一种利用自组装多肽衍生物水凝胶培养细胞球体的方法、一种细胞球体及其应用

摘要

本发明提供了一种利用自组装多肽衍生物水凝胶培养细胞球体的方法、一种细胞球体及其应用，属于生物材料技术领域。所述细胞球体的培养过程中包括与自组装多肽衍生物水凝胶共同培养，自组装多肽衍生物水凝胶中自组装多肽衍生物的结构为Biotin‑DPhe‑X。本发明的细胞球体克服了现有技术中细胞球体制备工艺复杂、细胞活性低的问题，通过自组装多肽衍生物水凝胶与细胞悬液共同培养，能够有效得到细胞球体，并保证细胞球体的活性，当所用细胞为干细胞时，能够保留细胞干性。本发明中的细胞球体还能够用于制备类器官以及肿瘤，通过本发明细胞球体得到的肿瘤与实体瘤特征相似，能够用于药物筛选。

权利要求

1.一种利用自组装多肽衍生物水凝胶培养细胞球体的方法，其特征在于，将所述自组装多肽衍生物水凝胶与细胞共同培养获得细胞球体；

D

所述自组装多肽衍生物水凝胶中自组装多肽衍生物的结构为Biotin‑Phe‑X；

D

其中：Biotin为封端基团；Phe为D构型的氨基酸Phe；X为活性多肽序列；

所述活性多肽序列为Tyr‑Ile‑Gly‑Ser‑Arg；

所述自组装多肽衍生物水凝胶中自组装多肽衍生物的含量不低于0.7wt%；

所述共同培养为将自组装多肽衍生物水凝胶涡旋后与细胞悬液混合，放置10 15min后~加入培养基进行培养，得到细胞球体；

所述自组装多肽衍生物水凝胶与细胞悬液的体积比为1 5∶1；

~

所述细胞悬液为MCF‑7、4T1、ISCs或HT29细胞悬液；

所述细胞悬液中细胞浓度为200 600个/μL或5 40个/μL。

~ ~

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养过程中每1 2天更换20 50%培养~ ~基。

说明书

一种利用自组装多肽衍生物水凝胶培养细胞球体的方法、一

种细胞球体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种利用自组装多肽衍生物水凝胶培养细胞球体的方法、一种细胞球体及其应用。

背景技术

[0002] 在组织工程和再生医学中，细胞球比单分散细胞或单层培养细胞更具优势。例如，研究表明，细胞球可以通过提高细胞存活率、增加生长因子的分泌和保持细胞多能性来提高干细胞的治疗效果。对于肿瘤细胞，由于生理相关的形态学和空间排列，细胞球体在药物筛选方面也比2D培养细胞获得更准确的结果。3D肿瘤球可以模拟肿瘤和微环境的几个重要特征，包括表型异质性、生长动力学和细胞间相互作用。此外，2D培养的肿瘤细胞通常显示出比天然肿瘤更低的化疗或放疗抗性。但现有技术中的细胞球存在一系列问题，比如细胞活性低、细胞干性不能维持等，上述问题的出现常与生产细胞球体的材料有关。

[0003] 在报道的用于生产细胞球体的材料中，水凝胶使用最广泛，因为它们与天然细胞外基质(ECM)有相似之处。现有技术中水凝胶分为天然水凝胶和合成水凝胶两种类型，但是天然水凝胶存在诸如成分不明确、稳定性不一致以及潜在的抗原性和免疫原性风险等缺点(例如市售的Matrigel，由基底膜提取物和来自动物的天然ECM成分组成)；合成水凝胶则存在成本高、制备工艺复杂、生物相容性不完善等问题(例如PEG、藻酸盐和PuraMatrix等)，这些问题严重阻碍了其广泛应用和临床转化。

