皆为相同含义，在本发明中可以互换使用。

[0011] 优选地，所述肌萎缩侧索硬化包括SOD1突变型肌萎缩侧索硬化，所述SOD1突变后易错误折叠并形成聚集体，更具体地，所述SOD1突变型肌萎缩侧索硬化是SOD1‑G93A型肌萎缩侧索硬化，即：由于SOD1发生G93A突变而产生的肌萎缩侧索硬化。

[0012] 优选地，所述RABGGTB是指表达RABGGTB、或促进RABGGTB表达的生物材料、或含所述生物材料的组合物。

[0013] 优选地，所述生物材料包括编码基因、表达盒、重组载体、细胞、蛋白质。

[0014] 优选地，所述重组载体是病毒载体、表达载体。

[0015] 优选地，所述表达载体中还包括可操作地连接的一种或多种调控元件。

[0016] 优选地，所述调控元件包括但不限于启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列、筛选标记基因。

[0017] 优选地，所述病毒载体是慢病毒载体。

[0018] 优选地，所述细胞包括来源于任何宿主的细胞，所述宿主包括但不限于动物，示例性的，例如：灵长目动物（人、猿、猴、黑猩猩）、啮齿类动物（小鼠、大鼠、豚鼠等）、非人灵长类动物（兔、牛、羊、猪、马、犬、猫等）。

[0019] 优选地，所述组合物还可以包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，进而形成药物（药物组合物）。

[0020] 优选地，所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂包括但不限于已经由美国食品和药品管理局或中国食品药品监督管理局批准可用于人或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。

[0021] 优选地，所述保护运动神经元包括提高细胞活力、抑制细胞凋亡、减少SOD1聚集、减少自噬、改善自噬流障碍、增加Rab7的膜定位。

[0022] 优选地，所述减少自噬是以LC3和P62表达量体现的。

[0023] 更优选地，所述保护运动神经元是指提高神经元细胞活力、抑制神经元细胞凋亡、减少神经元细胞中的SOD1聚集、减少神经元细胞自噬、改善神经元细胞中的自噬流障碍、增加神经元细胞中的Rab7的膜定位。

[0024] 更具体地，所述神经元细胞是NSC‑34小鼠神经元细胞；更优选地，表达SOD1‑G93A的NSC‑34小鼠神经元细胞。

[0025] 更具体地，本发明所述神经元细胞是运动神经元细胞。

[0026] 本发明所述术语“SOD1‑G93A”指发生G93A突变的SOD1（超氧化物歧化酶1，Superoxide Dismutase 1）。

[0027] 诊断应用

[0028] 另一方面，本发明检测RABGGTB的表达量的试剂在诊断肌萎缩侧索硬化、判断神经元细胞活性中的应用。

[0029] 所述RABGGTB在肌萎缩侧索硬化的样品（例如细胞）中表达下调。所述的“下调”，是指样品中RABGGTB表达量小于在来自健康或正常个体的类似生物样品中通常检测到的表达量（正常表达量范围）。

[0030] 优选地，所述神经元细胞活性可以从以下方面体现：细胞活力、细胞凋亡程度、SOD1聚集程度、自噬、自噬流是否有障碍、Rab7的膜定位。

[0031] 本发明所述的生物标志物的“表达量”也可称为“表达水平”，是指生物学样品中的可检测的所述生物标志物的水平，这些可通过本领域技术人员已知的任何检测方法进行检测。

[0032] 优选地，所述检测RABGGTB表达量的试剂包括检测RABGGTB蛋白表达量和/或RABGGTB mRNA表达量的试剂。

[0033] 优选地，所述检测RABGGTB表达量是检测RABGGTB蛋白表达量的试剂。

[0034] 优选地，所述检测RABGGTB蛋白表达量的试剂是蛋白质印迹（Western Blot法）方法中所使用的试剂，所述检测RABGGTB蛋白表达量的试剂也可以是以下方法中所使用试剂：酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射性免疫测定（RIA）、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱检测法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分析技术和蛋白质芯片法。

