一种用于抑制血小板活化的药物及其应用转让专利
申请号 : CN202111630800.8
文献号 : CN114191427B
文献日 : 2022-09-02
发明人 : 卞敬琦 , 康宇红 , 公雨欣 , 冯月男 , 张玉昆
申请人 : 黑龙江中医药大学
摘要 :
本发明涉及一种用于抑制血小板活化的药物及其应用，所述药物的活性成分选自补骨脂酚和/或补骨脂二氢黄酮甲醚。本发明通过实验首次证明了补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚具有抑制血小板活化的作用，特别是补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚的组合对于抑制血小板活化具有协同作用。本发明的上述发现对于开发抑制血小板活化的药物提供了新的方向。
权利要求 :
1.一种用于抑制血小板活化的药物在制备抑制血小板活化的药物中的应用，所述药物的活性成分为补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚的组合，所述补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚的摩尔比为0.8‑1.2：0.8‑1.2，所述药物不含有其它活性成分。
2.根据权利要求1所述的应用，所述补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚的摩尔比为1：1。
3.根据权利要求1或2所述的应用，所述药物还含有药学上可接受的辅料。
4.权利要求1‑3任意一项所述药物在体外抑制血小板活化的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述应用还包括抑制血小板CD62p和PAC‑1表达以及CD62p和PAC‑1的再表达。
说明书 :
一种用于抑制血小板活化的药物及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于抑制血小板活化的药物及其应用。
背景技术
[0002] 近年来，对不稳定性心绞痛(UA)的发病机制研究日益深入，普遍认为，UA患者血管内皮损伤与血小板活化在其发生和发展中具有重要意义。在本申请发明人的前期工作中，研究了活骨丹胶囊对实验大鼠激素性股骨头坏死模型的血液流变学、血脂、血钙、骨代谢等指标的影响、方法：取清洁级健康SD大鼠60只，雌雄各30只，按体重随机分成空白组、模型组、阳性对照药仙灵骨葆胶囊组(0.28g.kg‑1)，活骨丹胶囊高、中、低剂量组(1.80、0.90、‑10.45g.kg )。除空白组外，各组每周1次大腿内侧im醋酸泼尼松龙(24.5mg.kg‑1)，连续8周造模，在造模的同时，各给药组均灌胃给药，模型组和空白组给予等量蒸馏水，预防性灌胃给药8周后取血测定大鼠全血粘度、血浆粘度、血沉K值、血清总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)的含量、血清碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、血钙(Ca)、血磷(P)的含量。结果：与空白组比较，模型组中高、中、低各组切变率下的全血粘度均显著升高(P<0.01)，血沉K值及血浆粘度均显著升高(P<0.01)，血清中CHO、TG、ALP的含量均显著升高(P<0.01)，血清Ca含量升高(P<0.05)。与模型组比较，活骨丹胶囊各剂量组可明显增加血清中的Ca、P含量，同时降低ALP和ACP的活性、降低全血粘度、血浆粘度及血脂、差异有显著性意义(P<0.05，P<0.01)。结论：活骨丹对于骨质破坏所引起的ALP、ACP升高有一定的拮抗作用，同时能降低血脂、调节血清中的Ca、P沉积、加骨密度。
[0003] 此外，本申请发明人在“刺五加现代药理作用研究概述”还公开了刺五加能从而促进血液流动，防止红细胞及血小板聚集，使脑血栓得以消除。降低血管阻力，从而改善脑血液循环，刺五加含有黄酮类物质，黄酮能扩张血管，增加血流量。对中枢神经系统具有兴奋和抑制的双向调节平衡的作用，能抗炎、抗应激、增加组织对缺氧的耐受性、能清除自由基、能保护损伤再灌注的损害。近期研究发现刺五加还具有抗抑郁的作用。刺五加具有多种药理作用。
[0004] 由此可见，中药对于血小板的作用已经被诸多文献所报道，但是，如何从中药中获取单体成分，使其能够发挥抑制血小板活化的作用，避免中药组方复杂，难以控制药物品质的缺陷，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
[0005] 已知，植酸钠和百维利肽体外抑制血小板活化的实验研究(刘景汉等，中国输血杂志,2007,20(3)：182‑186)公开了1mmol/L的植酸钠可抑制血小板GPⅡb/Ⅲa构象的改变,并保留血小板的部分凝集和再表达功能；1μmol/L的百维利肽可作用于凝血酶的激活途径,抑制血小板激活,且能部分保留血小板的再表达和聚集功能,适当减少其作用浓度会对血小板有更好的功能保护效果。