[0004] 因此，现有技术中缺少一种制备工艺简单、能够维持细胞活性的细胞球体。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种利用自组装多肽衍生物水凝胶培养细胞球体的方法、一种细胞球体及其应用，用于解决现有技术中细胞球体制备工艺复杂、细胞活性低的问题。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种利用自组装多肽衍生物水凝胶培养细胞球体中的方法，将所述自组装多肽衍生物水凝胶与细胞共同培养获得细胞球体；所述自组装多肽衍生物水凝胶中D自组装多肽衍生物的结构为Biotin‑Phe‑X；

[0008] 其中：Biotin为封端基团；DPhe为D构型的氨基酸Phe；X为活性多肽序列。

[0009] 优选的，所述活性多肽序列为Tyr‑Ile‑Gly‑Ser‑Arg‑Gly‑Asp。

[0010] 优选的，所述自组装多肽衍生物水凝胶中自组装多肽衍生物的含量不低于0.7wt％。

[0011] 优选的，所述共同培养为将自组装多肽衍生物水凝胶涡旋后与细胞悬液混合，放置10～15min后加入培养基进行培养，得到细胞球体。

[0012] 优选的，所述自组装多肽衍生物水凝胶与细胞悬液的体积比为1～5∶1。

[0013] 优选的，所述所述细胞悬液为MCF‑7、4T1、ISCs以及HT29细胞悬液。

[0014] 优选的，所述细胞悬液中细胞浓度为200～600个/μL或5～40个/μL。

[0015] 优选的，所述培养过程中每1～2天更换20～50％培养基。

[0016] 本发明还提供了一种细胞球体。

[0017] 本发明还提供了一种细胞球体在类器官制备、细胞复杂性研究、药物筛选、肿瘤模型建立中的应用。

[0018] 本发明的技术效果和优点：

[0019] 本发明通过自组装多肽衍生物水凝胶与细胞悬液共同培养，能够有效得到细胞球体，并保证所得细胞球体的活性，当所用细胞为干细胞时，能够保留细胞干性。本发明中的细胞球体还能够用于制备类器官以及肿瘤，通过本发明细胞球体得到的肿瘤与实体瘤特征相似，能够用于药物筛选。

附图说明

[0020] 图1为MCF‑7细胞球体生长情况；

[0021] 图2为4T1细胞球体生长情况；

[0022] 图3为ISCs细胞球体生长情况；

[0023] 图4为ISCs细胞球体在自组装多肽衍生物水凝胶表面上的生长情况；

[0024] 图5为HT29细胞球体在自组装多肽衍生物水凝胶表面上的生长情况；

[0025] 图6为MCF‑7细胞球体活死染色结果；

[0026] 图7为4T1细胞球体活死染色结果；

[0027] 图8为ISCs细胞球体活死染色结果；

[0028] 图9为4T1细胞球体免疫荧光染色结果；

[0029] 图10A为Matrigel培养的ISCs细胞球体免疫荧光染色结果；

[0030] 图10B为本申请方法得到的ISCs细胞球体免疫荧光染色结果；

[0031] 图11为癌细胞皮下注射实验结果。

具体实施方式

[0032] 本发明提供了一种利用自组装多肽衍生物水凝胶培养细胞球体中的方法，将所述自组装多肽衍生物水凝胶与细胞共同培养获得细胞球体；所述自组装多肽衍生物水凝胶中D自组装多肽衍生物的结构为Biotin‑Phe‑X；

[0033] 其中：Biotin为封端基团；DPhe为D构型的氨基酸Phe；X为活性多肽序列。

[0034] 在本发明中，所述自组装多肽衍生物水凝胶中的自组装多肽衍生物结构优选为DBiotin‑Phe‑X；所述活性多肽序列优选为Tyr‑Ile‑Gly‑Ser‑Arg‑Gly‑Asp；所述自组装多肽衍生物水凝胶中自组装多肽衍生物的含量优选为不低于0.7wt％，进一步优选为不低于
1wt％；本发明所述的自组装多肽衍生物水凝胶制备方法参见中国专利202110800384.5。

