一株端梗霉属端梗孢霉MR-57及其应用转让专利
申请号 : CN202210040724.3
文献号 : CN114196553B
文献日 : 2023-02-21
发明人 : 韩忠明 , 王娇 , 王云贺 , 王妍 , 杨丽华 , 孙卓 , 韩梅 , 杨利民
申请人 : 吉林农业大学
摘要 :
一株端梗霉属端梗孢霉MR‑57及其应用，属于功能微生物筛选及应用领域，该菌株MR‑57已于2021年11月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:62084。该菌株MR‑57对毁灭柱孢菌等7种病原菌具有较强抑制和拮抗作用，对鹅掌楸链格孢、毁灭柱孢菌和械菌刺孢的拮抗能力较强；该菌株MR‑57无菌发酵液对木贼镰刀菌菌丝的生长具有明显抑制作用且能显著降低木贼镰刀菌孢子萌发率；用拌土法证实该菌株MR‑57在土壤中有良好的定殖能力；盆栽生防试验证实该菌株MR‑57对防风根腐病具有一定的防治促生效果，可明显降低防风根腐病的病情指数。
权利要求 :
1.一株端梗霉属端梗孢霉（Acrophialophora jodhpurensis）MR‑57，其特征在于，该菌株已于2021年11月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No :
62084。
2.如权利要求1所述的一株端梗霉属端梗孢霉（Acrophialophora jodhpurensis）MR‑
57在制备立枯丝核菌拮抗剂、恶疫霉拮抗剂、灰葡萄孢拮抗剂、尖孢镰刀菌拮抗剂、木贼镰刀菌拮抗剂、细极链格孢拮抗剂、鹅掌楸链格孢拮抗剂、毁灭柱孢菌拮抗剂或械菌刺孢拮抗剂中的应用。
3.如权利要求1所述的一株端梗霉属端梗孢霉（Acrophialophora jodhpurensis）MR‑
57在防治防风根腐病中的应用。
4.如权利要求1所述的一株端梗霉属端梗孢霉（Acrophialophora jodhpurensis）MR‑
57在防治防风枯萎病中的应用。
说明书 :
一株端梗霉属端梗孢霉MR‑57及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于功能微生物筛选及应用技术领域，具体涉及一株端梗霉属端梗孢霉(Acrophialophora jodhpurensis)MR‑57及其应用。
背景技术
[0002] 防风Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schisck.为伞形科防风属植物，以未抽花茎植株的干燥根入药；味辛、微甘、性温，具有止痉、祛风解表、胜湿止痛的功效；主要分布在东北三省、河北、内蒙古等地。近年来，随着防风栽培面积增加，防风根腐病在栽培地区越来越严重，主要侵染防风的茎基部，发病后破坏维管束，导致叶片萎蔫、植株枯死，严重影响了防风的产量和质量。木贼镰刀菌是导致防风根腐病的重要病原菌，该菌为热带、亚热带地区常见病原菌，但由于气候变化影响，逐渐演变成致病力较强并能侵害多种寄主的病原菌。
[0003] 目前，对植物病害的防治手段主要是使用化学农药，而防控防风根腐病的农药主要有代森锰锌、恶霉灵、多菌灵、甲基托布津等，使用这类农药进行化学防治，虽可以对防风根腐病进行有效的控制，但会形成抗药性，导致农药残留及生态失衡。由于生物防治可减少或抑制病害的发生，具有绿色、安全、高效、低毒、持续等特点，是替代化学防治来减轻防风根腐病危害的重要策略之一，符合国家提出的“双减”战略，目前已成为国内外学者研究的焦点。现阶段作为生防菌开发出来并投入商品化生产的有假单胞菌属、木霉属真菌、芽孢杆菌属以及农杆菌等，但菌种资源十分有限，因此，如何筛选与使用可作为生物防治的生防菌是近年来研究的热点。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一株端梗霉属端梗孢霉(Acrophialophora jodhpurensis)MR‑57及其应用，为防风根腐病的生物防治提供理论依据，为防风生防菌资源的深入研究和开发提供科学基础。
[0005] 本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0006] 本发明的一株端梗霉属端梗孢霉(Acrophialophora jodhpurensis)MR‑57，该菌株已于2021年11月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:62084。