[0006] 已知，HPLC法同时测定中药补骨脂中10种成分的含量(樊玲，秋新松，高阳，等.齐齐哈尔医学院学报，2018，39(16)：4.)公开了建立HPLC法同时测定补骨脂中补骨脂素，异补骨脂素，新补骨脂异黄酮，补骨脂二氢黄酮，补骨脂宁，补骨脂定，异补骨脂查尔酮，补骨脂二氢黄酮甲醚，CorylifolA和补骨脂酚含量。本申请的发明人以中药补骨脂作为研究对象，出人意料的发现其中部分成分具有抑制血小板活化的活性，从而完成了本发明。
发明内容
[0007] 基于上述背景技术，本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于抑制血小板活化的药物及其应用。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：
[0008] 本发明一方面涉及一种用于抑制血小板活化的药物，其特征在于所述药物的活性成分选自补骨脂酚和/或补骨脂二氢黄酮甲醚。
[0009] 在本发明中，所述补骨脂二氢黄酮甲醚(又名甲基补骨脂黄酮A)，其结构式如下式(I)，已知其在体外和体内有较强的抗血管生成活性，但其能够已知血小板活化的活性尚未有文献报道。
[0010]
[0011] 在本发明中，所述补骨脂酚又称破故纸酚，动物实验认为其对小鼠肾脏损害有较强的选择性，可试用制造肾炎模型仁具有细胞毒活性，为临床治疗鸡眼的有效成分，其结构式如下式(II)所示。
[0012]
[0013] 在本发明的一个优选实施方式中，所述药物含有或者不含有其它活性成分。
[0014] 在本发明的另一个优选实施方式中，所述药物的活性成分为补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚的组合。
[0015] 在本发明的一个优选实施方式中，所述补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚的摩尔比为0.8‑1.2：0.8‑1.2；优选为1：1。
[0016] 在本发明的另一个优选实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的辅料。
[0017] 本发明另一方面还涉及上述药物的应用，所述应用是指在制备抑制血小板活化的药物中的应用，例如，所述药物可用于治疗不稳定性心绞痛。
[0018] 本发明另一方面还涉及上述药物在体外抑制血小板活化的应用；优选地，所述应用还包括抑制血小板CD62p和PAC‑1表达以及CD62p和PAC‑1的再表达。
[0019] 有益效果
[0020] 本发明通过实验首次证明了补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚具有抑制血小板活化的作用，特别是补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚的组合对于抑制血小板活化具有协同作用。本发明的上述发现对于开发抑制血小板活化的药物提供了新的方向。
附图说明
[0021] 图1为示出补骨脂酚对血小板的抑制的图；
[0022] 图2为示出补骨脂二氢黄酮甲醚对血小板的抑制的图；
[0023] 图3为示出补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚的组合对血小板的抑制的图。
具体实施方式
[0024] 为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025] 如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
[0026] 实施例1：
[0027] 1.1血小板来源
[0028] 2021年3月的5名无偿献血者采全血200ml/人(献血者献血前1d均未饮含酒精类饮料，前2周内未服用阿司匹林等抗血小板及抗凝血的药物)；采用手工法立即将新鲜全血分离制备成新鲜富含血小板血浆(fresh platelet rich plasma，FPRP)取5份(30ml/份)备用。
[0029] 1.2实验方法
[0030] 设9个实验组、1个对照组(此10组依次加入海藻糖等保护剂)和未作任何处理的FPRP组。前3个实验组加入补骨脂二氢黄酮甲醚，终浓度依次为1、2、3mmol/L，中间3个实验组加入补骨脂酚，终浓度依次为1、2、3mmol/L，后三个实验组加入摩尔比为1：1的补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚的组合物，终浓度也依次为1、2、3mmol/L；经37℃水浴4h后离心重悬等处理，测定以下指标。
[0031] 1.2.1血小板聚集试验
[0032] 各诱导剂的作用浓度，凝血酶1IU/ml，ADP225μmol/L，丙酸酯50μmol/L；以血小板6
(250‑300)×10/ml的FPRP为0，以乏血小板血浆(poor platelet plasma，PPP)为100，正常
6
对照FPRP[(250—300)×10 /ml]的反应体积250μl，将血小板悬液离心(3000rpm5min)，用
6
原血浆重悬血小板，把血小板调至(200‑300)×10/m1，取225μl孵育至37℃后加入诱导剂，立即记录聚集曲线及血小板最大聚集率(PAgT)，计算药物对血小板的聚集抑制率：
(250‑300)×10/ml的FPRP为0，以乏血小板血浆(poor platelet plasma，PPP)为100，正常
