一种小红参一步成苗的组培快繁方法

摘要

本发明涉及小红参一步成苗的组培快繁方法，包括以下步骤：选择小红参带芽茎段；外植体消毒；丛生芽的诱导：将消毒完成的外植体，接种于MS为基础培养基，添加NAA0.05～0.15mg/L+ZT0.2～0.3mg/L+TDZ1.0～1.5mg/L+活性炭的培养基中；一步成苗诱导：将诱导出的丛生芽，接种于B5为基础培养基，添加IBA1.5～2.0mg/L+ZT0.03～0.06mg/L、KT1.0～2.0mg/L、多效唑0.2～0.3mg/L+活性炭的培养基中；本发明根据现有技术的不足，特发明了一种利用带芽茎段，诱导丛生芽，再通过丛生芽一步成苗，具有消毒污染率低，消毒死亡率低，褐化率低，增殖系数高，生根率高，驯化极易成活等优点，同时本发明简化了生产步骤，极大的降低了生成本，缩短了生产周期。

权利要求

1.一种小红参一步成苗的组培快繁方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）外植体选择：选择小红参带芽茎段；

（2）外植体消毒；

（3）丛生芽的诱导：将消毒完成的外植体，接种于由MS+NAA0.05～0.15mg/L +ZT0.2～

0.3mg/L +TDZ1.0～1.5mg/L +活性炭构成的培养基中；

（4）一步成苗诱导：将诱导出的丛生芽，接种于由B5 +IBA1.5～2.0mg/L+ZT0.03～

0.06mg/L+KT1.0～2.0mg/L+多效唑0.2～0.3mg/L+活性炭构成的培养基中；

（5）驯化移栽。

2.根据权利要求1所述的一种小红参一步成苗的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤（2）中外植体消毒的步骤依次为：75%酒精10～15s，饱和漂白粉溶液15～18min，0.07%升汞溶液8～9min。

3.根据权利要求1所述的一种小红参一步成苗的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤（3）中，活性炭的浓度为0.8g/L。

4.根据权利要求1所述的一种小红参一步成苗的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤（4）中，活性炭的浓度为0.6g/L。

5.根据权利要求1—4任一所述的一种小红参一步成苗的组培快繁方法，其特征在于，组培的条件为：在温度为25±2 ℃，光照强度2000～3000LX，日照光14h条件下光暗交替培养30～35天。

6.根据权利要求5所述的一种小红参一步成苗的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤（5）中，驯化移栽的方法为：将小红参生根苗，洗净基部培养基，移栽于质量比分别为6:3:1的泥炭土、蛭石、珍珠岩的混合基质中。

说明书

一种小红参一步成苗的组培快繁方法

技术领域

[0001] 本发明涉及药用植物组织培养及中药材领域，具体涉及小红参一步成苗的组培快繁方法。

背景技术

[0002] 小红参为茜草科茜草属多年生草本植物紫参（ Rubia yunnanensis Diels），是我国特有种，主产于云南各地以及四川西南部，生于海拔1700～2500米处的灌丛中、草坡或路边。小红参以干燥根和根茎入药，其具有活血通经，祛风除湿，镇静止痛的功效，主要用于月经不调，跌打损伤，胃痛，心烦失眠等症。现代中医药研究表明，小红参内含蒽醌及其苷类、乔木烷型三萜、环己肽类和蒽醌类等主要活性成分，主要具有抗癌、抗心机缺血、升高白细胞、促进呼吸细胞分泌、祛痰等活性，临床上还应用于治疗银屑病、软组织损伤、过敏性紫癜、顽固性鼻衄、神经衰弱、冠心病、心绞痛等。

[0003] 小红参药材来源主要靠野生，而野生资源存在生长年限不一致，有效成分含量不稳定，质量参差不齐等缺点。近年来随着人们对健康意识的提高，小红参需求量逐年增长，其价格亦随之上涨，导致小红参有限的野生资源被无序采挖，加之生态环境的日益破坏，使小红参野生生境亦受到严重影响，野生资源蕴藏量急剧下降。近年来部分单位及个人开始进行小红参的人工驯化栽培，但均未形成规模，究其原因，一方面受制于种苗来源，另一方面受制于基础研究较少。小红参目前的主要繁殖方式为种子繁殖和分株繁殖，而小红参充分发扬了茜草科种子育苗的通病——种子量较大，但发芽率低，而分株繁殖繁殖周期长，繁殖率低，同时，长期的分株繁殖，极易导致品种退化，极大的影响药材质量及产量。