[0007] 本发明的一株端梗霉属端梗孢霉(Acrophialophora jodhpurensis)MR‑57在制备植物病原菌拮抗剂中的应用。
[0008] 本发明的一株端梗霉属端梗孢霉(Acrophialophora jodhpurensis)MR‑57在制备防风病原菌拮抗剂中的应用。
[0009] 本发明的一株端梗霉属端梗孢霉(Acrophialophora jodhpurensis)MR‑57在制备立枯丝核菌拮抗剂、恶疫霉拮抗剂、灰葡萄孢拮抗剂、尖孢镰刀菌拮抗剂、木贼镰刀菌拮抗剂、细极链格孢拮抗剂、鹅掌楸链格孢拮抗剂、毁灭柱孢菌拮抗剂或械菌刺孢拮抗剂中的应用。
[0010] 本发明的一株端梗霉属端梗孢霉(Acrophialophora jodhpurensis)MR‑57在防治防风根腐病中的应用。
[0011] 本发明的一株端梗霉属端梗孢霉(Acrophialophora jodhpurensis)MR‑57在防治防风枯萎病中的应用。
[0012] 本发明的有益效果是：
[0013] 本发明从防风根际土壤中筛选到一种新微生物，结合形态、显微特性及18S r DNA序列分析进行菌种鉴定，将菌株MR‑57鉴定为Acrophialophora jodhpurensis，为中国新纪录种。
[0014] 本发明所筛选出的新种端梗霉属端梗孢霉MR‑57对毁灭柱孢菌、械菌刺孢、鹅掌楸链格孢、细极链格孢、恶疫霉、灰葡萄孢、木贼镰刀菌这7种供试病原菌具有较强抑制作用和拮抗作用，抑菌率为60％～90％，对毁灭柱孢菌与械菌刺孢的拮抗能力较强，抑菌率分别为75.22％与73.33％，而对立枯丝核菌与尖孢镰刀菌的抑菌率较低，抑菌率分别为59.33％和
59.66％，由此表明菌株MR‑57的抗菌谱较广。
59.66％，由此表明菌株MR‑57的抗菌谱较广。
[0015] 本发明所筛选出的新种端梗霉属端梗孢霉MR‑57，其无菌发酵液对木贼镰刀菌的生长具有明显抑制作用，可使木贼镰刀菌菌丝折叠、断裂、内含物凝聚、颜色变深、缢缩、膨大、畸形、扭曲等异变；其无菌发酵液能显著降低木贼镰刀菌孢子萌发率，对木贼镰刀菌孢子萌发具有较好的抑制活性。由此可见，该菌株MR‑57以及它的次生代谢产物具有广谱抑制常见植物病原菌的功能。
[0016] 将本发明所筛选出的新种端梗霉属端梗孢霉MR‑57用拌土法证实了菌株MR‑57在土壤中有良好的定殖能力。
[0017] 将本发明所筛选出的新种端梗霉属端梗孢霉MR‑57在室内条件下进行了盆栽生防试验，结果显示，该菌株MR‑57对防风根腐病具有一定的防治促生效果，可明显降低防风根腐病的病情指数，其防效可达65.41％，与农药代森锰锌800倍液防效相当，但显著高于枯草芽孢杆菌与哈茨木霉的防效；另外，该菌株MR‑57除了具有抑菌活性外，从防风生物量可以看出该菌株MR‑57具有促进植株生长的作用，表明菌株MR‑57对防风根腐病的防治具有一定潜力。
附图说明
[0018] 为了更清楚地解释本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019] 图1为实施例1中菌株MR‑57分别在OA、PCA、CMA、MEA四种培养基下培养30天后的形态特征。
[0020] 图2为实施例1中菌株MR‑57分生孢子显微特征。图中，a为菌株MR‑57分生孢子在20μm下的显微特征，b为菌株MR‑57分生孢子在1μm下的显微特征，c为菌株MR‑57分生孢子在2μm下的显微特征。
[0021] 图3为实施例1中菌株MR‑57基于ITS18建立系统发育树。
[0022] 图4为实施例2中菌株MR‑57对9种供试病原菌的抑菌率。
[0023] 图5为实施例2中菌株MR‑57对9种供试病原菌的对峙图。图中，1：MR‑57对峙立枯丝核菌，2：MR‑57对峙恶疫霉，3：MR‑57对峙灰葡萄孢，4：MR‑57对峙尖孢镰刀菌，5：MR‑57对峙木贼镰刀菌，6：MR‑57对峙细极链格孢，7：MR‑57对峙鹅掌楸链格孢，8：MR‑57对峙械菌刺孢，9：MR‑57对峙毁灭柱孢菌。
