一种反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A及其应用

摘要

本发明公开了一种反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A及其应用。本发明利用山羊瘤胃原虫Ophryoscolex caudatus基因组数据，经过组装、注释分析及蛋白表达和功能实验，获得了一个瘤胃原虫特异的溶菌酶，命名为OCLyz1A。该新型来源的溶菌酶酶活力高，并且对以藤黄微球菌为代表的革兰氏阳性菌具有明显抑制作用，可以广泛应用于畜禽饲料、食品及生物工程。

权利要求

1.一种反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A，其特征在于：该溶菌酶OCLyz1A的氨基酸序列为：ADEYYTVQSGDYLGKIANRYGVSVSDLCNWNGISNPDLIYPGQRLLVKKSGSSSGSGSGSGSGSGKSGKIYSVTDSQMQKMGWKNYNLPDLNRCLKTFEINTVNRVRHFISQCSHESACGVYTQELGGQSYCSKYDGRRDLGNTQPGDGCRFKGAGYIQLTGRSNYQSFANYIGDSRVMEGVSYVSSKYPWTSAGYWWKSHGLNSLCDNGASVDVITKRVNGGYNGLAERKKYYQRACNIFN。

2.一种如权利要求1所述的反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A在毕赤酵母中的分泌表达方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）构建毕赤酵母重组菌株

根据所述溶菌酶OCLyz1A的编码序列构建重组载体，将重组载体转化毕赤酵母感受态细胞，得到毕赤酵母重组菌株；

2）发酵培养

将毕赤酵母重组菌株通过发酵进行重组溶菌酶OCLyz1A的诱导表达，得到发酵液；

3）收集发酵液上清，得到重组溶菌酶OCLyz1A蛋白样品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组载体表达的目的基因序列如SEQ.ID.NO.5所示。

4.一种如权利要求1所述的反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A在制备抑制革兰氏阳性菌的抗菌药物中的应用。

5.一种如权利要求1所述的反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A在制备抑制藤黄微球菌（Micrococcus luteus）的抗菌药物中的应用。

6.一种如权利要求1所述的反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A在制备饲料添加剂中的应用。

7.一种饲料添加剂，其特征在于：包括如权利要求1所述的反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A。

8.一种食品添加剂，其特征在于：包括如权利要求1所述的反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A。

说明书

一种反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种反刍动物瘤胃原虫“有尾头毛虫”(Ophryoscolex caudatus,O.caudatus)特异溶菌酶(lysozyme,Lyz)在毕赤酵母中的分泌表达方法及应用。

背景技术

[0002] 溶菌酶，又称为胞壁质酶或N‑乙酰胞壁质肽聚糖水解酶；其作为一种天然蛋白质，无毒副作用，广泛存在于高等动植物组织及分泌物、原生动物、昆虫和各种微生物中。溶菌酶根据来源不同可以分为蛋清溶菌酶、动物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和细菌噬菌体溶菌酶；其中，微生物溶菌酶作为一种有效的抗菌剂，通过活性中心水解细菌细胞壁肽聚糖上N‑乙酰胞壁酸与N‑乙酸葡萄糖胺之间的β‑1,4糖苷键，使肽聚糖骨架结构断裂，造成细胞壁损伤，最终因渗透压不平衡而引起菌体细胞溶解，直至死亡。目前已在反刍动物中鉴定到了多种溶菌酶(例如中国CN111187765A公开的反刍动物瘤胃特异溶菌酶LYZ1)，其在消化系统中含量丰富。在消化系统中溶菌酶对于改变动物肠道微生物群、增加肠道有益菌、增强机体抗病力，及提高动物的生产性能也有显著作用；通过添加溶菌酶到饲料中代替或部分代替抗生素，为解决养殖业中面临的抗药性和药物残留等问题提供了一定的途径。

[0003] 目前尚未见到有关反刍动物瘤胃原虫Ophryoscolex caudatus来源的溶菌酶的报道，已有报道仅表明Ophryoscolex caudatus可以促进瘤胃中纤维的消化。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A及其应用。该溶菌酶OCLyz1A可以用作一种新型来源的酶制剂，并广泛应用于畜禽饲料、食品、医学、生物工程、酶工程。

