一种温敏凝胶材料组合及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种温敏水凝胶材料组合及其制备方法和应用，属于再生医学技术领域。本发明提供的温敏凝胶材料组合，包括负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液和负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液。本发明旨在开发一种负载有能促进细胞迁移相关生物因子的温敏可注射的双层水凝胶，用以促进牙周组织的再生。

权利要求

1.一种温敏凝胶材料组合，其特征在于，包括负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液和负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液；

(1)将壳聚糖与乙酸溶液混合，得到壳聚糖溶液；

(2)将β‑甘油磷酸盐二钠和透明质酸混合溶于水，得到透明质酸溶液；

(3)将壳聚糖溶液与透明质酸溶液混合，得到壳聚糖透明质酸溶液；

(4)将SDF‑1与40～60％体积的壳聚糖透明质酸溶液混合，得到负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液；

(5)将40～60％体积的壳聚糖透明质酸溶液与1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺混合，再加入Apt19S适配体，得到负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液。

2.如权利要求1所述的温敏凝胶材料组合，其特征在于，所述负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液和负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液为独立包装；所述温敏凝胶材料组合由溶液态转化为凝胶态的温度为36～38℃。

3.一种温敏凝胶材料组合的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将壳聚糖与乙酸溶液混合，得到壳聚糖溶液；

(2)将β‑甘油磷酸盐二钠和透明质酸混合溶于水，得到透明质酸溶液；

(3)将壳聚糖溶液与透明质酸溶液混合，得到壳聚糖透明质酸溶液；

(4)将SDF‑1与40～60％体积的壳聚糖透明质酸溶液混合，得到负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液；

(5)将40～60％体积的壳聚糖透明质酸溶液与1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺混合，再加入Apt19S适配体，得到负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸溶液的浓度为0.08～0.12M，所述壳聚糖与乙酸溶液的质量体积比为28～32mg:0.8～1.2mL。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述β‑甘油磷酸盐二钠、透明质酸和水的质量体积比为55～65mg:0.8～1.2mg:0.05～0.15mL。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液中SDF‑1的浓度为180～230ng/mL。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺和壳聚糖透明质酸溶液的质量体积比为15～25mg:8～12mg:0.8～1.2mL。

8.如权利要求3～7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液中Apt19S适配体的浓度为1.5～2.5nmol/mL。

9.一种权利要求1或2所述的温敏凝胶材料组合在制备牙周组织再生支架中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述牙周组织再生支架为双层凝胶结构；

所述双层凝胶结构中，由负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液形成的SDF‑1凝胶体与由负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液形成的Apt19S凝胶体紧密贴合，形成贴合面；

所述SDF‑1凝胶体与贴合面相对的面贴近牙周膜，所述Apt19S凝胶体与贴合面相对的面贴近牙槽骨。

说明书

一种温敏凝胶材料组合及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及再生医学技术领域，尤其涉及一种温敏凝胶材料组合及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 慢性牙周炎是临床常见的以牙周支持组织进行性破坏为主要病理变化的一种慢性炎症性疾病，严重时可导致牙齿松动甚至缺失。现有的龈上洁治术、龈下刮治术等治疗手段仅能控制疾病的进展，而不能重建已破坏的牙周组织。因此，许多学者期望采用组织工程的手段来实现牙周组织的再生，为治疗慢性牙周炎提供一种新思路。

[0003] 种子细胞作为组织工程的三要素之一，是组织再生的基本条件。然而，采用异体细胞体外培养后再植入的方式往往会导致机体的免疫反应，影响最终的再生修复效果。并且，体外培养再植入的工序复杂、成本高昂。所以内源性再生促进牙周组织修复获得了越来越多的关注。内源性再生，即通过趋化因子招募自身的干细胞至牙周缺损部位并促进其增殖、分化，有望为牙周生理性、功能性重建提供新策略。牙周组织至少包括牙骨质、牙周膜以及牙槽骨三种成分。然而目前用于牙周组织再生的支架以单层支架为主，缺乏对牙周组织复杂生理结构的适应。

[0004] 支架材料作为组织工程的另一重要因素，需要大致吻合组织缺损区域的形态，为细胞生长、组织生成提供合适的环境。随着技术的不断进步和发展，3D打印技术被广泛运用到支架材料的开发中，所打印出的支架表现出了优良性能。然而，为保证适应不同情况下的缺损，需要对支架根据实际情况进行精密的设计，这会增加额外的成本；并且，复杂的支架制作流程以及常常需要进行有创的支架植入，使得3D打印对技术的要求较高。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种能够分层定向募集不同细胞的双层支架，实现牙周膜以及牙槽骨同时再生。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种温敏凝胶材料组合，包括负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液和负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液。