[0024] 图6为实施例3中菌株MR‑57无菌发酵液对木贼镰刀菌菌丝生长抑制作用。图中，A为木贼镰刀菌在PDA中生长。B为木贼镰刀菌在含MR‑57发酵液的含药培养基中生长。a为木贼镰刀菌在PDA中生长菌丝形态。b为木贼镰刀菌菌丝折叠、断裂、粗细不均。c：内含物凝聚、颜色变深、缢缩、膨大，畸形、扭曲。
[0025] 图7为实施例4中菌株MR‑57无菌发酵液对木贼镰刀菌孢子萌发的抑制作用。
具体实施方式
[0026] 本发明所筛选的一株端梗霉属端梗孢霉(Acrophialophora jodhpurensis)MR‑57，已于2021年11月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼(广东省科学院微生物研究所)，保藏编号为：GDMCC No:
62084。
62084。
[0027] 本发明的一株端梗霉属端梗孢霉(Acrophialophora jodhpurensis)MR‑57可应用在制备植物病原菌拮抗剂中。
[0028] 本发明的一株端梗霉属端梗孢霉(Acrophialophora jodhpurensis)MR‑57可应用在制备防风病原菌拮抗剂中。
[0029] 本发明的一株端梗霉属端梗孢霉(Acrophialophora jodhpurensis)MR‑57可应用在制备立枯丝核菌拮抗剂、恶疫霉拮抗剂、灰葡萄孢拮抗剂、尖孢镰刀菌拮抗剂、木贼镰刀菌拮抗剂、细极链格孢拮抗剂、鹅掌楸链格孢拮抗剂、毁灭柱孢菌拮抗剂或械菌刺孢拮抗剂中。
[0030] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031] 试验材料
[0032] 供试土壤为1年生防风根际土：采自于吉林农业大学药用植物园种植基地。
[0033] 供试病原菌：立枯丝核菌Rhizoctonia solani、恶疫霉Phytophthora cactorum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、木贼镰刀菌Fusarium equiseti、细极链格孢Alternaria tenuissima、鹅掌楸链格孢Alternaria liriodendra、毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans、械菌刺孢Mycocentrospora acerina，由吉林农业大学中药材学院植物生理生态实验室提供。
[0034] 各培养基配方如表1所示：
[0035] 表1
[0036]
[0037] 试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0：购自于长春海灵科贸有限公司。
[0038] 实施例1菌株MR‑57的筛选、鉴定和保藏
[0039] 一、筛选
[0040] (1)供试土壤为1年生防风根际土，经风干后过20目筛；称取10g样品于含90mL无菌生理盐水和玻璃珠的250mL三角瓶中；充分振荡20min后取1mL上清液，加入9mL无菌生理盐‑3 ‑4 ‑5水即得10倍稀释液，梯度稀释至10 、10 、10 备用；分别吸取不同梯度溶液200μL稀释液涂布于含PDA培养基的平板中，每个处理3个重复；25℃倒置暗培养7天挑选表型差异的单菌落并传代3次，划线于PDA培养基进行纯化培养，分离出纯菌落，于4℃保藏。
[0041] (2)采用平板对峙法培养法对上一步得到的菌株进行筛选，筛选出具有抑菌活性的真菌。首先用打孔器取直径为8mm的木贼镰刀菌菌饼并接种至直径90mm的含PDA培养基的平板中央，同时将2片直径为8mm的上一步得到的菌株菌饼粘于距平板中心25mm处的2个对称点上，以单接种供试病原菌为对照，25℃培养7d，每个处理重复3次，测试抑菌率。抑菌率计算公式为：(RC‑RP)/RC*100％，RC为对照趋势半径，RP为处理趋势半径。
[0042] 通过分析，筛选出共6株菌株，分别命名为MR‑34、MR‑37、MR‑39、MR‑57、MR‑68和MR‑96，抑菌率均达到55％以上，各菌株抑菌率如表2所示；其中MR‑57抑菌效果较好，抑菌率约为60％。
[0043] 表2
[0044]菌株 抑菌率
MR‑34 56.66±1.11b
MR‑37 57.77±2.22ab
MR‑39 57.77±2.93ab
MR‑57 60±1.92a