[0005] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

[0006] 一种反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A，该溶菌酶OCLyz1A的氨基酸序列为：

[0007] ADEYYTVQSGDYLGKIANRYGVSVSDLCNWNGISNPDLIYPGQRLLVKKSGSSSGSGSGSGSGSGKSGKIYSVTDSQMQKMGWKNYNLPDLNRCLKTFEINTVNRVRHFISQCSHESACGVYTQELGGQSYCSKYDGRRDLGNTQPGDGCRFKGAGYIQLTGRSNYQSFANYIGDSRVMEGVSYVSSKYPWTSAGYWWKSHGLNSLCDNGASVDVITKRVNGGYNGLAERKKYYQRACNIFN。

[0008] 优选的，所述溶菌酶OCLyz1A的基因编码序列包括以下DNA序列，或者所述溶菌酶OCLyz1A的基因编码序列选自与以下DNA序列具有90％以上同源性的来源于反刍动物瘤胃原虫基因组的序列：

[0009] 5'‑GCTGATGAATATTATACTGTTCAATCAGGTGATTATTTAGGTAAAATTGCAAACAGATATGGTGTATCAGTATCTGATTTATGTAATTGGAATGGTATTTCTAACCCTGATTTAATTTATCCAGGACAAAGACTTCTTGTTAAAAAATCAGGTTCTAGTTCAGGTTCAGGCTCAGGATCAGGTTCAGGTTCAGGTAAATCTGGAAAAATATATTCTGTAACAGATTCACAAATGCAAAAAATGGGTTGGAAAAATTACAATCTTCCTGATTTAAATAGATGTTTAAAAACATTTGAAATTAATACAGTTAATAGAGTCAGACATTTCATTTCTCAATGCTCACATGAATCTGCCTGTGGAGTTTATACTCAAGAATTAGGAGGTCAAAGCTATTGCTCAAAATATGATGGAAGAAGAGATTTAGGAAATACACAACCTGGTGATGGATGCAGATTTAAAGGGGCTGGATATATTCAATTAACTGGAAGATCTAATTACCAAAGTTTTGCAAATTATATTGGTGATTCAAGAGTAATGGAAGGTGTTTCTTATGTTTCTAGCAAATATCCTTGGACTTCTGCTGGTTATTGGTGGAAATCTCATGGTTTAAATTCTTTATGTGATAATGGAGCTTCTGTTGATGTAATTACTAAAAGAGTAAATGGAGGATATAATGGTCTTGCTGAAAGAAAAAAATATTATCAAAGAGCTTGTAATATCTTTAAT‑3'。

[0010] 优选的，所述反刍动物瘤胃原虫为头尾属(Ophryoscolex)，例如有尾头毛虫(Ophryoscolex caudatus)。

[0011] 上述反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A在毕赤酵母中的分泌表达方法，包括以下步骤：

[0012] 1)构建毕赤酵母重组菌株

[0013] 根据所述溶菌酶OCLyz1A的基因编码序列构建甲醇诱导型重组载体，将所述重组载体转化毕赤酵母感受态细胞，得到毕赤酵母重组菌株；

[0014] 2)发酵培养

[0015] 将毕赤酵母重组菌株通过发酵进行重组溶菌酶OCLyz1A的诱导表达，得到发酵液；

[0016] 3)收集发酵液上清，得到重组溶菌酶OCLyz1A蛋白样品。

[0017] 优选的，所述重组载体表达的目的基因序列如SEQ.ID.NO.5所示，重组溶菌酶OCLyz1A的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

[0018] 上述反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A在制备抑制革兰氏阳性菌的抗菌药物中的应用。

[0019] 上述反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A在制备抑制藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的抗菌药物中的应用。

[0020] 上述反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A在制备饲料添加剂中的应用。

[0021] 一种饲料添加剂，包括上述反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A。

[0022] 一种食品添加剂，包括上述反刍动物瘤胃原虫特异溶菌酶OCLyz1A。

[0023] 本发明的有益效果体现在：

[0024] 本发明通过对反刍动物瘤胃原虫O.caudatus基因组数据进行组装、注释分析，发现了一种瘤胃原虫特异的溶菌酶(命名为OCLyz1A)基因，并根据基因编码序列建立了该溶菌酶在毕赤酵母中的分泌表达方法。所述溶菌酶具有抑制革兰氏阳性菌(例如，藤黄微球菌)的作用，可以作为安全的畜禽饲料及食品添加剂(例如抗菌剂)，极具应用潜力。

