T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型及应用

摘要

本发明涉及分析检测领域，尤其是涉及一种非标记、非固定的阴极光电化学检测T4多聚核苷酸激酶的检测模型，制备方法及其应用。所述检测模型的构建方法包括如下步骤：(1)Bi2O3纳米材料的制备、(2)Bi2O3/ITO电极的制备、(3)不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液的制备、(4)光电流的测定、(5)线性模型构建；应用本检测模型来检测T4 PNK，无需生物分子固定、操作简便、成本低、选择性好、灵敏度高，且线性范围宽(5.0×10‑4～10U/mL)、检测限低(1.0×10‑4U/mL)、在实际应用中具有巨大的潜力。

权利要求

1.一种T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）Bi2O3纳米材料的制备：制备Bi2O3纳米材料；

将可溶性铋盐溶解在去离子水中，然后加入柠檬酸三钠，尿素和聚乙烯吡咯烷酮，水热反应后干燥，获得Bi2O3纳米材料的粉末样品；

（2）Bi2O3/ITO电极的制备：将Bi2O3纳米材料结合到ITO电极表面制得Bi2O3/ITO电极；

将步骤（1）获得的Bi2O3纳米材料分散在去离子水中，制成悬浊液；然后将所得悬浊液滴涂到ITO电极表面，干燥，制得Bi2O3/ITO电极；

（3）不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液的制备：

a磷酸化反应：将序列如SEQ ID NO：1的发夹DNA加入含有不同浓度T4多聚核苷酸激酶的缓冲液中进行磷酸化反应；

b剪切反应：加入λ核酸外切酶进行剪切；

c连接反应：加入序列如SEQ ID NO：2的锁式探针DNA，在DNA连接酶存在下进行连接反应；

d滚环扩增反应：加入DNA聚合酶进行滚环扩增，获得不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液；

（4）光电流的测定：采用步骤（2）制备的Bi2O3/ITO电极测定步骤（3）中制备的不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液的光电流值；

光电流的测定，包括以下步骤：在步骤（3）获得的不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液中加入银离子溶液，并在室温下孵育；之后加入铁氰化钾溶液，继续反应；随后将步骤（2）所得Bi2O3/ITO电极浸入到上述反应溶液并反应；最后，将反应后的Bi2O3/ITO电极取出、用缓冲溶液洗涤后在光电化学测试系统上进行光电流的测定，得到不同已知浓度的T4多聚核苷酸激酶的光电流值；

（5）线性模型构建：根据步骤（4）测定的光电流值和不同T4多聚核苷酸激酶浓度之间的对应关系进行线性模型的构建。

2.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型的构建方法，其特征在于，所述步骤（5）中线性模型构建，包括以下步骤：通过步骤（4）所得的不同已知T4多聚核苷酸激酶浓度的光电流值I，和T4多聚核苷酸激酶浓度为0的样品所得的光电流值I0，计算得到不同浓度相应的光电流差值I‑I0；然后利用不同已知T4多聚核苷酸激酶浓度的对数值和相应光电流的差值构建线性模型。

3.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中的a磷酸化反应，包括以下步骤：将序列为SEQ ID NO：1的发夹DNA，与不同浓度的T4多聚核苷酸激酶、三磷酸腺苷、T4多聚核苷酸激酶反应缓冲液混合，孵育以实现磷酸化反应。

4.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中的b剪切反应，包括以下步骤：在a磷酸化反应的反应产物中加入λ核酸外切酶与相应的λ核酸外切酶反应缓冲液，继续孵育反应实现对磷酸化之后的发夹DNA的剪切反应。

5.根据权利要求1所述的阴极光电化学检测模型的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中的d滚环扩增反应，包括以下步骤：在c连接反应的反应液中加入T4 DNA连接酶与T4 DNA连接酶反应缓冲液进行连接反应；反应完成后加入phi 29 DNA聚合酶和phi 29 DNA聚合酶反应缓冲液以及dNTPs，室温下反应以实现滚环扩增反应，最后升温终止滚环扩增反应。

6.一种权利要求1‑5任一项所述的T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型的构建方法的应用，其特征在于，应用于定量测定细胞裂解液中T4多核苷酸激酶。