MR‑68 55.18±0.64b
MR‑96 56.29±1.28b
MR‑34 56.66±1.11b
MR‑37 57.77±2.22ab
MR‑39 57.77±2.93ab
MR‑57 60±1.92a
MR‑68 55.18±0.64b
MR‑96 56.29±1.28b
[0045] 二、鉴定
[0046] 鉴定方法包括培养特征鉴定、形态特征鉴定、分子鉴定，具体如下：
[0047] (1)MR‑57的培养特征鉴定：选用OA、PCA、CMA、MEA4种培养基于25℃培养，7天后测量菌落直径，对MR‑57的菌落质地、菌丝的丰富度、纹理和色彩，可溶性色素的存在和颜色及渗出液等进行描述，菌落颜色通过与国际社会颜色委员会(ISCC)和国家标准局(NBS)颜色名称图表进行比较进行确定。
[0048] MR‑57的培养特征鉴定结果如图1所示：菌株MR‑57在OA培养基中培养，直径为26‑27mm，菌丝平铺、稀疏、伴有气生菌丝，菌落正面鼠灰色，背面灰黑色；菌株MR‑57在PCA培养基中培养，直径为23‑26mm，菌丝绒状，菌落正面白色，背面棕黑色；菌株MR‑57在CMA培养基中培养，直径为22‑27mm，菌落中部菌丝绒状，边缘呈不规则，具有2‑3mm白边，菌落正面呈鼠灰色，背面黑色；菌株MR‑57在MEA培养基中培养，直径24‑36mm，菌落由外向内依次为白色、鼠灰色、黑色层叠渐变，背面为黑色，边缘呈不规则。
[0049] (2)MR‑57的形态特征鉴定：用ZEISS sigma300场发射扫描电子显微镜观察MR‑57菌丝、分生孢子、菌核等显微形态特征。
[0050] MR‑57的形态特征鉴定鉴定结果如图2所示：菌丝体黑褐色，部分埋生、有隔，宽为1.5‑3μm；分生孢子梗密布疣突，分生孢子黑褐色、纺锤形，表面粗糙，4.5‑7μm×11‑14μm。
[0051] (3)MR‑57的分子鉴定：将MR‑57在PDA培养基培养数天后，用试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0进行真菌菌丝DNA提取，使用ITS序列对真菌进行种、属水平鉴定，引物为ITS1、ITS4(ITS1(5′‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3′)和ITS4(5′‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3′)，PCR扩增反应体系为：Master Mix 12.5μL、ITS11μL、ITS4 1μL、rDNA 2μL、ddH2O 8.5μL，扩增程序为94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃
1min，30个循环；72℃5min；扩增的PCR产物交由上海生工进行测序；所获得基因序列提交至GenBank，采用MEGA‑5软件Neighb or‑Joining法进行建立系统发育树。
1min，30个循环；72℃5min；扩增的PCR产物交由上海生工进行测序；所获得基因序列提交至GenBank，采用MEGA‑5软件Neighb or‑Joining法进行建立系统发育树。
[0052] MR‑57的分子鉴定结果：将菌株MR‑57ITS rDNA基因PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行ITS序列测序，获得482bp大小的序列(SEQ ID NO.1)；在NCBI上进行检索，结果发现，与现有序列MN889997.1比较，相似度为99.38％，并采用MEGA‑5软件Neighbor‑Joining法进行建立系统发育树，如图3所示。菌株MR‑57与MN889997.1Acrophialophorajodhpurensis聚为同一支，结合形态与显微鉴定与18S rDNA，鉴定为Acrophialophora jodhpurensis，获得登录号为OK287150.1，为中国新纪录种。
[0053] 三、保藏
[0054] 本发明所筛选的一株端梗霉属端梗孢霉(Acrophialophorajodhpurensis)MR‑57，已于2021年11月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼(广东省科学院微生物研究所)，保藏编号为：GDMCC No:62084。
