一种基于激光液相辐照制备氧化铈纳米酶的方法及应用

摘要

本发明属于纳米酶催化抗菌技术领域，具体涉及一种基于激光液相辐照制备氧化铈纳米酶的方法及应用。本发明制备方法包括以下步骤：(1)将银纳米粒子和氧化铈纳米粒子分散在液相溶剂中，得到胶体悬浮液；(2)采用激光束辐照所述悬浮液，使银纳米粒子和氧化铈纳米粒子焊接为复合纳米粒子，离心分离、清洗干燥后，即可得到所述氧化铈纳米酶。本发明采用银纳米粒子负载到氧化铈纳米粒子上制备银‑氧化铈纳米复合材料，不仅提高了氧化铈纳米粒子的可见光响应能力，也引入了银纳米粒子作为新的活性中心，增强了氧化铈纳米粒子的催化活性，将其应用于抗菌领域，抗菌率高达80％以上，具有极强的抗菌作用。

权利要求

1.一种基于激光液相辐照制备氧化铈纳米酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将银纳米粒子和氧化铈纳米粒子分散在液相溶剂中，得到胶体悬浮液；所述银纳米粒子和氧化铈纳米粒子的质量之比为（1‑2）：（1‑4）；

（2）采用激光束辐照所述悬浮液，使银纳米粒子和氧化铈纳米粒子焊接为复合纳米粒子，离心分离、清洗干燥后，即可得到所述氧化铈纳米酶；

所述激光束辐照为：采用一束532 nm的激光，激光束直径为8 mm，激光脉冲宽度为8 ns，重复频率为10 Hz，激光能量为300 mJ，采用非聚焦辐照胶体悬浮液15 min。

2.根据权利要求1所述的制备氧化铈纳米酶的方法，其特征在于，步骤（2）中激光束辐照所述悬浮液对所述悬浮液进行振荡，所述振荡为磁力搅拌或超声振荡。

3. 根据权利要求1或2所述制备氧化铈纳米酶的方法制备而成的氧化铈纳米酶在制备抗菌材料中的应用；所述氧化铈纳米酶在光照射激发生成活性氧，活性氧能够破坏细菌生物结构实现抗菌；所述光的波长大于 420 nm，光的照射时间为1h以上，光的功率为150 W以上。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细菌为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。

说明书

一种基于激光液相辐照制备氧化铈纳米酶的方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于纳米酶催化抗菌技术领域，具体涉及一种基于激光液相辐照制备氧化铈纳米酶的方法及应用。

背景技术

[0002] 在生物医学中，纳米酶(nanozyme)是一类具有酶样功能的纳米材料，它不仅具有纳米材料所固有的光、电、磁学性质，而且表现出优异的催化性能。与传统的生物酶相比，它具有易制备、成本低、稳定性好、尺寸可控等优点，在催化抗菌、免疫检测以及肿瘤组织的光热治疗、光动力学治疗、光催化治疗等疗法中应用广泛。其中，用于催化抗菌的纳米酶，又称纳米酶抑菌剂，它通过光照在其表面环境中激发出大量的活性氧，活性氧具有极强的氧化还原能力，能够作用于细菌的细胞膜、蛋白质、遗传物质等，使其迅速凋亡，以达到抗菌的目的。目前，常用的纳米酶抑菌剂主要包括金属氧化物、金属基化合物、碳基纳米材料、过渡金属硫化物、单原子催化剂以及金属基有机框架材料等，涵盖的催化类型包括氧化酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等。

[0003] 氧化铈(CeO2)作为一种稀土金属氧化物，以其所特有的循环型过氧化物酶功能，4+
近年来在生物医学、环境微生物净化等催化抗菌领域中备受关注。特别是，氧化铈中Ce 和
3+
Ce 的可逆转换，赋予了其表面丰富的氧空位，有利于形成良好的氧化还原能力。但是，当前催化抗菌技术均是在可见光驱动下进行的。倘若利用紫外光照射，在实现杀菌效果的同时，也会对生物组织及周围环境造成严重损伤，不利于实际应用，因此可见光光催化抗菌剂为行业所接受，并且已形成行业标准(标准编号：T/CBMF 70‑2019，发布日期：2019年12月4日)。然而，氧化铈的禁带宽度在2.9‑3.2eV之间，在光催化过程中，仅对紫外光敏感，而对可见光的响应较弱。因此，在可见光驱动下形成的电子‑空穴对具有较高的载流子复合率，不
4+ 3+
利于Ce 和Ce 可逆转换的持续进行。为提高氧化铈的可见光光催化抗菌性能，需对其进行表面改性或修饰，负载具有较强可见光响应能力的材料。