7.一种T4多聚核苷酸激酶的检测试剂盒，其特征在于，检测剂盒使用权利要求1‑5任一项所述的T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型的构建方法，定量测定细胞裂解液中T4多核苷酸激酶。

说明书

T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分析检测领域，尤其是涉及一种非标记、非固定的阴极光电化学检测T4多聚核苷酸激酶的检测模型，制备方法及其应用。

背景技术

[0002] T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)是一种重要的可以催化5'羟基末端进行磷酸化的激酶，与DNA重组、复制以及损伤修复等正常细胞活动息息相关[Li,P.‑P.；Cao,Y.；Mao,C.‑J.；Jin,B.‑K.；Zhu,J.‑J.Anal.Chem.2019, 91,1563‑1570.]。
因此，测定T4 PNK的活性对于临床诊断、药物研发以及基本生物学过程的揭示都领域都具有重要意义[Hou,T.；Wang,X.‑Z.；Liu,X.‑J.；Lu,  T.‑T.；Liu,S.‑F.；Li,F.Anal.Chem.2014,86,884‑890.]。

[0003] 测定T4 PNK的常规方法主要有同位素标记[Bernstein,N.K.；Williams,R.S.； Rakovszky,M.L.；Cui,D.；Green,R.；Karimi‑Busheri,F.；Mani,R.S.；Galicia,S.； Koch,C.A.；Cass,C.E.；Durocher,D.；Weinfeld,M.；Glover,J.N.M.Mol.Cell 2005,17,657‑670.]、聚丙烯酰胺凝胶电泳[Karimi‑Busheri,F.；Daly,G.；Robins,P.； Canas,B.；
Pappin,D.J.C.；Sgouros,J.；Miller,G.G.；Fakhrai,H.；Davis,E.M.；Le Beau,M.M.；
Weinfeld,M.J.Biol.Chem.1999,274,24187‑24194.]和放射自显影法[Karimi‑Busheri,F.；Lee,J.；Tomkinson,A.E.；Weinfeld,M.Nucleic Acids Res. 1998,26,4395‑4400.]等。
然而，这些方法往往存在操作复杂且耗时耗力、易产生放射性危害等缺点，限制了其广泛的应用/推广。近年来，新发展的T4 PNK 检测方法如荧光[Feng,C.；Wang,Z.；Chen,T.；Chen,X.；Mao,D.；Zhao,J.；Li,G. Anal.Chem.2018,90,2810‑2815；Song,C.；Yang,X.；Wang,K.；
Wang,Q.；Liu,J.； Huang,J.；He,L.；Liu,P.；Qing,Z.；Liu,W.Chem.Commun.2015,51,
1815—1818； Hou,T.；Wang,X.Z.；Liu,X.J.；Lu,T.T.；Liu,S.F.；Li,F.Anal.Chem.2014,
86, 884‑890]、电化学[Jiang,Y.；Cui,J.；Zhang,T.；Wang,M.；Zhu,G.；Miao,P.Anal. Chim.Acta 2019,1085,85‑90]、化学发光法[Li,N.X.；Zheng,J.；Li,C.；Wang,X.； Ji,X.；
He,Z.Chem.Commun.2017,53,8486‑8488]等的测定灵敏度较高，但是也存在需要对生物分子进行标记、成本较高、操作过程繁琐等缺陷。因此，发展新型、简单方便的T4 PNK活性检测方法仍然是十分迫切的。