[0008] 优选的，所述负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液和负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液为独立包装。

[0009] 优选的，所述温敏凝胶材料组合由溶液态转化为凝胶态的温度为36～38℃。

[0010] 本发明还提供了一种温敏凝胶材料组合的制备方法，包括如下步骤：

[0011] (1)将壳聚糖与乙酸溶液混合，得到壳聚糖溶液；

[0012] (2)将β‑甘油磷酸盐二钠和透明质酸混合溶于水，得到透明质酸溶液；

[0013] (3)将壳聚糖溶液与透明质酸溶液混合，得到壳聚糖透明质酸溶液；

[0014] (4)将SDF‑1与40～60％体积的壳聚糖透明质酸溶液混合，得到负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液；

[0015] (5)将40～60％体积的壳聚糖透明质酸溶液与1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺混合，再加入Apt19S适配体，得到负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液。

[0016] 优选的，所述乙酸溶液的浓度为0.08～0.12M，所述壳聚糖与乙酸溶液的质量体积比为28～32mg:0.8～1.2mL。

[0017] 优选的，所述β‑甘油磷酸盐二钠、透明质酸和水的质量体积比为55～65mg:0.8～1.2mg:0.05～0.15mL。

[0018] 优选的，所述负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液中SDF‑1的浓度为180～230ng/mL。

[0019] 优选的，步骤(4)中所述1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺和壳聚糖透明质酸溶液的质量体积比为15～25mg:8～12mg:0.8～1.2mL。

[0020] 优选的，所述负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液中Apt19S适配体的浓度为1.5～2.5nmol/mL。

[0021] 本发明还提供了一种温敏凝胶材料组合在制备牙周组织再生支架中的应用。

[0022] 优选的，所述牙周组织再生支架为双层凝胶结构；

[0023] 所述双层凝胶结构中，由负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液形成的SDF‑1凝胶体与由负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液形成的Apt19S凝胶体紧密贴合，形成贴合面；

[0024] 所述SDF‑1凝胶体与贴合面相对的面贴近牙周膜，所述Apt19S凝胶体与贴合面相对的面贴近牙槽骨。

[0025] 本发明提供了一种温敏凝胶材料组合。本发明以壳聚糖(CS)、透明质酸(HA)和β‑甘油磷酸盐二钠(β‑GP)为原料，制备得到壳聚糖透明质酸溶液(CS/HA/GP溶液)，随后逐滴加入SDF‑1或在活化透明质酸上的羧基后加入适配体Apt19S，得到温敏凝胶材料组合。本发明中凝胶所用的壳聚糖、透明质酸和β‑GP等原料便宜易得，负载药物的过程简单，生产周期短。本发明所提供的温敏凝胶材料，在4℃储存能较长时间保持液态和凝胶化能力。在25℃下依然具有良好的流动性，能够通过注射剂的形式进入牙周组织(牙周膜和牙槽骨之间)，并在体温(37℃)下转变为凝胶态，能够与复杂的牙周组织很好的契合。

[0026] 本发明的温敏凝胶材料组合使用时，将负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液和负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液分层注射到口腔内，使SDF‑1凝胶体贴近牙周膜，Apt19S凝胶体贴近牙槽骨，在口腔内实现构建双层凝胶支架的目的。

[0027] 本发明提供的温敏凝胶材料组合，以一种低成本且简便的方式，在体内牙周缺损区形成契合缺损区形态并能在体温环境下形成有足够支持能力的支架，且能持续释放吸引细胞迁移所需的生长因子，为最终细胞的迁入和组织再生提供支持。

[0028] 本发明的基质细胞衍生因子‑1(SDF‑1)与适配体Apt19S均具有招募干细胞的能力，且Apt19S可以与间充质干细胞特异性结合，为将干细胞定向招募至病损区提供了重要的途径。在牙周缺损区靠近牙周膜处使用SDF‑1募集牙周膜干细胞，可以促进牙周膜的形成；在靠近牙槽骨一侧使用Apt19S募集骨髓间充质干细胞，可诱导牙槽骨的再生。因此，本发明提供了一种可以缓释SDF‑1/Apt19S以募集牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞的双层温敏凝胶，用以牙周组织的再生。

