一种检测粘度的近红外荧光探针及其制备和应用

摘要

本申请公开一种用于检测粘度的近红外荧光探针及其制备和应用，结构式如式(I)所示：本申请的荧光探针可用于检测溶液粘度、细胞内粘度以及制霉菌素引起的斑马鱼肠胃粘度变化。该荧光探针具有较大的斯托克位移、背景干扰低、高信噪比、对生物样品的光损伤小等优点，对粘度敏感性高，为研究细胞中粘度的生理作用提供了一种有效的研究工具；稳定性好，即使在次氯酸、硫酸氢钠、叔丁基过氧化氢、双氧水等强氧化剂干扰下其荧光强度也基本保持稳定。

权利要求

1.一种用于检测粘度的近红外荧光化合物，其特征在于，结构式如式(I)所示：

2.如权利要求1所述近红外荧光化合物的制备方法，其特征在于，包括：将化合物(II)、化合物(III)加入到溶剂乙醇中，在78℃～80℃下回流搅拌反应6～8h，反应结束后反应液分离纯化得到化合物(I)；化合物(II)、化合物(III)物质的量之比为1:1～1.2；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物(II)、化合物(III)物质的量之比为1:1.2；反应在78℃搅拌反应6h。

4.如权利要求1所述近红外荧光化合物在制备用于检测溶液或细胞内粘度的试剂或试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞为宫颈癌细胞Hela细胞。

6.如权利要求1所述近红外荧光化合物在制备用于检测斑马鱼肠胃粘度变化的试剂或试剂盒中的应用。

7.一种非诊断与治疗目的的粘度定量检测方法，其特征在于，包括：(1)将如权利要求1所述的近红外荧光化合物加入待测溶液中，混匀；

(2)在激发波长为510nm、发射波长为680nm下采集待测溶液的荧光强度，根据标准曲线计算得到待测溶液的粘度。

8.根据权利要求7所述的粘度定量检测方法，其特征在于，所述近红外荧光化合物的加入量以其在待测溶液中的终浓度与待测溶液中粘度比为0.005mM：100cP～1000cP计。

说明书

一种检测粘度的近红外荧光探针及其制备和应用

技术领域

[0001] 本申请涉及一种粘度的检测方法，特别是涉及一种检测粘度的荧光探针及其制备和应用。

背景技术

[0002] 粘度是影响几种生物过程的主要参数之一，它决定了物质的流动性和扩散控制反应的速率。在细胞内水平、粘度对质量和信号的传递以及生物大分子之间的相互作用具有很大影响。例如，在糖尿病患者中，红细胞和血小板膜的粘度可能会升高，细胞内粘度异常被认为是许多疾病和功能障碍的重要贡献者或指标。

[0003] 近年来，在细胞水平上检测微环境的粘度指标成为一个研究热点。现有荧光探针技术中，粘度探针存在数量较少，合成步骤繁琐，成本高及荧光背景高、稳定性不好等问题。

发明内容

[0004] 本申请提供一种可以用于检测粘度的高灵敏度近红外荧光化合物及其制备方法与应用，本申请的化合物用于粘度检测时稳定性好、灵敏度高。

[0005] 一种用于检测粘度的近红外荧光化合物，结构式如式(I)所示：

[0006]

[0007] 本申请还提供一种所述近红外荧光化合物的制备方法，包括：

[0008] 将化合物(II)、化合物(III)加入到溶剂乙醇中，在78℃～80℃搅拌反应6h～8h，反应结束后反应液分离纯化得到化合物(I)；化合物(II)、化合物(III)物质的量之比为1:1～1.2:0.2～0.4；

[0009]

[0010] 反应过程如下：

[0011]

[0012] 所述化合物(II)为购买所得；所述化合物(III)为公开的化合物，其制备方法可参考文献:(Li S，Wang P，Feng W，et al.Simultaneous imaging of mitochondrial viscosity and hydrogen peroxide in Alzheimer's disease by a single near‑infrared fluorescent  probe with a large Stokes shift[J].Chemical Communications,2020,56:1050‑1053)。