[0004] 光电化学分析是根据光照射下的光电极的光电流的变化与目标分析物浓度的关系进行检测。由于采用不同的激发(光信号)与检测信号(电信号)，其具有背景信号低、灵敏度高、选择性好的优点。同时，其装置简单/价廉、响应快速及易实现高通量检测[Zhao W W,Xu J J,Chen H Y.Chem.Soc.Rev.2015, 44:729–741.]。遗憾的是，目前只有阳极光电化学分析被应用于T4 PNK活性的检测[Li,P.‑P.；Cao,Y.；Mao,C.‑J.；Jin,B.‑K.；Zhu,J.‑J.Anal.Chem.2019,91, 1563‑1570；Cui,L.；Hu,J.；Wang,M.；Diao,X.‑K.；Li,C.‑C.；Zhang,C.‑Y.Anal. Chem.2018,90,11478‑11485；Zhuang,J.‑Y.；Lai,W.‑Q.；Xu,M.‑D.；
Zhou,Q.；Tang, D.‑P.ACS Appl.Mater.Interfaces 2015,7,8330‑8338]。阳极光电化学分析不仅往往易受到介质中还原性物质的干扰，而且已报道的方法均需要将生物分子固定在电极表面，具有成本较高(生物分子需要进行标记)、操作繁琐/耗时、可能的生物分子光损伤以及生物反应识别效率低等问题。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型及其应用。本发明利用阴极光电化学分析方法来检测T4 PNK，并且其具有无需生物分子固定、操作简便、成本低、选择性好、灵敏度高等优势。

[0006] 本发明采用的光电材料为Bi2O3纳米材料，在波长为410～420nm的LED光源激发下，Bi2O3价带电子跃迁至导带，在价带留下空穴，电子流向电解质溶液而空穴被ITO电极流出的电子中和，产生阴极光电流。K3Fe(CN)6很容易与Bi2O3表面的Bi(III)反应，在其表面原位形成铁氰化铋。铁氰化铋可传导Bi2O3的光生电子，降低了Bi2O3的光生载流子复合效率，使得光电流大大提高。本发明利用T4 PNK将发夹DNA的5’端基的羟基磷酸化，从而使得发夹DNA被λ核酸外切酶剪切形成单链DNA，该单链DNA引发滚环扩增反应产生焦磷酸根离子。焦磷酸根离子继而将银离子络合，抑制了银离子与铁氰根离子的反应，从而保证铁氰根离子能够结合到Bi2O3纳米材料表面以产生光电流信号。上述反应中产生的光电流信号变化差值与目标物T4 PNK浓度相关，进而达到了检测目的。

[0007] 基于此目的，本发明设计思路为：当存在目标物T4 PNK时，会产生滚环扩增反应以产生焦磷酸根离子，继而焦磷酸根离子将银离子络合，从而保证了体系中有大量游离的铁氰根离子存在以结合到Bi2O3纳米材料表面，测得增强的光电流信号；反之，则不会发生滚环扩增反应以产生焦磷酸根离子，导致溶液中的银离子与K3Fe(CN)6反应形成铁氰化银，由于溶液中游离的K3Fe(CN)6大大降低，获得低光电流信号。

[0008] 本发明的技术方案如下：

[0009] 一种T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型，其构建方法包括如下步骤：

[0010] (1)Bi2O3纳米材料的制备：制备Bi2O3纳米材料；

[0011] (2)Bi2O3/ITO电极的制备：将Bi2O3纳米材料结合到ITO电极表面制得 Bi2O3/ITO电极；

[0012] (3)不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液的制备：

[0013] a磷酸化反应：将序列如SEQ ID NO：1的发夹DNA加入含有不同浓度T4 多聚核苷酸激酶的缓冲液中进行磷酸化反应；

[0014] b剪切反应：加入λ核酸外切酶进行剪切；

[0015] c连接反应：加入序列如SEQ ID NO：2的锁式探针DNA，在DNA连接酶存在下进行连接反应；

[0016] d滚环扩增反应：加入DNA聚合酶进行滚环扩增，获得不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液；

[0017] (4)光电流的测定：采用步骤(2)制备的Bi2O3/ITO电极测定步骤(3)中制备的不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液的光电流值；