[0035] 在本发明中，所述共同培养为将将自组装多肽衍生物水凝胶涡旋后与细胞悬液混合，放置10～15min后加入培养基进行培养，得到细胞球体。所述混合分为完全混合与不完全混合，当混合为完全混合时，细胞处于自组装多肽衍生物水凝胶内部，在内部形成细胞球体；当混合为不完全混合时，细胞处于自组装多肽衍生物水凝胶表面，在表面形成细胞球体，具体操作优选为将细胞悬液添加到自组装多肽衍生物水凝胶上方。

[0036] 本发明对所述细胞悬液中细胞的种类没有特殊限定，任意具有增殖能力的细胞即可，在本发明的具体实施方式中优选为MCF‑7、4T1以及ISCs细胞悬液；所述细胞悬液中的细胞浓度与上文中完全混合和不完全混合对应，当混合为完全混合时，所述细胞悬液中的细胞浓度优选为200～600个/μL，进一步优选为300～500个/μL，还优选为400～450个/μL；当混合为不完全混合时，所述细胞悬液中的细胞浓度优选为5～40个/μL，进一步优选为7～30个/μL，还优选为15～20个/μL。

[0037] 在本发明中，所述自组装多肽衍生物水凝胶与细胞悬液的体积比优选为1～5∶1，进一步优选为2～4∶1；所述自组装多肽衍生物水凝胶涡旋后与细胞悬液混合后还优选包括转移到96孔板或24孔板中；所述放置的设备优选为细胞培养箱，放置的时间优选为10～15min，进一步优选为11～14min，还优选为12～13min；本发明所述的共同培养的过程中优选的每1～2天更换培养基，所述更换培养基的体积比优选为20～50％，进一步优选为30～
40％，还优选为35～38％；在本发明中，当细胞悬液为MCF‑7细胞悬液时，所述培养基优选为含有10％FBS的DMEM培养基，当细胞悬液为4T1细胞悬液时，所述培养基优选为含有10％FBS的RPMI1640培养基，当细胞悬液为ISCs细胞悬液时，所述培养基优选为ISC扩增培养基，所述ISC扩增培养基的组分优选包括Advanced DMEM/F12、HEPES、Glutamax、青霉素/链霉素、Noggin、B‑27补充剂；在本发明中，所述培养过程中还优选包括避免气泡产生。

[0038] 本发明还提供了上述方法制备获得的细胞球体；所述细胞球体是由多细紧密连接形成，以多细胞集聚体的形式生长形成的具有三维结构的细胞团，并且形态规则、存在缺氧细胞。

[0039] 本发明还提供了所述细胞球体在类器官制备、细胞复杂性研究、药物筛选、肿瘤模型建立中的应用，在本发明中，对类器官种类、药物种类、肿瘤模型种类没有特殊要求。

[0040] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0041] 在本发明中，实施例中所用的实验材料如下表1所示：

[0042] 表1实验所用ISCs、MCF‑7、4T1以及HT29细胞来源

[0043]

[0044]

[0045] 在本发明中，实验中所用的抗体如下表2所示：

[0046] 表2实验所用抗体

[0047]

[0048] 在本发明中，U87、HT1080和HCT116细胞来源于美国菌种保藏中心，又称美国模式菌种收集中心(ATCC)；

[0049] 裸鼠购于：北京维通利华实验动物技术有限公司。

[0050] 实施例1

[0051] 称取Biotin‑DF‑YIGSR多肽衍生物粉末10mg于玻璃小瓶中，加入1×PBS(pH＝7.4)994.84μL以及5.16μL的1M的Na2CO3溶液，并混合均匀。酒精灯对小瓶加热至溶液沸腾，后静置，冷却至室温后，即得自组装多肽衍生物水凝胶。

[0052] 实施例2

[0053] 取实施例1得到的自组装多肽衍生物水凝胶37.5μL，涡旋后与12.5μL含有3000个细胞的MCF‑7细胞悬液混合均匀，转移到96孔板中，放入细胞培养箱。细胞凝胶混合物在培养箱中放置10min后，在其表面加入100μLDMEM(10％FBS)培养基，每隔一天更换50μL的新鲜完全培养基。