[0013] 可选的，所述化合物(II)、化合物(III)物质的量之比为1:1.2；反应在78℃搅拌反应6h。

[0014] 可选的，所述分离纯化方法为：：将反应液减压浓缩，通过使用二氯甲烷/甲醇(v/v，20：1)的二氧化硅柱层析进行纯化，得到化合物(I)。

[0015] 本申请还提供一种所述近红外荧光化合物在制备用于检测溶液或细胞内粘度的试剂或试剂盒中的应用。

[0016] 可选的，所述荧光探针用于测定细胞内粘度值，粘度值约为20～80cP。更为优选的，所述细胞为人宫颈癌细胞HeLa细胞。实验结果表明，化合物(I)可以检测HeLa细胞内粘度的变化，定量结果发现，空白组细胞的平均荧光强度为25.89，实验组在加入制霉菌素改变细胞内粘度之后，平均荧光强度为80.25。

[0017] 本申请还提供一种所述近红外荧光化合物在制备用于检测斑马鱼肠胃粘度变化的试剂或试剂盒中的应用。

[0018] 所述荧光探针可用于检测制霉菌素引起的斑马鱼肠胃粘度变化。实验发现，化合物(I)可以检测由制霉菌素引起的斑马鱼肠道内粘度的变化，在没有制霉菌素加入时，斑马鱼基本无荧光，当斑马鱼用制霉菌素处理后，加入化合物(I)，斑马鱼显示出明显的荧光。

[0019] 化合物(I)可作为一种检测粘度的荧光探针，其荧光性能激发为ex＝510nm，em＝680nm，具有较大的斯托克位移，具有背景干扰低、对生物样品的光损伤小等优点。其在Gly/PBS缓冲液(v/v＝9:1)中量子产率为0.16，荧光增强约100倍，可应用于粘度的荧光定量检测。

[0020] 所述的定量粘度浓度的荧光检测原理为：化合物(I)，在具有一定粘度的溶液中，会限制结构碳碳单键的旋转，从而减少探针的非辐射能量，使荧光发生turn‑on，测定在激发为510nm时，检测680nm处探针的荧光强度变化，从而获得粘度浓度。

[0021] 本申请还提供一种非诊断与治疗目的的粘度定量检测方法，包括：

[0022] (1)将如权利要求1所述的近红外荧光化合物加入待测溶液中，混匀；

[0023] (2)在激发波长为510nm、发射波长为680nm下采集待测溶液的荧光强度，根据标准曲线计算得到待测溶液的粘度。

[0024] 可选的所述近红外荧光化合物的加入量以其在待测溶液中的终浓度与待测溶液中粘度比为0.005mM：100cp～1000cp计。该配比下，荧光化合物的加入量与粘度变化具有良好的线性关系，检测的准确度高。

[0025] 本申请至少具有如下有益效果之一：

[0026] (1)化合物(I)可作为一种检测粘度的荧光探针，其荧光性能激发为ex＝510nm，em＝680nm，具有较大的斯托克位移、背景干扰低、高信噪比、对生物样品的光损伤小等优点，对粘度敏感性高，为研究细胞中粘度的生理作用提供了一种有效的研究工具。

[0027] (2)对粘度选择性好，为进一步准确研究粘度提供了一种有效的研究工具。

[0028] (3)稳定性好，即使在次氯酸、硫酸氢钠、叔丁基过氧化氢、双氧水等强氧化剂干扰下其荧光强度也基本保持稳定。

[0029] (4)本申请合成的近红外粘度荧光探针可作为新型临床诊断试剂用于对重大疾病做出早期预警，降低现代人重大疾病的发生率，符合“健康中国”战略，提高国民健康水平。

附图说明

[0030] 图1为本发明中实施例1制备的化合物(I)的核磁氢谱。

[0031] 图2为本发明中实施例1制备的化合物(I)的核磁碳谱。

[0032] 图3为本发明中实施例1制备的化合物(I)加入到PBS缓冲液和Gly/PBS缓冲液(v/v＝9:1)中的荧光吸收光谱图。

[0033] 图4为本发明中实施例1制备的化合物(I)在Gly/PBS缓冲液(v/v＝1:9至9:1)中的荧光发射光谱图(pH＝7.4)(激发波长510nm，发射波长680nm)。

[0034] 图5为本发明中实施例1制备的化合物(I)在Gly/PBS缓冲液(v/v＝1:9至9:1)中的线性关系图(pH＝7.4))(激发波长510nm，发射波长680nm)。