[0018] (5)线性模型构建：根据步骤(4)测定的光电流值和不同T4多聚核苷酸激酶浓度之间的对应关系进行线性模型的构建。

[0019] 进一步的，所述步骤(1)中Bi2O3纳米材料的制备，包括以下步骤：

[0020] 将可溶性铋盐溶解在去离子水中，然后加入柠檬酸三钠，尿素和聚乙烯吡咯烷酮，水热反应后干燥，获得Bi2O3纳米材料的粉末样品。

[0021] 进一步的，所述步骤(2)中Bi2O3/ITO电极的制备，包括以下步骤：

[0022] 将步骤(1)获得的Bi2O3纳米材料分散在去离子水中，制成悬浊液；然后将所得悬浊液滴涂到ITO电极表面，干燥，制得Bi2O3/ITO电极。

[0023] 进一步的，所述步骤(4)中光电流的测定，包括以下步骤：

[0024] 在步骤(3)获得的不同T4多聚核苷酸激酶浓度的生物反应液中加入银离子溶液，并在室温下孵育；之后加入铁氰化钾溶液，继续反应；随后将步骤(2) 所得Bi2O3/ITO电极浸入到上述反应溶液并反应；最后，将反应后的Bi2O3/ITO 电极取出、用缓冲溶液洗涤后在光电化学测试系统上进行光电流的测定，得到不同已知浓度的T4多聚核苷酸激酶的光电流值。

[0025] 进一步的，所述步骤(5)中线性模型构建，包括以下步骤：

[0026] 通过步骤(4)所得的不同已知T4多聚核苷酸激酶浓度的光电流值I，和T4 多聚核苷酸激酶浓度为0的样品所得的光电流值I0，计算得到不同浓度相应的光电流差值I‑I0；然后利用不同已知T4多聚核苷酸激酶浓度的对数值和相应光电流的差值构建线性模型。

[0027] 进一步的，所述步骤(3)中的a磷酸化反应，包括以下步骤：

[0028] 将序列为SEQ ID NO：1的发夹DNA，与不同浓度的T4多聚核苷酸激酶、三磷酸腺苷、T4多聚核苷酸激酶反应缓冲液混合，孵育以实现磷酸化反应。

[0029] 进一步的，所述步骤(3)中的b剪切反应，包括以下步骤：

[0030] 在a磷酸化反应的反应产物中加入λ核酸外切酶与相应的λ核酸外切酶反应缓冲液，继续孵育反应实现对磷酸化之后的发夹DNA的剪切反应。

[0031] 进一步的，所述步骤(3)中的d滚环扩增反应，包括以下步骤：

[0032] 在c连接反应的反应液中加入T4 DNA连接酶与T4 DNA连接酶反应缓冲液进行连接反应；反应完成后加入phi 29 DNA聚合酶和phi 29 DNA聚合酶反应缓冲液以及dNTPs，室温下反应以实现滚环扩增反应，最后升温终止滚环扩增反应。

[0033] 一种所述的T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型的应用，应用于定量测定细胞裂解液中T4多核苷酸激酶。

[0034] 一种T4多聚核苷酸激酶的检测试剂盒，包含所述的T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型。

[0035] 本发明有益的技术效果在于：

[0036] 本发明首次提出如下检测T4 PNK的思路：利用T4 PNK对发夹DNA探针的磷酸化导致发夹DNA被剪切形成单链DNA，该单链DNA诱导核酸滚环扩增反应以产生焦磷酸根离子并将溶液中的银离子络合，抑制了银离子与K3Fe(CN)6的直接反应。上述反应导致溶液中的K3Fe(CN)6主要以游离离子的形式存在，能够直接结合到Bi2O3纳米材料制成的光阴极表面，测得高光电流信号。反之，无 T4 PNK时没有核酸滚环扩增反应以及焦磷酸根离子的形成，溶液中的银离子与 K3Fe(CN)6直接反应导致K3Fe(CN)6无法结合到Bi2O3表面，测得低光电流信号。

[0037] 本发明提供了一种T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型及其应用，公开了一种阴极光电化学分析方法来检测T4 PNK，该方法无需生物分子的标记及其固定、操作简‑4便、成本低、选择性好、灵敏度高，且线性范围宽(5.0×10 ～10 U/mL)、检测限低(1.0×10‑4
U/mL)、在实际应用中具有巨大的潜力。