[0004] 当前，构建贵金属‑半导体纳米复合材料被认为是一种提高可见光光催化性能的有效策略。一方面，贵金属具有较宽的可见光响应范围；另一方面，贵金属释放的金属离子有利于细菌细胞膜的破损和蛋白质结构的失活变性。本发明的早先申请CN106041060B一种在液相中采用激光焊接制备纳米复合材料的方法，具体公开了纳米悬浊液制备步骤，将纳米颗粒状的原材料均匀分散在液体媒介中，形成纳米悬浊液；激光焊接步骤，向所述纳米悬浊液中引入设定波长、设定功率的激光，并持续设定时间，以执行激光焊接，所述激光焊接过程中，持续搅拌所述纳米悬浊液；分离步骤，分离出执行完激光焊接步骤的产物，干燥获得复合纳米材料。该技术方案使用了碳材料包覆和液相添加剂利用激光液相辐照加热的制备纳米材料，并没有涉及提高氧化铈纳米粒子的可见光响应能力，更加没有涉及将氧化铈纳米粒子作为纳米酶应用于可见光光催化抗菌领域，还存在进一步研究的空间。

[0005] 综述所述，现有技术仍缺乏应用于可见光光催化抗菌的高活性氧化铈纳米酶。

发明内容

[0006] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种基于激光液相辐照制备氧化铈纳米酶的方法及应用，其目的在于在现有技术的基础之上，以银纳米粒子和氧化铈纳米粒子作为前驱材料，以氧化铈纳米粒子作为载体，以银纳米粒子作为负载，将银纳米粒子负载在氧化铈纳米粒子上，制备高的光催化抗菌活性的纳米复合材料。

[0007] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种基于激光液相辐照制备氧化铈纳米酶的方法，包括以下步骤：

[0008] (1)将银纳米粒子和氧化铈纳米粒子分散在液相溶剂中，得到胶体悬浮液；

[0009] (2)采用激光束辐照所述悬浮液，使银纳米粒子和氧化铈纳米粒子焊接为复合纳米粒子，离心分离、清洗干燥后，即可得到所述氧化铈纳米酶。

[0010] 作为优选，所述银纳米粒子和氧化铈纳米粒子的质量之比(1‑2)：(1‑4)。

[0011] 作为优选，步骤(2)中激光束辐照所述悬浮液对所述悬浮液进行振荡，所述振荡为磁力搅拌或超声振荡。

[0012] 按照本发明的另一方面，提供了一种所述制备氧化铈纳米酶的方法制备而成的氧化铈纳米酶作为抗菌材料的应用。

[0013] 作为优选，包括以下步骤：

[0014] (S1)于细菌悬浮液中，加入纳米酶；

[0015] (S2)使用光照射菌悬液，使得氧化铈纳米酶激发生成活性氧，进行光催化抗菌实验。

[0016] 作为优选，所述细菌为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。

[0017] 作为优选，所述光的波长大于420nm，光的照射时间为1h以上，光的功率为150W以上。

[0018] 本发明的有益效果有：

[0019] (1)本发明采用银‑氧化铈纳米复合材料作为纳米酶，具有优异的可见光响应能力，将其应用于抗菌领域，抗菌率高达80％以上，具有极强的抗菌作用。

[0020] (2)本发明采用激光液相辐照加热的方式制备银‑氧化铈纳米复合材料，无需长时间的前期化学过程准备，无需有毒化学试剂，制备方法简单、环保，制备过程可控，可规模化生产。

[0021] (3)本发明采用银纳米粒子负载到氧化铈纳米粒子上制备银‑氧化铈纳米复合材料，不仅提高了氧化铈纳米粒子的可见光响应能力，也引入了银纳米粒子作为新的活性中心，增强了氧化铈纳米粒子的催化活性。

[0022] (4)本发明采用银纳米粒子作为负载，与同类贵金属钯、金、铂等相比，具有较低的成本。在生物医学、环境微生物净化等催化抗菌领域中有着非常广阔的应用前景。

附图说明

[0023] 图1是实施例1制备所述氧化铈纳米酶的TEM图。

[0024] 图2是实施例1制备所述氧化铈纳米酶的HAADF图和EDS能谱图，其中，图2中的(a)为杂化区域的分布HAADF图；图2中的(b)为与HAADF图相对应的全元素Mapping图；图2中的(c)为(b)中任意选取区域Area#1的能谱图；图2中的(d)为氧元素Mapping图；图2中的(e)为铈元素Mapping图；图2中的(f)为银元素Mapping图。