[0035] 具体地，所述检测RABGGTB蛋白表达量的试剂包括RABGGTB的抗体或其片段，所述RABGGTB的抗体或其片段能特异性的与RABGGTB蛋白结合。进一步地，所述试剂还可以包括二抗（即与RABGGTB的抗体或其片段结合的抗体）和/或可检测标记物。

[0036] 优选地，所述检测RABGGTB mRNA表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法、高通量测序平台方法。

[0037] 优选地，所述诊断、判断是针对样品中RABGGTB的表达量而得出的结论。

[0038] 本领域技术人员皆知，可检测样品包括：细胞、血清、血浆、全血、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、鼻上皮细胞、痰、组织、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液等。

[0039] 优选地，本发明所述样品是细胞。

[0040] 更优选地，所述样品是神经元细胞。更具体地，所述神经元细胞是NSC‑34小鼠神经元细胞；更优选地，表达SOD1‑G93A的NSC‑34小鼠神经元细胞。

[0041] 产品

[0042] 另一方面，本发明提供了一种治疗肌萎缩侧索硬化、保护运动神经元中的药物组合物，所述药物组合物包括表达RABGGTB的生物材料。

[0043] 优选地，所述药物组合物可以为片剂，丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊剂，锭剂，糖浆剂，液体，乳剂，混悬剂，控制释放制剂，气雾剂，膜剂，注射剂，静脉滴注剂，透皮吸收制剂，软膏剂，洗剂，粘附制剂，栓剂，小药丸，鼻制剂，肺制剂，眼睛滴剂等等，口服或胃肠外制剂。

[0044] 本发明所述“组合物”包括但不限于“药物组合物”，皆含有表达RABGGTB的生物材料、或促进RABGGTB表达的物质。

[0045] 另一方面，本发明提供了一种诊断肌萎缩侧索硬化、判断神经元细胞活性的试剂盒，所述试剂盒包括检测样品中RABGGTB的表达量所使用的试剂。

[0046] 优选地，所述试剂盒中还可以包含以下任意一种或多种：蛋白表达量辅助检测试剂、蛋白表达量辅助检测仪器、mRNA表达量辅助检测试剂、mRNA表达量辅助检测仪器。

[0047] 优选地，所述蛋白表达量辅助检测试剂包括但不限于：封闭液，抗体稀释液，洗涤缓冲液，显色终止液，制备标准曲线的标准品。

[0048] 优选地，所述mRNA表达量辅助检测试剂包括但不限于：使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂，例如通过琼脂糖凝胶电泳法、酶联凝胶法、化学发光法、原位杂交法、荧光检测法等使扩增子可视化的试剂，RNA提取试剂，逆转录试剂，cDNA扩增试剂，制备标准曲线所用的标准品，阳性对照品，阴性对照品。

[0049] 方法

[0050] 另一方面，本发明提供了治疗肌萎缩侧索硬化、保护运动神经元的方法，所述方法包括使用表达RABGGTB的生物材料、或使用促进RABGGTB表达的物质。

[0051] 更具体地，本发明所述神经元是运动神经元。

[0052] 另一方面，本发明提供了诊断肌萎缩侧索硬化、判断神经元细胞活性的方法，所述方法包括通过RABGGTB表达量的检测结果进行判断。

[0053] 更具体地，本发明所述神经元是运动神经元。

[0054] 本文中使用的术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物（例如，被兽医所应用） ，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展（包括降低发展速度、使发展停止）、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施（例如预防）的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的高风险人群的用途，也包括在术语“治疗”中。

[0055] 如本领域技术人员皆知，术语“神经元”即神经元细胞，是神经系统最基本的结构和功能单位。在本发明中“神经元”、“神经元细胞”可以互换使用。所以，本发明所述“保护运动神经元”也可以称为保护运动神经元细胞。

附图说明

[0056] 图1是NSC34‑E、NSC34‑SOD1G93A细胞中内源性RABGGTA及RABGGTB的蛋白表达量；图1a是RABGGTA；图1b是RABGGTB。

[0057] 图2是CCK‑8细胞活力检测结果图。

[0058] 图3是细胞凋亡的分析结果图，图3a是Cleaved caspase‑3染色结果图，图3b是EDU染色结果图，图3c是Cleaved caspase‑3蛋白表达水平检测结果图。