附图说明

[0038] 图1为实施例1中制备得到的Bi2O3纳米材料的扫描电镜图；

[0039] 图2是实施实例1制备的Bi2O3纳米材料的X射线衍射图；

[0040] 图3是实施实例1的得到的光电流响应(ΔI＝I‑I0)与对不同浓度的T4 PNK 的对数的线性关系图；

[0041] 图4是实施实例1得到的检测模型在应用时对于T4 PNK以及其它的可能的干扰物+ 2+的光电流响应的比较。其中，K 、Ca 、葡萄糖(GLU)、牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HAS)、溶菌酶(LYS)的浓度为100μM；尿嘧啶DNA糖基化酶 (UDG)、胃蛋白酶(PEP)、酪氨酸酶(TYR)、凝血酶(THR)、胰蛋白酶(TRY)、蛋白激酶A(PKA)的浓度为100U/mL；T4 PNK的浓度为1.0U/mL。

具体实施方式

[0042] 下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

[0043] 本发明中所述的原料如无特殊说明，均为商业购得。

[0044] 总体的，本发明公开的一种T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型，其构建方法包括如下步骤：

[0045] (1)Bi2O3纳米材料的制备：将0.2‑0.5g可溶性铋盐(Bi(NO3)3·5H2O或硫酸铋)溶解在60mL去离子水中，然后加入0.5‑0.9g柠檬酸三钠，0.24g尿素和0.50‑1.0g聚乙烯吡咯烷酮并剧烈搅拌20‑50分钟；随后，将得到的混合溶液转移至高压反应釜中，在100‑180℃条件下反应5‑12小时；冷却至室温后，将所得样品用乙醇和去离子水洗涤数次，最终样品在60℃条件下干燥过夜得到碱式碳酸铋粉末；最后，将得到的碱式碳酸铋在马弗炉中350‑450℃加热2小时获得Bi2O3纳米材料的粉末样品；

[0046] (2)Bi2O3/ITO电极的制备：将Bi2O3纳米材料分散在去离子水中，制成悬浊液；然后将所得悬浊液滴涂到ITO电极表面，60℃干燥，制得Bi2O3/ITO电极；

[0047] (3)生物反应：10μL浓度为5.0μM的序列为SEQ ID NO：1＝5’‑HO‑GGC CCA ACC GGT GTT TCG GTT GGG CC‑3’的发夹DNA，与10μL不同浓度的 T4多聚核苷酸激酶、2.0μL浓度为10mM的三磷酸腺苷、18μL的T4多聚核苷酸激酶反应缓冲液混合，在37℃下孵育反应20分钟以实现磷酸化反应；将上述反应产物中加入2.0μL浓度为5.0U/μL的λ核酸外切酶与8.0μL的λ核酸外切酶反应缓冲液，继续在37℃下孵育反应40分钟以实现对磷酸化之后的发夹DNA的剪切反应，随后，将反应体系中的λ核酸外切酶在75℃加热10分钟以使其失活；然后，在上述反应体系中加入10μL浓度为5.0μM的序列为SEQ ID NO：2＝5’‑PO4‑CGA AAC ACC TCC GTT TAC CTG TCT TAG GCC CAA C ‑3’的锁式探针DNA并在37℃下反应30分钟，加入2.0μL浓度为5.0U/μL的 T4 DNA连接酶与18μL的T4 DNA连接酶反应缓冲液并在37℃下反应1小时；最后，加入2.0μL浓度为1.0U/μL的phi 29 DNA聚合酶、18μL的phi 29 DNA 聚合酶反应缓冲液以及2.0μL浓度为10mM的dNTPs，室温下反应2小时以实现滚环扩增反应，并在65℃加热10分钟以终止滚环扩增反应；

[0048] (4)光电流的测定：将上述反应溶液中加入10μL浓度为6.0μM的银离子溶液并在室温下孵育反应20分钟；之后，加入15μL浓度为5.0μM的铁氰化钾溶液，继续反应5分钟；将步骤(2)所得Bi2O3/ITO电极浸入到上述反应溶液并反应5分钟；最后，将反应后的Bi2O3/ITO电极取出、用pH＝7.0的Tris–HCl 缓冲溶液洗涤后在自制的光电化学测试系统上进行光电流的测定，得到不同已知浓度的T4多聚核苷酸激酶的光电流值；