[0025] 图3是实施例1制备所述氧化铈纳米酶的XRD图。

[0026] 图4是应用实施例1和对比实施例1‑6的抗菌实验图。

[0027] 图5应用实施例1和对比实施例1‑6的菌落数统计直方图。

[0028] 图6应用实施例1和对比实施例1‑6的光催化抗菌率直方图。

具体实施方式

[0029] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

[0030] 实施例

[0031] 实施例1：银‑氧化铈纳米复合材料的激光液相辐照制备

[0032] (1)前驱材料及液相溶剂准备：商用的银纳米粒子由Sigma‑Aldrich公司提供，氧化铈纳米粒子由上海麦克林生化科技有限公司提供，用于前驱材料分散的乙醇溶剂由国药集团化学试剂有限公司提供。

[0033] (2)胶体悬浮液制备：用移液枪转移20mL乙醇溶剂置于25mL容量的试剂瓶中，用电子天平分别称取5mg的银纳米粒子和5mg的氧化铈纳米粒子，并将其分散在所述的乙醇溶剂中，形成胶体悬浮液。

[0034] (3)超声振荡：将胶体悬浮液置于超声锅中超声振荡30min，使其分散均匀。

[0035] (4)激光辐照：打开一台Nd:YAG激光器，使其输出一束532nm的激光，激光束直径为8mm，激光脉冲宽度为8ns，重复频率为10Hz，将激光能量调至300mJ，非聚焦辐照胶体悬浮液
15min，在激光辐照的同时，对悬浮液进行超声振荡，以防胶体纳米粒子重力沉降。

[0036] (5)产物分离：将激光辐照后的胶体悬浮液转入离心管，用离心机对其进行离心分离，离心后用移液枪移去上清液，然后加入去离子水对产物进行洗涤，干燥后即得到所述氧化铈纳米酶。

[0037] 实施例2

[0038] 本实施例与实施例1不同之处在于，步骤(2)中银纳米粒子和氧化铈纳米粒子的质量不同，具体为用电子天平分别称取2mg的银纳米粒子和8mg的氧化铈纳米粒子，并将其分散在所述的乙醇溶剂中，形成胶体悬浮液。

[0039] 测试实施例

[0040] 图1为实施例1制备所述氧化铈纳米酶的TEM图。

[0041] 由图1可知，经过激光液相辐照之后，银纳米粒子成功负载在块状的氧化铈纳米粒子表面。

[0042] 图2为实施例1制备所述氧化铈纳米酶的HAADF图和EDS能谱图，其中，图2中的(a)为杂化区域的分布HAADF图；图2中的(b)为与HAADF图相对应的全元素Mapping图；图2中的(c)为(b)中任意选取区域Area#1的能谱图；图2中的(d)为氧元素Mapping图；图2中的(e)为铈元素Mapping图；图2中的(f)为银元素Mapping图。

[0043] 其中，(a)所述的HAADF图清楚展示了杂化区域的分布；(b)所述的EDS能谱图，展示了与HAADF区域相对应的混合型氧(O)元素、银(Ag)元素、铈(Ce)元素的区域分布，由此可以区分出图2所述的TEM图中银和氧化铈成分的位置；(c)所述的能谱图为(b)中任意选取的Area#1区域的元素分布情况，可见氧(O)元素、银(Ag)元素、铈(Ce)元素的信号均可观察到(特别地，铜(Cu)元素的信号来自于承载测试样品的铜网)，表明了杂化的银‑氧化铈纳米复合材料已成功制备。(d)‑(f)分别为各自独立的氧(O)元素、铈(Ce)元素、银(Ag)元素分布情况，可见氧(O)元素、铈(Ce)元素分布区域一致，它们来自于氧化铈；银(Ag)元素分布情况与两者类似。

[0044] 图3为实施例1制备所述氧化铈纳米酶的XRD图。

[0045] 由图3可知，对于银纳米粒子，对应于2倍衍射角的38.1°、44.3°、64.4°、77.4°以及81.5°衍射峰均可观察到，与标准的JCPDS数据卡片(PDF：00‑004‑0783)相比较，证实了它们分别对应于银的(111)、(200)、(220)、(311)以及(222)晶格平面；对于氧化铈纳米粒子，对应于2倍衍射角的28.6°、33.1°、47.6°、56.4°、59.2°、69.5°、76.8°、79.2°以及88.6°衍射峰均可观察到，与标准的JCPDS数据卡片(PDF：03‑065‑5923)相比较，证实了它们分别对应于银的(111)、(200)、(220)、(311)、(222)、(400)、(331)、(420)以及(422)晶格平面；对于所制备的银‑氧化铈纳米复合材料，其衍射峰中涵盖了所述银纳米粒子、氧化铈纳米粒子的衍射峰，表明了银、氧化铈的成分包含其中，进一步说明了银‑氧化铈纳米复合材料，即氧化铈纳米酶得以成功制备。