[0055] 实施例2菌株MR‑57的广谱抑菌试验
[0056] 以立枯丝核菌Rhizoctoniasolani、恶疫霉Phytophthora cactorum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、木贼镰刀菌Fusarium equiseti、细极链格孢Alternaria tenuissima、鹅掌楸链格孢Alternaria liriodendra、毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans、械菌刺孢Mycocentrospora acerina这9种供试病原菌为标靶菌，运用平板对峙法对菌株MR‑57进行抗菌谱试验。具体如下：
[0057] 通过培养皿内对峙培养法，用打孔器取直径为8mm的供试病原菌菌饼(立枯丝核菌Rhizoctonia solani、恶疫霉Phytophthora cactorum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、木贼镰刀菌Fusarium equiseti、细极链格孢Alternaria tenuissima、鹅掌楸链格孢Alternaria liriodendra、毁灭柱孢菌Cylindrocarpon destructans、械菌刺孢Mycocentrospora acerina)并接种至直径90mm的含有PDA培养基的平板中央，同时将2片直径为8mm的菌株MR‑57菌饼粘于距平板中心30mm处的2个对称点上，以单接种供试病原菌为对照，25℃培养7d，每个处理重复3次，结果如图5所示，挑取拮抗交界处菌丝，显微观察与供试病原菌相互作用后菌落边缘的菌丝形态特征，检测菌株MR‑57对不同供试病原菌的抑制作用。
[0058] 结果显示，菌株MR‑57能明显抑制毁灭柱孢菌、械菌刺孢、鹅掌楸链格孢、细极链格孢、恶疫霉、灰葡萄孢、木贼镰刀菌这7种供试病原菌，抑菌率为60％～90％，具体为：对毁灭柱孢菌与械菌刺孢的拮抗能力较强，抑菌率分别为75.22％与73.33％，而对立枯丝核菌与尖孢镰刀菌的抑菌率较低，抑菌率分别为59.33％和59.66％，由此表明菌株MR‑57的抗菌谱较广(表2)。
[0059] 表2菌株MR‑57对9种供试病原菌的抑菌率
[0060]
[0061]
[0062] 如图4所示，通过分析菌株MR‑57对9种供试病原菌的平均抑菌率，发现菌株MR‑57的平均抑制效果较强，平均抑菌率达67.2％，且均值离散度适中，分布密度相对均一，因此对菌株MR‑57进一步研究其生防机理。
[0063] 实施例3菌株MR‑57发酵液对木贼镰刀菌菌丝生长抑制试验
[0064] (1)供试病原菌活化及菌株MR‑57发酵液的制备
[0065] 将木贼镰刀菌置于室温下恢复30min后，无菌条件下挑取木贼镰刀菌菌丝体分别接种于含有PDA培养基的平板中央，25℃倒置培养，待菌株长满平板，取菌丝体传代培养至第4代备用。
[0066] 挑取菌株MR‑57的单一菌落接入含100mL PDB培养液的250mL三角瓶中，25℃、170r/min下振荡培养7d后经过3层纱布过滤，所得滤液通过0.22μm滤膜过滤后即得菌株MR‑
57无菌发酵液。
57无菌发酵液。
[0067] (2)将菌株MR‑57无菌发酵液与PDA培养基按照1:4(体积比)比例混合配置成含药培养基，在含药培养基中心接入木贼镰刀菌菌饼(d＝8mm)，以正常PDA培养基为对照，于25℃对峙培养3d，计算抑菌率，当两菌落相互交接时，挑取拮抗交界处病原菌菌丝，置于光学显微镜下观察与病原菌相互作用后菌落边缘的菌丝形态特征，记录并拍照。
[0068] (3)抑菌率计算公式为：(Ac‑Af)/Ac×100，Ac为供试病原菌在PDA培养基中生长菌落直径，Af为供试病原菌在含有菌株MR‑57无菌发酵液的含药培养基中生长菌落直径。
[0069] (4)结果表明：如图6所示，菌株MR‑57无菌发酵液对木贼镰刀菌的抑菌率为46.32％，挑取菌丝后经显微观察到，木贼镰刀菌菌丝折叠、断裂、粗细不均(a)，内含物凝聚、颜色变深、缢缩、膨大、畸形、扭曲(b)；而对照菌丝生长粗细均匀、光滑顺直，由此表明菌株MR‑57产生次生代谢产物抑制了木贼镰刀菌的生长。