[0049] (5)线性模型构建：通过步骤(4)所得的不同已知T4多聚核苷酸激酶浓度的光电流值I，和T4多聚核苷酸激酶浓度为0的样品所得的光电流值I0，计算得到不同浓度相应的光电流差值I‑I0；然后利用不同已知T4多聚核苷酸激酶浓度的对数值和相应光电流的差值构建线性模型。

[0050] 实施例1

[0051] 一种T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型，其构建方法包括如下步骤：

[0052] a、Bi2O3纳米材料的制备：称取0.48g硝酸铋溶于60mL去离子水中，然后加入0.88g柠檬酸三钠，0.24g尿素和0.50g聚乙烯吡咯烷酮并剧烈搅拌30分钟；随后，将得到的混合溶液转移至高压反应釜中，在180℃条件下反应12小时。冷却至室温后，将所得样品用乙醇和去离子水洗涤数次，最终样品在60℃条件下干燥过夜得到碱式碳酸铋粉末；最后，将得到的碱式碳酸铋在马弗炉中 400℃加热2小时获得Bi2O3纳米材料的粉末样品；如图1所示为上述Bi2O3纳米材料的扫描电镜图；如图2所示为上述Bi2O3纳米材料的X射线衍射图；

[0053] b、Bi2O3/ITO电极的制备：将制备好的Bi2O3纳米材料加入到去离子水中，超声得到1.0mg/mL的悬浊液；然后取30μL悬浊液滴涂到ITO电极表面，60℃干燥，制得Bi2O3/ITO电极；

[0054] c、生物反应：10μL浓度为5.0μM的序列为SEQ ID NO：1的发夹DNA，与10μL不同浓度的T4 PNK、2.0μL浓度为10mM的三磷酸腺苷、18μL的T4 PNK反应缓冲液混合，在37℃下孵育反应20分钟以实现磷酸化反应；在上述反应产物中加入2.0μL浓度为5.0U/μL的λ核酸外切酶与8.0μL的λ核酸外切酶反应缓冲液，继续在37℃下孵育反应40分钟以实现对磷酸化之后的发夹DNA 的剪切反应，随后，在75℃加热10分钟使λ核酸外切酶失活；然后，在上述反应体系中加入10μL浓度为5.0μM的序列为SEQ ID NO：2的锁式探针DNA 并在37℃下反应30分钟，加入2.0μL浓度为5.0U/μL的T4 DNA连接酶与18 μL的T4 DNA连接酶反应缓冲液并在37℃下反应1小时；最后，加入2.0μL 浓度为1.0U/μL的phi 29 DNA聚合酶、18μL的phi 29 DNA聚合酶反应缓冲液以及2.0μL浓度为10mM的dNTPs，室温下反应2小时以实现滚环扩增反应，并在65℃加热10分钟以终止滚环扩增反应；

[0055] d、光电流的测定：在上述反应溶液中加入10μL浓度为6.0μM的银离子溶液并在室温下孵育反应20分钟；之后，加入15μL浓度为5.0μM的铁氰化钾溶液，继续反应5分钟；将所制备的Bi2O3/ITO电极浸入到上述反应溶液中并反应 5分钟；最后，将反应后的Bi2O3/ITO电极取出、用pH＝7.0的Tris‑HCl缓冲溶液洗涤后，以此作为工作电极，采用三电极体系在pH＝7.0的Tris‑HCl中，在相对于Ag/AgCl参比电极为‑0.2V的电压下，进行光电流测定，得到不同已知浓度的T4 PNK的光电流值；

[0056] 其中，光电流测定以Ag/AgCl电极和Pt丝分别作为参比电极和对电极组成三电极体系。将410～420nm波段的LED灯作为激发光源，通过电化学工作站记录工作电极的光电流。

[0057] 结果如图3所示，该方法对T4 PNK具有灵敏的响应，线性方程为ΔI (μA)＝0.2952 ‑4
×log[T4 PNK]+1.06，线性相关系数R为0.997，线性范围为5.0×10  U/mL到10U/mL，检测‑4
限为1.0×10 U/mL。