[0046] 应用实施例

[0047] 将氧化铈纳米酶应用于抗菌领域，包括以下步骤：

[0048] (S1)于细菌悬浮液中，加入纳米酶；

[0049] (S2)使用光照射菌悬液，使得氧化铈纳米酶激发生成活性氧，进行光催化抗菌实验。

[0050] 作为优选的实施例，所述细菌为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。

[0051] 作为优选的实施例，所述光的波长大于420nm，光的照射时间为1h以上，光的功率为150W以上。

[0052] 应用实施例1将实施例1制备的氧化铈纳米酶应用于金黄色葡萄球菌抗菌，包括以下步骤：

[0053] (1)LB培养基的配制：用电子天平称取10mg营养琼脂置于锥形瓶中，加入200mL去离子水并超声使其溶解，用氢氧化钠调节其pH值在7.2至7.4之间，即可得到固体培养基；在0.1MPa、120℃的条件下灭菌后倒入平板中，制成LB板，放置于冰箱备用。用电子天平称取酵母浸粉0.6g，氯化钠1.2g和胰蛋白胨1.2g置于锥形瓶中，加入120mL去离子水并超声使其溶解，同样用氢氧化钠调节其pH值在7.2至7.4之间，即可得到液体培养基，在相同条件下灭菌后置于冰箱中备用。所用玻璃仪器均在高压灭菌锅中灭菌备用。

[0054] (2)菌悬液的配制：以0代的金黄色葡萄球菌冻干粉为菌种(S.aureus，标物编号：CMCC(B)26003)，将接种环灭菌后挑取金黄色葡萄球菌冻干粉，在固体培养基上画三线，然后在37℃恒温生化培养箱中培养12至24h，用酒精灯烧过的接种环挑取三线中的单菌落，加入10mL的液体培养基中，放置于37℃恒温振荡器中振荡12h，得到OD值为2.488的菌悬液。

[0055] (3)菌悬液的稀释：取5mL的所述菌悬液于离心管中，放置在离心机中6000r/min离心15min，用移液枪取出上清液，用pH为4.5的醋酸钠缓冲溶液洗涤菌悬液2次，此时菌悬液9
浓度为10 CFU/mL，用醋酸钠缓冲溶液对菌悬液进行逐级稀释，使最终的菌悬液浓度为
5
10CFU/mL。

[0056] (4)加酶、光照与铺板：用电子天平称取0.01mg的纳米酶抑菌剂于离心管中，往上5
述含有纳米酶的离心管中分别加入1mL浓度为10 CFU/mL的菌悬液，充分振荡使其混合均匀。采用150W的LED可见光灯(波长范围：λ>420nm)对其进行1h照射，随后取20μL混合液于LB板固体培养基上进行均匀涂布，将固体培养基放置于37℃恒温生化培养箱中过夜培养12h，并观察菌落的生长情况，计算LB板上的菌落数，并与同等条件下空白的组别进行对照。为便于抗菌效果比较，同等条件下未经可见光照射的抗菌实验一并开展。

[0057] 对比实施例1

[0058] 空白，即不含纳米酶抑菌剂。

[0059] 对比实施例2

[0060] 原始银，即0.01mg的银纳米粒子。

[0061] 对比实施例3

[0062] 激光银，即0.01mg经激光液相辐照后的银纳米粒子。

[0063] 对比实施例4

[0064] 原始氧化铈，即0.01mg的氧化铈纳米粒子。

[0065] 对比实施例5

[0066] 激光氧化铈，即0.01mg经激光液相辐照后的氧化铈纳米粒子

[0067] 对比实施例6

[0068] 原始银‑氧化铈，即0.005mg银纳米粒子和0.005mg氧化铈纳米粒子混合物。

[0069] 本发明对比实施例1‑6经激光液相辐照的条件均一致。

[0070] 将应用实施例1和对比实施例1‑6进行抗菌效果测试。

[0071] 图4是应用实施例1和对比实施例1‑6的抗菌实验图。

[0072] 图5应用实施例1和对比实施例1‑6的菌落数统计直方图。

[0073] 图6应用实施例1和对比实施例1‑6的光催化抗菌率直方图。所述光催化抗菌率，是指该种纳米酶抑菌剂在无光照条件下的菌落数和有光照条件下菌落数的差值与无光照条件下菌落数比值的百分数。

[0074] 从图4和图5可以得出，光照条件下，经激光液相辐照加热制备的所述银氧化铈纳7
米复合材料，作为纳米酶抑菌剂呈现出最少的菌落数，约为0.39×10 CFU/mL。由图6可知，经激光液相辐照加热制备的所述银氧化铈纳米复合材料，其所对应的光催化抗菌率高达
82.4％，分别是同等条件下银纳米粒子和氧化铈纳米粒子的2.54倍和2.71倍，表明了所述纳米酶具有优异的抗菌性能，在催化抗菌领域中有着潜在的应用。

[0075] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。