[0070] 实施例4菌株MR57发酵液对木贼镰刀菌孢子萌发影响试验
[0071] (1)供试病原菌活化及菌株MR‑57发酵液的制备
[0072] 将木贼镰刀菌置于室温下恢复30min后，无菌条件下挑取木贼镰刀菌菌丝体分别接种于含有PDA培养基的平板中央，28℃倒置培养，待菌株长满平板，取菌丝体传代培养至第4代备用。
[0073] 挑取菌株MR‑57的单一菌落接入含100mLPDB培养液的250mL三角瓶中，25℃、170r/min下振荡培养7d后经过3层纱布过滤，所得滤液通过0.22μm滤膜过滤后即得菌株MR‑57无菌发酵液。
[0074] (2)用无菌水将木贼镰刀菌分生孢子配置成1×106CFU/ml，然后将木贼镰刀菌孢子悬浮液与菌株MR‑57无菌发酵液以1:1(体积比)比例混匀，将木贼镰刀菌孢子悬浮液与PDB培养基以1:1(体积比)比例混匀作为对照，25℃培养，以芽管长度超过分生孢子直径的一半作为萌发的标准，处理6h、12h、24h和48h后在载玻片上镜检木贼镰刀菌孢子萌发情况。
[0075] (3)用显微镜观察菌株MR‑57无菌发酵液处理后木贼镰刀菌孢子萌发情况，结果显示，菌株MR‑57在第6h对木贼镰刀菌孢子萌发的抑制率最高为90.59％，24h后孢子萌发抑制率为60.95％，48h后孢子萌发抑制率为71.02％，如图7所示。
[0076] 实施例5菌株MR‑57抗利福平筛选及在土壤内定殖试验
[0077] (1)对菌株MR‑57进行利福平抗性诱变，将菌株MR‑57依次在含有浓度为50、100、200、300μg/ml的利福平PDB培养基中培养，逐步进行利福平的抗性诱变，获得菌株MRRif‑57；
比较菌株MR‑57与菌株MRRif‑57对尖孢镰刀菌与木贼镰刀菌的抑菌活性；向300g土中接种浓
7
度为1×10CFU/ml的菌株MRRif‑57孢子悬液30ml，均匀拌土，置于室内，每隔7d取一次土样，
3次平行，每次平行取土样10g；取5次土样，取10g土样加入90ml无菌生蒸馏水中，混匀后静置；用梯度稀释法稀释3次，取最后1次稀释液200μL涂布于含有300μg/ml利福平的PDA平板中，置于25℃恒温培养箱中3d，统计和记录菌落数量。
比较菌株MR‑57与菌株MRRif‑57对尖孢镰刀菌与木贼镰刀菌的抑菌活性；向300g土中接种浓
7
度为1×10CFU/ml的菌株MRRif‑57孢子悬液30ml，均匀拌土，置于室内，每隔7d取一次土样，
3次平行，每次平行取土样10g；取5次土样，取10g土样加入90ml无菌生蒸馏水中，混匀后静置；用梯度稀释法稀释3次，取最后1次稀释液200μL涂布于含有300μg/ml利福平的PDA平板中，置于25℃恒温培养箱中3d，统计和记录菌落数量。
[0078] (2)菌株MRRif‑57接种10代后可稳定生长于含利福平300μL/mg的PDA平板上，且较菌株MR‑57的形态无明显变化，表明菌株MR‑57具有遗传稳定性；将菌株MRRif‑57与木贼镰刀菌对峙7d后，抑菌率60％；与菌株MR‑57与木贼镰刀菌对峙7d抑菌率相等，说明利福平标记对菌株MR‑57的抑菌能力无显著影响；菌株MR‑57定殖在土壤中后，土壤含菌量呈现先下降5
后上升并最终平缓下降的趋势，且在第21天达到最大含菌量为2.83×10CFU/ml，35d后土
5
壤含菌量依然可以达到1.92×10 CFU/ml，说明菌株MR‑57在土壤中具有良好的定殖效果，可将其用于盆栽防病实验，结果见表3。
后上升并最终平缓下降的趋势，且在第21天达到最大含菌量为2.83×10CFU/ml，35d后土
5
壤含菌量依然可以达到1.92×10 CFU/ml，说明菌株MR‑57在土壤中具有良好的定殖效果，可将其用于盆栽防病实验，结果见表3。
[0079] 表3 MR‑57在土壤中的定殖含菌量(105CFU/g)
[0080]时间/d 0 7 14 21 28 35
菌株MR‑57 10 1.8 1.97 2.83 2.22 1.92
菌株MR‑57 10 1.8 1.97 2.83 2.22 1.92
[0081] 实施例6菌株MR‑57对防风根腐病的室外防效及其对防风的促生作用
[0082] (1)取长势一致的1年生防风植株进行盆栽实验，每处理7盆；配置孢子悬液木贼镰7