[0029] 本发明旨在开发一种负载有能促进细胞迁移相关生物因子的温敏可注射的双层水凝胶，用以促进牙周组织的再生。其具有如下优势：

[0030] 1、利用其温敏、可注射的特点，可以实现便捷高效的将温敏凝胶材料注入并契合牙周缺损区。

[0031] 2、利用其分为两层的优势，在牙周缺损区靠近牙周膜处使用SDF‑1募集牙周膜干细胞(PDLSCs)，促进牙周膜的形成；在靠近牙槽骨一侧使用Apt19S募集骨髓间充质干细胞(BMSCs)，促进牙槽骨的再生，最终实现不同组分的牙周组织的共同生成。

附图说明

[0032] 图1为实施例1制备的温敏凝胶材料在37℃下的凝胶态；

[0033] 图2为实施例1制备的温敏凝胶材料在25℃下的液态；

[0034] 图3为实施例1制备的温敏凝胶材料作为支架材料时的扫描电镜图；

[0035] 图4为rBMSC的Transwell细胞迁移实验结果；

[0036] 图5为rPDLSCs的Transwell细胞迁移实验结果；

[0037] 图6为本发明的温敏凝胶材料用作牙周组织再生支架的示意图。

具体实施方式

[0038] 本发明提供了一种温敏凝胶材料组合，包括负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液和负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液。

[0039] 在本发明中，所述负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液和负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液优选为独立包装。

[0040] 在本发明中，所述温敏凝胶材料组合由溶液态转化为凝胶态的温度优选为36～38℃，进一步优选为37℃。

[0041] 在本发明中，所述温敏凝胶材料组合优选为一种注射液。

[0042] 本发明还提供了一种温敏凝胶材料组合的制备方法，包括如下步骤：

[0043] (1)将壳聚糖与乙酸溶液混合，得到壳聚糖溶液；

[0044] (2)将β‑甘油磷酸盐二钠和透明质酸混合溶于水，得到透明质酸溶液；

[0045] (3)将壳聚糖溶液与透明质酸溶液混合，得到壳聚糖透明质酸溶液；

[0046] (4)将SDF‑1与40～60％体积的壳聚糖透明质酸溶液混合，得到负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液；

[0047] (5)将40～60％体积的壳聚糖透明质酸溶液与1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺混合，再加入Apt19S适配体，得到负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液。

[0048] 本发明将壳聚糖与乙酸溶液混合，得到壳聚糖溶液。

[0049] 在本发明中，所述乙酸溶液的浓度优选为0.08～0.12M，进一步优选为0.1M。

[0050] 在本发明中，所述壳聚糖(CS)与乙酸溶液的质量体积比优选为28～32mg:0.8～1.2mL，进一步优选为30mg:1mL。

[0051] 在本发明中，所述壳聚糖与乙酸溶液混合时，优选用磁力搅拌器搅拌混匀。

[0052] 在本发明中，所述磁力搅拌器的转速优选为800～1200rpm，进一步优选为1000rpm。

[0053] 在本发明中，所述磁力搅拌器的搅拌时间优选为1.5～2.5h，进一步优选为2h。

[0054] 本发明将β‑甘油磷酸盐二钠(β‑GP)和透明质酸(HA)混合溶于水，得到透明质酸溶液。

[0055] 在本发明中，所述β‑甘油磷酸盐二钠、透明质酸和水的质量体积比优选为55～65mg:0.8～1.2mg:0.05～0.15mL，进一步优选为58～62mg:0.9～1.1mg:0.08～0.12mL，再进一步优选为60mg:1mg:0.1mL。

[0056] 在本发明中，所述水优选为去离子水。

[0057] 将制备得到的壳聚糖溶液与透明质酸溶液混合，得到壳聚糖透明质酸溶液。

[0058] 在本发明中，所述壳聚糖溶液与透明质酸溶液在混合之前，优选进行冰浴处理。

[0059] 在本发明中，所述冰浴处理的温度优选为‑2～4℃，进一步优选为0℃。

[0060] 在本发明中，所述冰浴处理的时间优选为8～12min，进一步优选为10min。

[0061] 在本发明中，所述壳聚糖溶液与透明质酸溶液在混合时，优选将透明质酸溶液逐滴滴加到壳聚糖溶液中。

[0062] 在本发明中，所述壳聚糖溶液与透明质酸溶液混合时，优选采用磁力搅拌器进行搅拌。

[0063] 在本发明中，所述磁力搅拌器的转速优选为500～1500rpm，进一步优选为800～1200rpm，再进一步优选为1000rpm。

[0064] 在本发明中，所述磁力搅拌器的时间优选为8～12min，进一步优选为10min。

[0065] 本发明将制备的壳聚糖透明质酸溶液分成两份。将SDF‑1与40～60％体积的壳聚糖透明质酸溶液混合，得到负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液。