[0004] 目前小红参虽在组培繁殖方面有一定的研究，但现有技术采取的繁育途径是通过外植体诱导愈伤组织，再通过愈伤组织增殖，最后通过愈伤分化出丛生芽后生根而得，此途径存在步骤繁琐，经过愈伤易存在变异等情况，同时现有技术亦存在增殖系数低，消毒污染率高，消毒死亡率高，褐化率高等不足。

发明内容

[0005] 本发明的主要目的是提供一种小红参一步成苗的组培快繁方法，以解决背景技术中存在的问题。

[0006] 为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 一种小红参一步成苗的组培快繁方法，包括以下步骤：

[0008] （1）外植体选择：选择小红参带芽茎段；

[0009] （2）外植体消毒；

[0010] （3）丛生芽的诱导：将消毒完成的外植体，接种于MS为基础培养基，添加NAA0.05～0.15mg/L +ZT0.2～0.3mg/L +TDZ1.0～1.5mg/L +活性炭的培养基中；

[0011] （4）一步成苗诱导：将诱导出的丛生芽，接种于B5为基础培养基，添加IBA1.5～2.0mg/L+ZT0.03～0.06mg/L、KT1.0～2.0mg/L、多效唑0.2～0.3mg/L+活性炭的培养基中[0012] （5）驯化移栽。

[0013] 进一步的，所述步骤（2）中外植体消毒的步骤依次为：75%酒精10～15s，饱和漂白粉溶液15～18min，0.07%升汞溶液8～9min。

[0014] 进一步的，所述步骤（3）中，活性炭的浓度为0.8g/L。

[0015] 进一步的，所述步骤（4）中，活性炭的浓度为0.6g/L。

[0016] 进一步的，组培的条件为：在温度为25±2 ℃，光照强度2000～3000LX，日照光14h条件下光暗交替培养30～35天。

[0017] 进一步的，所述步骤（5）中，驯化移栽的方法为：将小红参生根苗，洗净基部培养基，移栽于质量比分别为6:3:1的泥炭土、蛭石、珍珠岩的混合基质中。

[0018] 本发明的有益效果在于

[0019] 1、本发明采用带芽茎段诱导丛生芽，再通过丛生芽进行一步成苗培养，可直接获得商品苗，减少了现有技术中的愈伤分化成丛生芽，丛生芽再生根的步骤，简化了生产工艺，缩短了生产周期，同时在一定程度上降低了管理成本。

[0020] 2、本发明的一步成苗培养基，可直接用于商品苗的生产，亦可用于增殖，其30天增殖系数为8，一方面优于现有技术，而高的增殖系数可缩短生产周期，同时降低生产成本，亦能降低管理成本，同时30天的生根率为100%，是最为理想的生根技术，同时亦是目前未有相关报道的技术。

[0021] 3、本发明在一步成苗培养基中添加了0.2～0.3mg/L的多效唑，一方面有益于促进生根，另一方面有益于苗的健壮以及玻璃化苗的减少，使得瓶苗驯化成活率为97%以上，降低了实际生产应用中苗的损耗，亦是一种降低生产成本方式。

具体实施方式

[0022] 以下结合结合实施例对本发明进行进一步的说明。

[0023] 实施例1

[0024] 1、外植体的选择与清洁：选择健壮、无病虫害植株，移栽于室内花盆中，每隔3天进行一次70%多菌灵500倍液喷雾，连续喷4次，后取地上部顶端20cm内茎段，去叶后将其剪成长2～3cm带芽小段，置于肥皂液中清洗15min后，用自来水漂洗3次，再滴3滴吐温‑80，震摇12min，最后用自来水冲淋60min。

[0025] 2、外植体的消毒：将清洗完成的外植体，转移至超净工作台，用75%酒精消毒12s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒15min，无菌水涮洗3次，0.07%升汞溶液消毒8min，无菌水涮洗7次，7天消毒污染率为13.0%，30天外植体死亡率为6.4%，无褐化。