[0035] 图6为本发明中实施例1制备的化合物(I)在不同pH缓冲液(v/v＝1/99)条件下的荧光点状图。

[0036] 图7为本发明中实施例1制备的化合物(I)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，选择性结果的荧光图(1‑17分别为PBS、次氯酸、钙离子、锌离子、铁离子、铝离子、铜离子、镁离子、钠离子、葡萄糖、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、硫酸氢钠、叔丁基过氧化氢、双氧水、甘油；激发波长510nm，发射波长680nm)。

[0037] 图8为本发明中实施例1制备的化合物(I)在甘油/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝9/1)条件下选择性结果的荧光图(1‑17分别为PBS、次氯酸、钙离子、锌离子、铁离子、铝离子、铜离子、镁离子、钠离子、葡萄糖、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、硫酸氢钠、叔丁基过氧化氢、双氧水、甘油；激发波长510nm，发射波长680nm。)。

[0038] 图9为对比例1的化合物在甘油/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝9/1)条件下，选择性结果的荧光图(1‑17分别为PBS、次氯酸、钙离子、锌离子、铁离子、铝离子、铜离子、镁离子、钠离子、葡萄糖、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、硫酸氢钠、叔丁基过氧化氢、双氧水、甘油；激发波长470nm，发射波长670nm。)。

[0039] 图10为本发明中实施例1制备的化合物(I)的细胞成像图。

[0040] 图11为本发明中实施例1制备的化合物(I)的细胞成像图的荧光量化图。

[0041] 图12为本发明中实施例1制备的化合物(I)在制霉菌素预处理的斑马鱼中的共聚焦显微镜荧光成像图。

具体实施方式

[0042] 下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

[0043] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

[0044] 实施例1：化合物(I)的制备

[0045] 称取化合物(II)(27.4mg，0.1mmol)、化合物(III)(27.7mg，0.12mmol)加入到10mL无水乙醇溶剂中，在78℃下，回流反应6h，将反应物减压浓缩，通过使用乙酸乙酯/石油醚(v/v，1：5)的二氧化硅柱层析进行纯化，即得化合物(I)(收率60％)，其核磁氢谱参见图1，核磁碳谱参见图2。

[0046] 1H NMR(500MHz,Chloroform‑d)δ8.10–8.02(m,2H),7.88(s,1H),7.75–7.71(m,2H),7.63–7.47(m,2H),7.35–7.30(m,2H),6.78–6.71(m,2H),3.00(s,6H).

[0047] 13C NMR(126MHz,Chloroform‑d)δ158.23,152.89,135.49,127.55,126.73,125.99,123.43,121.73,112.18,23.19.

[0048] 实施例2：化合物(I)(5μM)在不同粘度溶液下的紫外‑可见光光谱测试。

[0049] 准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同粘度值的PBS缓冲液(最终粘度的值分别100cp，200cp，300cp，400cp，500cp，600cp，700cp，800cp，950cp)，在37℃下加入到96孔板中，采用多功能酶标仪测定化合物(I)的紫外吸收光谱，并绘制得光谱曲线。

[0050] 荧光图谱见图3。实验结果表明，在以510nm波长激发时，在PBS缓冲液中，化合物(I)在510nm处的吸收较弱；当缓冲液粘度较高时，化合物(I)在510nm处的吸收较强，说明探针对粘度灵敏。

[0051] 实施例3：化合物(I)的荧光强度随粘度的变化。

[0052] 准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同粘度值的PBS缓冲液(最终粘度的值分别100cp，200cp，300cp，400cp，500cp，600cp，700cp，800cp，950cp)，在37℃下加入到96孔板中，然后测定化合物(I)的荧光光谱，并做相关线性曲线。

[0053] 荧光图谱见图4和图5。数据表明，化合物(I)在510nm处激发，680nm处发射。随着缓2
冲液粘度的增加，在680nm处荧光强度提升接近100倍，同时具有良好的线性关系(R ＝
0.9784)。

[0054] 实施例4：化合物(I)(5μM)在PBS缓冲液以及PBS:甘油(v/v＝1/1)条件下，不同pH的值与荧光强度的变化点状图

[0055] 准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同pH值的PBS缓冲液以及PBS:甘油(v/v＝1/1)溶液中(使最终pH在缓冲液的值分别从2到10.5)，加入到96孔板中，统计数据，并做点状图。荧光激发波长为510nm，发射波长为680nm。

[0056] 荧光图谱见图6。数据表明，化合物(I)没有对pH的敏感性。

[0057] 实施例5：化合物(I)(5μM)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下选择性结果的荧光光谱检测