[0054] 对细胞球体生长情况进行记录，结果如图1所示。

[0055] 结果显示，在1‑7天中，细胞球体能够正常形成，且逐渐增大；第7天时，MCF‑7所形2
成的细胞球体平均截面积为4610μm。

[0056] 实施例3

[0057] 取实施例1得到的自组装多肽衍生物水凝胶37.5μL，涡旋后与12.5μL含有3000个细胞的4T1细胞悬液混合均匀，转移到96孔板中，放入细胞培养箱。细胞凝胶混合物在培养箱中放置12min后，在其表面加入100μLRPMI1640(10％FBS)培养基，每隔一天更换50μL的新鲜完全培养基。

[0058] 对细胞球体生长情况进行记录，结果如图2所示。

[0059] 结果显示，在1‑7天中，细胞球体能够正常形成，且逐渐增大；第7天时，4T1所形成2
的细胞球体平均截面积为11450μm。

[0060] 实施例4

[0061] 取实施例1得到的自组装多肽衍生物水凝胶100μL，涡旋后与25μL含有10000个细胞的ISCs细胞悬液混合均匀，转移到24孔板中，放入细胞培养箱，在培养箱中放置15min后，将400μL的ISC扩增培养基添加到细胞凝胶混合物的表面，ISC扩增培养基组分包括：Advanced DMEM/F12、HEPES、Glutamax、青霉素/链霉素、Noggin、B‑27补充剂等，每天更换
100μL培养基，整个操作过程中尽量避免气泡的产生。

[0062] 对细胞球体生长情况进行记录，结果如图3所示。

[0063] 结果显示，肠干细胞(ISCs)可以在细胞培养15天后生长成平均横截面积约为2
10000μm的球体。

[0064] 实施例5

[0065] 取实施例1得到的自组装多肽衍生物水凝胶100μL,涡旋后将其加入24孔板中，在4
细胞培养箱中稳定15min。将400μL包含1.5×10 个细胞的ISCs细胞悬液沿着孔壁添加到自组装多肽衍生物水凝胶上方，每天更换100mL培养基。

[0066] 对细胞球体生长情况进行记录，结果如图4所示。

[0067] 结果显示，肠干细胞(ISCs)可以在自组装多肽衍生物水凝胶表面正常生长为细胞球体。

[0068] 实施例6

[0069] 取实施例1得到的自组装多肽衍生物水凝胶50μL，涡旋后将其加入96孔板中，在细胞培养箱中稳定15min。将100μL包含3000个细胞的HT29细胞悬液沿着孔壁添加到自组装多肽衍生物水凝胶上方，每天更换50mL培养基。

[0070] 对细胞球体生长情况进行记录，结果如图5所示。

[0071] 结果显示，HT29可以在自组装多肽衍生物水凝胶表面正常生长为细胞球体。

[0072] 实验例1分离细胞球体

[0073] 将实施例2～4得到的细胞球体‑凝胶混合物和培养基从细胞培养板转移到1.5ml Eppendorf管中，加入PBS(与细胞球体‑凝胶混合物等体积)，并重悬(900rpm，3min)3次。所有步骤都需要缓慢轻柔，以免破坏球体的结构，使细胞球体释放。

[0074] 实验例2活死染色

[0075] MCF‑7细胞球体和4T1细胞球体用Calcine‑AM/PI Double Stain Kit(CalcineAM TM2μM，PI 4.5μM，Solvent DMEM；yeasen，China)染色。ISCs细胞球用Live&Dead 活力/细胞毒性检测试剂盒(1:3000；US INC，L6023)在37℃下染色10min。用PBS洗涤3
次后，用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，Zeiss LSM710)采集球体图像，MCF‑7细胞球染色结果如图6所示，4T1细胞球染色结果如图7所示，ISCs细胞球染色结果如图8所示。