[0059] 图4是SOD1 染色结果图。

[0060] 图5是SOD1 蛋白表达水平检测结果图。

[0061] 图6是LC3、P62染色结果图。

[0062] 图7是LC3、P62蛋白表达水平检测结果图。

[0063] 图8是Rab7膜定位结果图。

具体实施方式

[0064] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

[0065] 本发明所使用的材料和通用实验方法

[0066] 1.细胞培养和细胞处理

[0067] 本发明所涉及的细胞系及其构建如表1所示。

[0068] 将细胞系从液氮中取出，快速复苏，然后在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养，其中含有10%热灭活胎牛血清(FBS)和1%青霉素‑链霉素，并补充0.2mg/mLgeneticin 418硫酸盐(G418)。细胞在37℃、5%CO2环境中培养。在所有实验中，细胞在无血清DMEM中饥饿6小时。

[0069]

[0070] 2.分组及慢病毒转染

[0071] 慢病毒转染：调整细胞状态，待细胞状态较好时，一般转染前细胞密度为50%左右，依据MOI为10加入病毒原液37℃孵育、培养。在荧光显微镜下观察细胞转染情况，待细胞可见红色荧光后，换用嘌呤霉素培养基(浓度2µg/ml)进行筛选，待镜下可见明显荧光，可进行下一步实验。

[0072] 3.免疫荧光

[0073] 将细胞接种在无菌玻璃盖玻片上，用4%多聚甲醛固定30分钟，然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤三次，使用0.5% Triton X‑100破膜15min，使用1X PBS洗3遍，并在室温下用10%山羊血清(在0.3%Triton X‑100中稀释)处理30分钟。接下来，细胞在4℃下与抗GFP(1:500，Abcam)和RABGGTB(Genetex，1:500)，RABGGTA(1:100，Proteintech)，LC3(1:200，Santa)，P62(1:500，Sigma)，SOD1(1:200，Abcam)，或者Cleaved‑Caspase 3(1:300，affinity)，Rab7(1:500，abcam)的抗体一起培养过夜。用二级抗体，具体是山羊抗兔Alexa‑Fluor 647(1:1000；Thermo‑Fisher)、驴抗鼠Alexa‑Fluor 405(1:300；Thermo‑Fisher)、山羊抗鸡Alexa‑Fluor 405(1:500；Thermo‑Fisher)在室温下染色1小时。然后，用DAPI‑Fluoromount‑G固定细胞，对细胞核进行染色。用共焦显微镜对标记细胞进行成像。

[0074] 4.CCK‑8

[0075] 细胞活力通过CCK‑8测定法进行评估，将细胞接种到96孔板中(每孔1.5×104个细胞)进行培养。并在黑暗中在37°C条件下向每个孔中添加100µL新鲜培养基和10µL CCK‑8溶液2小时。然后，使用微孔板读取器在450nm波长处测量吸光度。

[0076] 5. Western blotting

[0077] 使用BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo Fisher Scientific，23225，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)提取蛋白质。用10%或12%的SDS‑PAGE分离等量的蛋白质(30μg)，然后转移到PVDF膜上。在用5%脱脂牛奶封闭后，在4°C下将膜与一级抗体孵育过夜，然后清洗三次(10分钟/次)，随后在室温下与二级抗体孵育1小时。最后，使用奥德赛红外成像系统(美国东北部林肯市LI‑COR)扫描膜上的条带。

[0078] 主要抗体：P62(1:1000，Sigma)，LC3(1:1000，Sigma)，SOD1(1:2000，Abcam)，β‑actin(1:1000，Proteintech)，Cleaved‑Caspase3 (1:300，affinity), Rab7(abcam, 1:500)。

[0079] 6.EDU染色

[0080] 将细胞接种在无菌玻璃盖玻片上，用4%多聚甲醛固定15分钟，然后在含有3%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次，用使用0.5% Triton X‑100破膜20min，在含有3%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次，加入Click‑iT plus反应体系，轻轻摇动确保反应混合物均匀，避光室温30min，用含有3%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤一次，加入含DAPI封片剂封片。用共焦显微镜对标记细胞进行成像。