6
对照FPRP[(250—300)×10 /ml]的反应体积250μl，将血小板悬液离心(3000rpm5min)，用
6
原血浆重悬血小板，把血小板调至(200‑300)×10/m1，取225μl孵育至37℃后加入诱导剂，立即记录聚集曲线及血小板最大聚集率(PAgT)，计算药物对血小板的聚集抑制率：
[0033] 聚集抑制率＝(对照血小板聚集率‑实验血小板聚集率)/对照血小板聚集率×100％
[0034] 1.2.2血小板活化检测
[0035] 用三色流式分析方法(FACs)检测血小板CD62p和PAC‑1表达，取10μlPRP(100×3
10/μl)加入荧光素标记的抗血小板单克隆抗体，室温避光反应20min，立即加入1ml1％多聚甲醛(2～6℃)混匀，4℃保存，24h内上机检测。以SSC和FSC设门，然后以CD61表达和SSC为条件获取10,000个血小板(300/s)作FL1(PAC‑1‑FITC)和FL2(CD62p‑PE)双参数分析。
10/μl)加入荧光素标记的抗血小板单克隆抗体，室温避光反应20min，立即加入1ml1％多聚甲醛(2～6℃)混匀，4℃保存，24h内上机检测。以SSC和FSC设门，然后以CD61表达和SSC为条件获取10,000个血小板(300/s)作FL1(PAC‑1‑FITC)和FL2(CD62p‑PE)双参数分析。
[0036] 1.2.3血小板CD62p和PAC‑1再表达功能检测
[0037] 根据前述建立测定模式后，测定血小板在凝血酶激活前后CD62p和PAC‑1的表达，CD62p和PAC‑1再表达率作为评价血小板反应性的指标：
[0038] 血小板再表达率＝凝血酶处理后表达率‑血小板表达率
[0039] 1.2.4血小板促凝血活性测定
[0040] 采用玻片检测血小板聚集时间(SPAT)法，在1个塑料片上加100μl丙酸酯，再加100μl FPRP混合后计时检测，以秒(s)为单位，PPP为空白对照，PRP为正常对照。
[0041] 1.3结果
[0042] 1.3.1血小板聚集功能
[0043] 实验结果参见表1和图1‑3。体外处理过程对凝血酶、ADP和丙酸酯诱导的血小板聚集无抑制作用，补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚显著抑制凝血酶、ADP和丙酸酯诱导的血小板聚集，且抑制作用随浓度递增，特别是，补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚的组合对于凝血酶、ADP和丙酸酯诱导的血小板聚集的抑制作用更加明显。
[0044] 表1补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚对血小板最大聚集率的影响(％)[0045]
[0046] 1.3.2血小板表面CD62p、PAC‑1表达
[0047] 实验结果参见表2。FPRP经过冻干前处理，血小板CD62p和PAC‑1表达均显著增加。补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚对CD62p表达呈抑制作用，随浓度变化不明显。
[0048] 表2血小板表面CD62p、PAC‑1表达情况
[0049]
[0050] 1.3.3血小板膜表面CD62p、PAC‑1再表达率
[0051] 实验结果参见表3。实验结果显示补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚抑制血小板CD62p和PAC‑1表达，不同浓度补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚对血小板凝血酶处理后血小板CD62p和PAC‑1再表达率均随抑制剂浓度递增呈下降趋势，其中，补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚的组合抑制能力显著高于单独的补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚，提示补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚的组合对于抑制CD62p和PAC‑1的表达和再表达具有协同增效作用。
[0052] 表3 CD62p和PAC‑1的再表达率
[0053]
[0054]
[0055] 1.3.4血小板聚集功能
[0056] 实验结果参见表4，实验结果显示处理后血小板聚集时间未见延长，(1‑2)mmol/L时补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚显著延长血小板聚集时间，当补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚的组合≥3mmol/L时，血小板不聚集。
[0057] 表4补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚对血小板聚集功能的影响
[0058]
[0059]
[0060] 以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。