[0076] 实验结果显示，在4T1细胞球中死亡细胞面积约为6.26％，MCF‑7为0.88％，证明细胞球活性较高。

[0077] 实验例3免疫荧光染色

[0078] ①4T1细胞球免疫荧光染色：

[0079] 1)将实施例3所得细胞球体‑凝胶混合物接种于共聚焦小皿中，培养5天，用PBS洗涤并用4％PFA固定30min；

[0080] 2)将该混合物再次用0.2％TritonX‑100(在PBS中)洗涤3次，持续30min；

[0081] 3)用PBS洗涤后，用3％BSA封闭1小时；

[0082] 4)将样品与稀释的一抗(HIF‑1α，在3％BSA中)在4℃下孵育过夜；

[0083] 5)在第二天用PBS洗涤3次；

[0084] 6)将样品与二抗(RabbitAnti‑MouseAlexaFluro 488)孵育两小时，并在室温下用4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚，二盐酸盐(DAPI，1mg/ml)染色5min；

[0085] 7)用PBS洗涤样品后，用激光共聚焦扫描仪拍摄图像。

[0086] 实验结果如图9所示，HIF1‑α与核的共定位说明细胞球内是处于缺氧的状态，这与实体瘤的特征是相似的，说明该细胞球可以用于药物筛选。

[0087] ②ISCs细胞球体免疫荧光染色：

[0088] 1)将实施例4中培养7天的ISCs细胞球体从凝胶中吹落并转移到覆盖有载玻片的24孔板中，然后放置在培养箱中过夜；

[0089] 2)细胞粘附后，去除多余的培养基；

[0090] 3)收集悬浮组织并离心(1000rpm，4min)以减少样品损失。接下来的步骤，包括洗涤、染色等，需要重复这个离心步骤；

[0091] 4)样品用4％多聚甲醛(PFA)的PBS溶液固定(4℃，10min)，然后用PBS洗涤3次；

[0092] 5)固定后，用0.2％TritonX‑100的PBS溶液(4℃，10min)进行透化，并封闭(PBS中的5％BSA)至少30min；

[0093] 6)随后将样品与一抗(LGR5和CK20在封闭缓冲液中稀释)在4℃下孵育过夜；

[0094] 7)PBS洗涤3次后，用二抗(Alexa488小鼠、Alexa 555兔)室温孵育3小时；

[0095] 8)细胞核在室温下用DAPI复染3min；

[0096] 9)用PBS洗涤样品后，用激光共聚焦扫描仪拍摄图像。

[0097] 使用同样的免疫荧光染色方法，以Matrigel培养的ISCs细胞球体作为对照，实验结果如图10所示，相比于对照组(图10A)，水凝胶中的球体显示出更强的绿色(来自Lgr5染色)和较弱的红色(来自CK20染色)荧光(图10B)，表明水凝胶有助于在球体形成过程中维持ISCs的干性。

[0098] 实验例4癌细胞皮下注射

[0099] 取实施例1得到的自组装多肽衍生物水凝胶100μL，涡旋后与50μL分别含有5×1066 6
个细胞的U87、2×10 个细胞的HT1080以及2×10个细胞的HCT116细胞悬液混合，注射到裸鼠的皮下，对照组在对应裸鼠另一侧注射等量细胞悬液。

[0100] 2‑3周后观察成瘤情况，结果如图11所示，实验组的成瘤效果更好。

[0101] 由以上实施例可知，本发明提供了一种利用自组装多肽衍生物水凝胶培养细胞球体的方法、一种细胞球体及其应用，通过自组装多肽衍生物水凝胶与细胞悬液共同培养，能够有效得到细胞球体，并保证所得细胞球体的活性，当所用细胞为干细胞时，能够保留细胞干性。本发明中的细胞球体的制备方法还能够用于制备类器官以及肿瘤，通过本发明得到的肿瘤与实体瘤特征相似，能够用于药物筛选。

[0102] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。