刀菌、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉、菌株MR‑57，浓度均为1×10CFU/ml，农药代森锰锌为800倍液；盆栽实验共设置五种处理：A组对照为单接种木贼镰刀菌、B组为接种木贼镰刀菌与哈茨木霉、C组为接种木贼镰刀菌与枯草芽孢杆菌、D组为接种木贼镰刀菌并喷施农药代森锰锌、E组为接种木贼镰刀菌与菌株MR‑57；取长势一致的1年生防风，采用伤根灌溉法，对根茎部位划伤处理接种木贼镰刀菌孢子悬液10ml，然后分别接种MR‑57孢子悬液10ml、代森锰锌
50ml、枯草芽孢杆菌50ml、哈茨木霉50ml；进行常规管理，30d后进行统计发病程度以及防风的株高、根长、根鲜重、全株鲜重、根干重、全株干重等生物量指标，并计算发病指数与防效。
刀菌、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉、菌株MR‑57，浓度均为1×10CFU/ml，农药代森锰锌为800倍液；盆栽实验共设置五种处理：A组对照为单接种木贼镰刀菌、B组为接种木贼镰刀菌与哈茨木霉、C组为接种木贼镰刀菌与枯草芽孢杆菌、D组为接种木贼镰刀菌并喷施农药代森锰锌、E组为接种木贼镰刀菌与菌株MR‑57；取长势一致的1年生防风，采用伤根灌溉法，对根茎部位划伤处理接种木贼镰刀菌孢子悬液10ml，然后分别接种MR‑57孢子悬液10ml、代森锰锌
50ml、枯草芽孢杆菌50ml、哈茨木霉50ml；进行常规管理，30d后进行统计发病程度以及防风的株高、根长、根鲜重、全株鲜重、根干重、全株干重等生物量指标，并计算发病指数与防效。
[0083] (2)防风根腐病发病分为等级9级；0级：健株，无病斑；1级：全株10％以下的叶片发病；3级：全株11～25％的叶片发病；5级：全株26～50％的叶片发病；7级：全株51～75％的叶片发病；9级：全株76％以上的叶片发病。
[0084] (3)病情指数＝[∑(病级株数×代表值)/(总株数×最高病级代表值)]×100；
[0085] 防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100。
[0086] (4)菌株MR‑57对防风根腐病的防治效果：由表4可知，菌株MR‑57具有良好的防病效果，防效可达65.41％。
[0087] 盆栽防病实验表明，菌株MR‑57具有良好的防病效果(表4)。病情指数为22.22，显著低于木贼镰刀菌；菌株MR‑57处理防治效果65.41％与农药代森锰锌处理效果61.54％相当，明显强于菌剂枯草芽孢杆菌47.82％与哈茨木霉51.89％的防治效果。
[0088] 表4不同处理对防风根腐病盆栽防治效果
[0089] 病情指数 防效
木贼镰刀菌(CK) 64.14±2.18a
哈茨木霉+木贼镰刀菌 30.85±4.29bc 51.89±6.7b
枯草芽孢杆菌+木贼镰刀菌 32.07±5.66b 49.99±8.82b
代森锰锌+木贼镰刀菌 24.66±2.11cd 61.54±3.3ab
菌株MR‑57+木贼镰刀菌 22.18±3.72d 65.41±5.8a
木贼镰刀菌(CK) 64.14±2.18a
哈茨木霉+木贼镰刀菌 30.85±4.29bc 51.89±6.7b
枯草芽孢杆菌+木贼镰刀菌 32.07±5.66b 49.99±8.82b
代森锰锌+木贼镰刀菌 24.66±2.11cd 61.54±3.3ab
菌株MR‑57+木贼镰刀菌 22.18±3.72d 65.41±5.8a
[0090] 菌株MR‑57处理对防风株鲜重、根鲜重、株干重、根干重具有明显差异(表5)，MR‑57处理防风全株鲜重和干重分别达到20.18g和4.94g，显著高于其他处理组；根鲜重和根干重达到6.64g和1.42g，显著高于其他处理组。
[0091] 表5不同处理对防风盆栽促生效果