[0026] 3、丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，置于无菌滤纸上，吸去表面水分后剪去两端伤口，留1.0～1.5cm长，按极性接种于MS+NAA0.10mg/L+ZT 0.2mg/L+TDZ 1.0mg/L+活性炭0.8g/L的诱导培养基中，在温度为25±2 ℃，光照强度2000～3000LX，日照光14h条件下光暗交替培养35天。20天萌动率87.7%，35天丛生芽诱导率可达94.3%。

[0027] 4、一步成苗培养：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，按极性接种于B5+IBA 1.5mg/L+ZT 0.05mg/L+KT 1.0mg/L+多效唑 0.2mg/L+活性炭 0.6g/L的一步成苗培养基，在温度为25±2 ℃，光照强度2000～3000LX，日照光14h条件下光暗交替培养30天，生根率为100%，每株具2条根以上，根长1.3cm以上，苗鲜绿健壮。

[0028] 5、驯化移栽：将小红参生根苗，洗净基部培养基，移栽于质量比分别为6:3:1的泥炭土、蛭石、珍珠岩的混合基质中，按常规的管理方式进行管理，30天驯化成活率为97.8%。

[0029] 实施例2

[0030] 1、外植体的选择与清洁：选择健壮、无病虫害植株，移栽于室内花盆中，每隔3天进行一次70%多菌灵500倍液喷雾，连续喷3次，后取地上部顶端20cm内茎段，去叶后将其剪成长2～3cm带芽小段，置于肥皂液中清洗20min后，用自来水漂洗3次，再滴3滴吐温‑80，震摇15min，最后用自来水冲淋90min。

[0031] 2、外植体的消毒：将清洗完成的外植体，转移至超净工作台，用75%酒精消毒15s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒18min，无菌水涮洗3次，0.07%升汞溶液消毒9min，无菌水涮洗8次，7天消毒污染率为10.3%，30天外植体死亡率为9.6%，无褐化发生。

[0032] 3、丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，置于无菌滤纸上，吸去表面水分后剪去两端伤口，留1.0～1.5cm长，按极性接种于MS+NAA 0.15mg/L+ZT 0.3mg/L+TDZ 1.5mg/L+活性炭0.8g/L的诱导培养基中，在温度为25±2 ℃，光照强度2000～3000LX，日照光14h条件下光暗交替培养35天。20天萌动率88.9%，35天丛生芽诱导率可达95.7%。

[0033] 4、一步成苗培养基的增殖培养：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，按极性接种于B5+IBA 2.0mg/L+ZT 0.06mg/L+KT2.0mg/L+多效唑 0.3mg/L+活性炭 0.6g/L的一步成苗培养基，在温度为25±2 ℃，光照强度2000～3000LX，日照光14h条件下光暗交替培养30天，增殖系数可达8.3，苗鲜绿健壮，玻璃化率仅0.08%，且全部苗生根。

[0034] 5、一步成苗培养：将增殖获得的丛生芽，剪成单芽，按极性接种于B5+IBA 2.0mg/L+ZT 0.06mg/L+KT 2.0mg/L+多效唑 0.3mg/L+活性炭 0.6g/L的一步成苗培养基，在温度为25±2 ℃，光照强度2000～3000LX，日照光14h条件下光暗交替培养30天，生根率为100%，每株具2条根以上，根长1.6cm以上，苗鲜绿健壮。

[0035] 6、驯化移栽：将小红参生根苗，洗净基部培养基，移栽于质量比分别为6:3:1的泥炭土、蛭石、珍珠岩的混合基质中，按常规的管理方式进行管理，30天驯化成活率为98.9%。

[0036] 对比例

[0037] 按照专利小红参组织培养方法（专利号：CN200810058874.7）说明书中具体实施方式中的组培方法进行培养，对比实施例1、2，其结果如表1所示：

[0038]

[0039] 由此可知，本发明的小红参组织培养方法可以显著降低消毒污染率、消毒死亡率、褐化率以及玻化率，提高增殖系数、生根率以及驯化成活率。同时减少了愈伤分化这一步骤，简化了生产工艺。