[0058] 进一步的，本实施例还研究了上述检测模型在应用时对于T4 PNK以及其它的可能+ 2+的干扰物的光电流响应的比较。结果见附图4，其中，K 、Ca 、葡萄糖 (GLU)、牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HAS)、溶菌酶(LYS)的浓度为 100μM；尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、胃蛋白酶(PEP)、酪氨酸酶(TYR)、凝血酶(THR)、胰蛋白酶(TRY)、蛋白激酶A(PKA)的浓度为100U/mL； T4 PNK的浓度为1.0U/mL。可见本检测模型应用时具有较高的灵敏度和抗干扰能力。

[0059] 实施例2

[0060] 一种T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型，其构建方法包括如下步骤：

[0061] a、Bi2O3的制备：将0.35g硫酸铋溶解在60mL去离子水中，然后加入0.88g 柠檬酸三钠，0.24g尿素和1.0g聚乙烯吡咯烷酮并剧烈搅拌30分钟；随后，将得到的混合溶液转移至高压反应釜中，在160℃条件下反应10小时；冷却至室温后，将所得样品用乙醇和去离子水洗涤数次，最终样品在60℃条件下干燥过夜得到碱式碳酸铋粉末；最后，将得到的碱式碳酸铋在马弗炉中400℃加热2 小时获得Bi2O3纳米材料的粉末样品；

[0062] b、Bi2O3/ITO电极的制备：将制备好的Bi2O3纳米材料加入到去离子水中，超声得到1.0mg/mL的悬浊液；然后取30μL悬浊液滴涂到ITO电极表面，60℃干燥，制得Bi2O3/ITO电极；

[0063] c、生物反应：10μL浓度为5.0μM的序列为SEQ ID NO：1的发夹DNA，与10μL不同浓度的T4 PNK、2.0μL浓度为10mM的三磷酸腺苷、18μL的T4 PNK反应缓冲液混合，在37℃下孵育反应20分钟以实现磷酸化反应；在上述反应产物中加入2.0μL浓度为5.0U/μL的λ核酸外切酶与8.0μL的λ核酸外切酶反应溶液，继续在37℃下孵育反应40分钟以实现对磷酸化之后的发夹DNA 的剪切反应，随后，将反应体系中的λ核酸外切酶在75℃加热10分钟以使其失活；然后，在上述反应体系中加入10μL浓度为5.0μM的序列为SEQ ID NO： 2的锁式探针DNA并在
37℃下反应30分钟，加入2.0μL浓度为5.0U/μL的 T4 DNA连接酶与18μL的T4 DNA连接酶反应缓冲液并在37℃下反应1小时；最后，加入2.0μL浓度为1.0U/μL的phi 29 DNA聚合酶、18μL的phi 29 DNA 聚合酶反应缓冲液以及2.0μL浓度为10mM的dNTPs，室温下反应2小时以实现滚环扩增反应，并在65℃加热10分钟以终止滚环扩增反应；

[0064] d、光电流的测定：在上述反应溶液中加入10μL浓度为6.0μM的银离子溶液并在室温下孵育反应20分钟；之后，加入15μL浓度为5.0μM的铁氰化钾溶液，继续反应5分钟；将所制备的Bi2O3/ITO电极浸入到上述反应溶液中并反应 5分钟；最后，将反应后的Bi2O3/ITO电极取出、用pH＝7.0的Tris‑HCl缓冲溶液洗涤后，以此作为工作电极，采用三电极体系在pH＝7.0的Tris‑HCl中，在相对于Ag/AgCl参比电极为‑0.2V的电压下，进行光电流测定，得到不同已知浓度的T4 PNK的光电流值。

[0065] 结合以上实施例1‑2可以得出结论：

[0066] 本发明提供了一种T4多聚核苷酸激酶的阴极光电化学检测模型及其应用，应用该模型进行T4 PNK的浓度测定时无需生物分子的标记及其固定、操作简便、成本低、选择性‑4 ‑4好、灵敏度高，且线性范围宽(5.0×10 ～10U/mL)、检测限低(1.0×10 U/mL)、在实际应用中具有巨大的潜力。

[0067] 以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及说明书内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。