[0066] 在本发明中，所述壳聚糖透明质酸溶液优选分成两等分。

[0067] 在本发明中，所述SDF‑1优选逐滴滴加到壳聚糖透明质酸溶液中，并在滴加过程中进行磁力搅拌。

[0068] 在本发明中，所述磁力搅拌的转速优选为500～1500rpm，进一步优选为800～1200rpm，再进一步优选为1000rpm。

[0069] 在本发明中，所述磁力搅拌器的时间优选为8～12min，进一步优选为10min。

[0070] 在本发明中，所述负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液中，SDF‑1的浓度优选为180～230ng/mL，进一步优选为190～210ng/mL，再进一步优选为200ng/mL。

[0071] 本发明将另一份40～60％体积的壳聚糖透明质酸溶液与1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺混合，再加入Apt19S适配体，得到负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液。

[0072] 在本发明中，优选先用激活缓冲液稀释壳聚糖透明质酸溶液后，再与1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺混合。

[0073] 在本发明中，所述稀释的倍数优选为1/4～1/5，进一步优选为1/5。

[0074] 在本发明中，所述激活缓冲液优选为MES缓冲液。

[0075] 在本发明中，所述MES缓冲液的浓度优选为0.05～0.15M，进一步优选为0.1M。

[0076] 在本发明中，所述MES缓冲液的pH优选为5.8～6.3，进一步优选为6.0。

[0077] 在本发明中，所述1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺和壳聚糖透明质酸溶液的质量体积比优选为15～25mg:8～12mg:0.8～1.2mL，进一步优选为18～22mg:9～11mg:0.8～1.1mL，再进一步优选为20mg:10mg:1mL。

[0078] 在本发明中，在稀释后的壳聚糖透明质酸溶液中加入1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺后，优选静置12～18min，进一步优选静置15min后，再加入Apt19S适配体。本发明中所述1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺的作用为活化壳聚糖透明质酸溶液中透明质酸上的羧基。

[0079] 在本发明中，所述Apt19S适配体的核苷酸序列为：5'‑AGGTCAGATGAGGAGGGGGACTTAGGACTGGGTTTATGACCTATGCGTG‑3'(如SEQ ID NO.1所示)。

[0080] 在本发明中，所述Apt19S适配体进一步优选为氨基改性的Apt19S适配体。

[0081] 在本发明中，所述氨基改性的Apt19S适配体的核苷酸序列为：5'‑NH2‑(A)9‑AGGTCAGATGAGGAGGGGGACTTAGGACTGGGTTTATGACCTATGCGTG‑3'(如SEQ ID NO.2所示)。

[0082] 在本发明中，所述Apt19S适配体优选采用逐滴滴加的方式加入。

[0083] 在本发明中，加入Apt19S适配体后，优选振摇混合10～15h，进一步优选振摇混合12h。

[0084] 在本发明中，所述负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液中Apt19S适配体的浓度优选为1.5～2.5nmol/mL，进一步优选为1.8～2.2nmol/mL，再进一步优选为2nmol/mL。

[0085] 本发明还提供了一种温敏凝胶材料组合在制备牙周组织再生支架中的应用。

[0086] 在本发明中，所述牙周组织再生支架优选为双层凝胶结构。

[0087] 在本发明中，所述双层凝胶结构中，优选由负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液形成的SDF‑1凝胶体与由负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液形成的Apt19S凝胶体紧密贴合，形成贴合面。

[0088] 在本发明中，所述SDF‑1凝胶体与贴合面相对的面优选贴近牙周膜，所述Apt19S凝胶体与贴合面相对的面优选贴近牙槽骨。

[0089] 本发明的温敏凝胶材料组合，在用作牙周组织再生支架使用时，先将负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液注射入靠近牙周膜的位置后，负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液能够在人体温度(37℃)下，形成SDF‑1凝胶体；在负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液初步相变时，将负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液注射到SDF‑1凝胶体之下，并且靠近牙槽骨的位置，负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液也能够在人体温度(37℃)下，形成Apt19S凝胶体；在负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液和负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液形成稳定凝胶体的过程中，二者的边界位置形成紧密连接的贴合面，该双层结构即为牙周组织双层凝胶再生支架。