[0092] 株长cm 根长cm 株鲜重g 根鲜重g 株干重g 根干重g木贼镰刀菌(CK) 52.01±7.89a 29.88±4.75a 9.49±3.26b 2.66±0.19c 2.41±0.78b 0.56±0.07b代森锰锌 53.54±2.21a 29.36±1.72a 10.81±2.84b 3.39±0.34bc 2.48±0.57b 0.73±0.24b哈茨木霉 53.9±0.49a 29.03±0.49a 11.97±0.23b 3.58±0.14b 3.18±0.14b 0.86±0.09b枯草芽孢杆菌 56.64±1.6a 30.34±0.24a 10.44±0.79b 3.43±0.42bc 2.56±0.72b 0.71±0.07b菌株MR‑57 55.93±6.9a 30.93±4.05a 20.18±1.59a 6.64±1.13a 4.94±0.19a 1.42±0.02a[0093] 实施例7菌株MR‑57对防风枯萎病的室外防效作用
[0094] (1)取长势一致的1年生防风植株进行盆栽实验，每处理7盆；配置孢子悬液尖孢镰7
刀菌、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉、菌株MR‑57，浓度均为1×10 CFU/ml，农药多菌灵为500倍液；盆栽实验共设置五种处理：A组对照为单接种尖孢镰刀菌、B组为接种尖孢镰刀菌与哈茨木霉、C组为接种尖孢镰刀菌与枯草芽孢杆菌、D组为接种尖孢镰刀菌并喷施农药多菌灵、E组为接种尖孢镰刀菌与菌株MR‑57；取长势一致的1年生防风，采用伤根灌溉法，对根茎部位划伤处理接种尖孢镰刀菌孢子悬液10ml，然后分别接种MR‑57孢子悬液10ml、代森锰锌
50ml、枯草芽孢杆菌50ml、哈茨木霉50ml；进行常规管理，30d后进行统计发病程度以及防风的株高、根长、根鲜重、全株鲜重、根干重、全株干重等生物量指标，并计算发病指数与防效。
刀菌、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉、菌株MR‑57，浓度均为1×10 CFU/ml，农药多菌灵为500倍液；盆栽实验共设置五种处理：A组对照为单接种尖孢镰刀菌、B组为接种尖孢镰刀菌与哈茨木霉、C组为接种尖孢镰刀菌与枯草芽孢杆菌、D组为接种尖孢镰刀菌并喷施农药多菌灵、E组为接种尖孢镰刀菌与菌株MR‑57；取长势一致的1年生防风，采用伤根灌溉法，对根茎部位划伤处理接种尖孢镰刀菌孢子悬液10ml，然后分别接种MR‑57孢子悬液10ml、代森锰锌
50ml、枯草芽孢杆菌50ml、哈茨木霉50ml；进行常规管理，30d后进行统计发病程度以及防风的株高、根长、根鲜重、全株鲜重、根干重、全株干重等生物量指标，并计算发病指数与防效。
[0095] (2)防风枯萎病发病程度分为9级。0级：无任何发病症状；1级：叶表面有黄色病斑，占叶面积的1‑10％；3级：叶片边缘卷枯状，叶片上枯萎发病区域明显，发病区域颜色加深，发病区域占整个叶面积的11‑25％；5级：病害程度逐渐加深，开始有叶片由于枯萎严重而掉落，26％‑50％发病；7级：植株叶片掉落，发病面积继续扩大，面积达到51‑75％；9级：植株枯萎病达到最严重的时候，叶表面大于75％受到枯萎病侵扰，大部分叶表面有枯斑，颜色为褐色，叶片整体掉落现象增多，有的整株植株也已经枯萎死亡。
[0096] (3)病情指数＝∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)×100％；
[0097] 防治效果＝(对照病情指数‑处理病情指数)/对照病情指数×100％。
[0098] (4)菌株MR‑57对防风枯萎病的防治效果：由表5可知，菌株MR‑57具有良好的防病效果，防效可达61.05％。
[0099] 盆栽防病实验表明，菌株MR‑57具有良好的防病效果(表5)。病情指数为19.7，显著低于对照；菌株MR‑57处理防治效果61.05％与农药多菌灵、哈茨木霉处理效果相当。
[0100] 表5不同处理对防风枯萎病盆栽防治效果
[0101] 病情指数％ 防效％木贼镰刀菌(CK) 50.59±4.29a ‑
多菌灵 16±4.23b 68.37±8.36a
枯草芽孢杆菌 22.18±3.72b 56.15±7.35b
哈茨木霉 16±4.23b 68.37±8.36ab
MR‑57 19.7±2.18b 61.05±4.31ab
多菌灵 16±4.23b 68.37±8.36a
枯草芽孢杆菌 22.18±3.72b 56.15±7.35b
哈茨木霉 16±4.23b 68.37±8.36ab
MR‑57 19.7±2.18b 61.05±4.31ab
[0102] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。