[0081] 实施例1、过表达RABGGTB对SOD1G93A运动神经元起到保护作用

[0082] 首先，我们验证了NSC34‑E、NSC34‑hSOD1G93A细胞中内源性RABGGTA及RABGGTB表达，结果显示NSC34‑SOD1G93A细胞中内源性RABGGTA(GGTase Ⅱ的α亚基)的表达与NSC34‑E相比无明显差别，而内源性RABGGTB(GGTase Ⅱ的β亚基)的表达与NSC34‑E相比明显减少（图1）。

[0083] 然后，我们通过慢病毒转染的方式在ALS细胞模型：NSC34‑hSOD1G93A细胞中过表达RABGGTB。

[0084] 结果如图所示：与NSC34‑E相比，NSC34‑hSOD1G93A细胞活力下降，过表达RABGGTB后NSC34‑hSOD1G93A细胞CCK8数值增加，表明细胞活力明显增加（图2）。

[0085] 与NSC34‑E相比，NSC34‑hSOD1G93A细胞中cleaved caspase‑3增加，过表达RABGGTB后NSC34‑hSOD1G93A细胞中cleaved caspase‑3表达下降，说明抑制了NSC34‑hSOD1G93A细胞的凋亡（图3）。

[0086] 与NSC34‑E比较，NSC34‑hSOD1G93A细胞中EDU表达下降，NSC34‑hSOD1G93A中过表达RABGGTB后EDU上调，细胞增殖增加（图3）。

[0087] 实施例2、过表达RABGGTB减少NSC34‑SOD1G93A细胞中SOD1蛋白聚集

[0088] NSC34‑hSOD1G93A细胞模型中存在大量SOD1蛋白聚集，以往研究证实SOD1蛋白在运动神经元中异常聚集是导致神经元死亡的重要原因，与ALS发生有关。我们通过免疫荧光实验检测每组细胞中SOD1的聚集。

[0089] 结果显示，与NSC34‑E比较，NSC34‑hSOD1G93A运动神经元中存在大量聚积的SOD1，过表达RABGGTB后明显低了NSC34‑hSOD1G93A运动神经元中SOD1水平（图4），与免疫荧光结果一致，Western blotting结果显示过表达RABGGTB减少了NSC34‑hSOD1G93A细胞中SOD1聚集（图5）。

[0090] 实施例3、过表达RABGGTB改善NSC34‑hSOD1G93A细胞自噬情况

[0091] 研究报道，NSC34‑hSOD1G93A细胞存在自噬异常，导致异常聚集的SOD1蛋白无法降解，为了明确过表达RABGGRTB是否对自噬产生影响，我们通过免疫荧光及Western blotting检测了各组细胞中自噬流水平。结果显示：过表达RABGGTB可以减少NSC34‑hSOD1G93A细胞中增加了的LC3及P62的水平（图6、图7），并且改善了NSC34‑hSOD1G93A细胞中存在的自噬流障碍。

[0092] 实施例4、过表达RABGGTB可以增加NSC34‑hSOD1G93A细胞中Rab7的膜定位[0093] 自噬体与溶酶体的融合在自噬流调控过程中起着关键作用，研究结果表明Rab7在晚期自噬体成熟及自噬体与溶酶体融合过程中发挥重要作用。通过免疫荧光检测了各组细胞中Rab7的膜定位情况（图8）。过表达RABGGTB可以增加NSC34‑hSOD1G93A细胞中Rab7的膜定位，促进SOD1蛋白聚集体的自噬降解。

[0094] 本发明的研究结果首次发现在SOD1G93A的ALS疾病模型中RABGGTB表达减少导致的GGTase Ⅱ异常可能会对神经元产生毒性作用。进一步结果表明：过表达RABGGTB通过调节自噬促进异常聚集的SOD1蛋白降解，降低其对神经元的毒性作用，能够对神经元起到保护作用。因此，GGTase Ⅱ可能作为ALS的治疗靶点，并且对于研究和筛选特异性的GGTase Ⅱ激活剂或者诱导剂来治疗ALS提供依据。