[0090] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0091] 实施例1

[0092] 将48mg壳聚糖(CS)溶于1.6mL的0.1M的乙酸溶液中，置于磁力搅拌器上持续搅2h(1000rpm)，并通过121℃高压蒸汽灭菌10min，壳聚糖溶液。将240mg的β‑GP和4mg的透明质酸溶于0.4mL去离子水中，并用0.22μm的滤膜过滤除菌，得到溶透明质酸溶液。将壳聚糖溶液和透明质酸溶液冰浴(0℃)15min，然后把透明质酸逐滴滴加到壳聚糖溶液中磁力搅拌器搅拌10min(1000rpm)，得到壳聚糖透明质酸溶液。将壳聚糖透明质酸溶液平均分成两份，每份1mL。

[0093] 取其中1mL壳聚糖透明质酸溶液，逐滴加入1μl溶解在PBS中的浓度为100μg/mL的SDF‑1溶液，磁力搅拌10min(1000rpm)，得到SDF‑1浓度为200ng/mL的负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液。

[0094] 取另一份1mL壳聚糖透明质酸溶液，加入200μl激活缓冲液(0.1MMES，pH＝6)进行稀释，然后在室温(20℃)下加入20mg EDC和10mg NHS，混匀、室温(20℃)下静置15min，使透明质酸上的羧基活化。然后将300μl溶有3nmol的氨基改性Apt19S的PBS溶液逐滴加入，摇床上振荡12小时，使其充分交联，制得负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液。负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液中氨基改性Apt19S的浓度为2nmol/mL。

[0095] 本实施例中，氨基改性Apt19S的序列为：5'‑NH2‑(A)9‑AGGTCAGATGAGGAGGGGGACTTAGGACTGGGTTTATGACCTATGCGTG‑3'(如SEQ ID NO.2所示)。

[0096] 将两个5mL的注射器连接在三通管上，使其互相连通，两个注射器内分别添加1mL负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液和1mL负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液。将负载SDF‑1的壳聚糖透明质酸溶液注射到5mL离心管内。而后将该玻璃瓶转移到37℃水浴2min，使其初步相变，然后推注另一注射器内负载Apt19S的壳聚糖透明质酸溶液到离心管内尚未凝胶的溶液之上，37℃水浴10min后，制备得到双层水凝胶(如图1所示)。本发明的温敏凝胶材料在25℃下呈现为良好的液体形态(如图2所示)，扫描电镜下观察凝胶的形态及孔径(如图3所示)。从图3中可以看出，双层凝胶支架呈疏松多孔状，孔径在80～100μm之间，适合细胞爬入及生长。

[0097] 实施例2

[0098] 将第3代rBMSCs培养液100μL(含1×103个细胞)接种到Transwell小室的上室，分别将600μL含200ng/mL SDF‑1的α‑MEM培养基与600μL含氨基改性Apt19S浓度为2nmol/mL的α‑MEM培养基加入Transwell下室。在37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养24h后，用棉签擦除上室内未迁移的细胞，迁移到下室的细胞用4％甲醛固定15min，PBS冲洗2遍，晾干，0.5％结晶紫30min，PBS冲洗3遍。然后在显微镜下每个小室随机选择5个视野，对迁移到下室的BMSC细胞进行计数。结果显示：添加SDF‑1与氨基改性Apt19S适配体后，相较于空白组可显著促进BMSC细胞的迁移(如图4所示)。

[0099] 实施例3

[0100] 将第3代rPDLSCs培养液100μL(含1×103个细胞)接种到Transwell小室的上室，分别将600μL含200ng/mL SDF‑1的α‑MEM培养基与600μL含Apt19S浓度为2nmol/mL的α‑MEM培养基加入Transwell下室。37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养24h后，用棉签擦除上室内未迁移的细胞，迁移到下室的细胞用4％甲醛固定15min，PBS冲洗2遍，晾干，0.5％结晶紫30min，PBS冲洗3遍。然后在显微镜下每个小室随机选择5个视野，对迁移到下室的PDLSCs进行计数。结果显示：添加SDF‑1与Apt19S相较于空白组可显著促进PDLSC的迁移(如图5所示)。

[0101] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。