[0058] 准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.394mL，随后分别加入4μL生物相关活性小分子水溶液(1‑17分别为PBS、次氯酸、钙离子、锌离子、铁离子、铝离子、铜离子、镁离子、钠离子、葡萄糖、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、硫酸氢钠、叔丁基过氧化氢、双氧水、甘油，最终浓度均为
1mM)，37℃下测定其荧光值。荧光激发波长为510nm，发射波长为680nm。

[0059] 荧光图谱见图7。实验结果表明，除了甘油，化合物(I)在其它相关生物活性分子存在下荧光强度基本没有显著的变化，表明其抗干扰能力十分好。

[0060] 实施例6：化合物(I)(5μM)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下选择性结果的荧光光谱检测

[0061] 准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.394mL，随后分别加入4μL生物相关活性小分子水溶液(1‑17分别为PBS、次氯酸、钙离子、锌离子、铁离子、铝离子、铜离子、镁离子、钠离子、葡萄糖、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、硫酸氢钠、叔丁基过氧化氢、双氧水、甘油，最终浓度均为
1mM)，37℃下测定其荧光值。荧光激发波长为510nm，发射波长为680nm。

[0062] 荧光图谱见图8。实验结果表明，在甘油含量为90％的情况下，化合物(I)在其它相关生物活性分子存在下荧光强度基本没有显著的变化，表明其抗干扰能力十分好。

[0063] 对比例1：对比化合物(5μM)在甘油/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝9/1)条件下选择性结果的荧光光谱检测。

[0064] 对比化合物结构式：

[0065]

[0066] 准确称取一定量对比化合物，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.394mL的甘油/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝9/1)中，随后分别加入4μL生物相关活性小分子水溶液(1‑17分别为PBS、次氯酸、钙离子、锌离子、铁离子、铝离子、铜离子、镁离子、钠离子、葡萄糖、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、硫酸氢钠、叔丁基过氧化氢、双氧水、甘油，最终浓度均为1mM)，37℃下测定其荧光值。荧光激发波长为510nm，发射波长为680nm。

[0067] 荧光图谱见图9。实验结果表明，在甘油含量为90％的情况下，对比化合物在与强氧化还原剂存在的存在下荧光强度受到较大的干扰，表明其稳定性较差。

[0068] 通过对比实验发现，在甘油/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝9/1)条件下，化合物(1)的稳定性较差，而本申请的化合物(I)具有更好的稳定性。

[0069] 实施例7:化合物(I)的细胞成像图。

[0070] 准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mM的母液，移液枪吸取2μL加入到1.998mL DMEM培养基中。取1mL含有化合物(I)的培养液加入到Hela细胞中，37℃下孵化0.5h，用DMEM培养基洗涤两次，然后用商品化的制霉菌素(Nystatin)，浓度为2μM/L，
37℃下孵化20min，PBS洗涤两次，最终用Olympus Fluoview FV 1200共聚焦显微镜进行荧光成像。化合物(I)激发波长为488nm，接收波长范围为650～700nm。

[0071] 细胞共聚焦荧光成像效果图见图10，荧光量化图见图11：实验结果表明，化合物(I)可以检测Hela细胞内粘度的变化。

[0072] 实施例8:化合物(I)的斑马鱼共聚焦成像图

[0073] 首先称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚配制成浓度为10mM的母液，移液枪吸取2μL加入到1.998mL水中以配制5μM化合物(I)的水溶液。然后在受精胚胎培养3天后，随机选择约5只斑马鱼幼鱼作为一组，共两组。其中一组为空白对照，一组为实验组。空白组和对照组分别在纯水溶液和含有10uM的制霉菌素的水中37℃下孵育2小时，接着，用PBS洗涤两次，空白组和对照组都加入到5μM化合物(I)的水溶液中，37℃下孵化0.5h，用PBS洗涤两次，最终用Olympus Fluoview FV 1200共聚焦显微镜进行荧光成像，在荧光共聚焦显微镜下观察荧光变化(见图12)。化合物(I)激发波长为488nm，接收波长范围为650～700nm。

[0074] 实验结果表明，化合物(I)可以检测由制霉菌素引起的斑马鱼肠道内粘度的变化。在没有制霉菌素加入时，斑马鱼基本无荧光。当斑马鱼用10uM的制霉菌素处理后，加入化合物(I)，斑马鱼显示出明显的荧光。

[0075] 以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。