[0025] 本发明根据反刍动物瘤胃原虫O.caudatus特异的溶菌酶(即溶菌酶OCLyz1A)的序列构建可以高效的分泌表达该溶菌酶的甲醇诱导型毕赤酵母重组菌株，使溶菌酶OCLyz1A的生产具有操作简单、周期短的优点。

附图说明

[0026] 图1为实施例中重组OCLyz1A基因表达产物的SDS‑PAGE电泳图，其中Marker为蛋白分子量。

[0027] 图2为实施例中发酵上清液对藤黄微球菌和大肠杆菌的抑菌效果图。

具体实施方式

[0028] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，以便于本领域技术人员理解本发明，但本发明的保护范围并不局限于此。

[0029] (一)反刍动物瘤胃原虫O.caudatus特异溶菌酶OCLyz1A在毕赤酵母中的分泌表达方法

[0030] 1、构建毕赤酵母GS115重组菌株

[0031] 1.1本发明利用反刍动物(包括关中奶山羊，关中奶山羊瘤胃内容物于2019年5月采集于陕西杨凌)瘤胃原虫O.caudatus基因组测序数据，对其基因进行组装、注释分析，鉴定得到了一个新的山羊瘤胃原虫O.caudatus特异的溶菌酶(命名为OCLyz1A)基因(所含编码序列包括SEQ.ID.NO.1所示序列)。根据鉴定得到的溶菌酶OCLyz1A基因的对应氨基酸序列，按照大肠杆菌(用于克隆)密码子偏好性，得到去除信号肽的重组瘤胃原虫O.caudatus溶菌酶OCLyz1A基因序列(由通用生物(安徽)股份有限公司合成，序列设计完成时间为2021年5月，如SEQ.ID.NO.5所示)。由该基因序列编码的瘤胃原虫O.caudatus溶菌酶OCLyz1A重组蛋白的氨基酸序列，具体如下所示：

[0032] ADEYYTVQSGDYLGKIANRYGVSVSDLCNWNGISNPDLIYPGQRLLVKKSGSSSGSGSGSGSGSGKSGKIYSVTDSQMQKMGWKNYNLPDLNRCLKTFEINTVNRVRHFISQCSHESACGVYTQELGGQSYCSKYDGRRDLGNTQPGDGCRFKGAGYIQLTGRSNYQSFANYIGDSRVMEGVSYVSSKYPWTSAGYWWKSHGLNSLCDNGASVDVITKRVNGGYNGLAERKKYYQRACNIFN(参见SEQ.ID.NO.4)。

[0033] 1.2利用设计的引物LYZ‑F、LYZ‑R(如SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3所示)从克隆载体中扩增重组瘤胃原虫O.caudatus溶菌酶OCLyz1A基因序列，将表达载体pPIC9(购自Invitrogen公司)及重组瘤胃原虫O.caudatus溶菌酶OCLyz1A基因序列分别进行双酶切(EcoR I和Not I)，切出编码成熟溶菌酶的基因片段(如SEQ.ID.NO.5所示)连接于pPIC9表达载体，获得重组质粒pPIC9‑OCLyz1A，质粒提取采用天根质粒小提中量试剂盒。

[0034] LYZ‑F：

[0035] 5'‑GGAATTCCATCATCATCATCACCATGCTGATGAATATTACACCGTTCAGAG‑3'LYZ‑R：

[0036] 5'‑TAAAGCGGCCGCATTGAAGATATTACATGCACGCTG‑3'

[0037] 1.3制备毕赤酵母GS115感受态细胞

[0038] 挑选YPD固体平板上的Pichia pastoris GS115(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所保存)单克隆，接种到3mL YPD液体培养基中，30℃、200rmp摇床培养。菌体生长至OD600～1.0，转接至100mL YPD摇瓶中，30℃、200rmp摇床培养。待菌体生长至OD600～1.0，在4℃下5000rmp离心5min，去除上清，加入200mL冰水，重悬；在4℃下，5000rmp离心5min，去除上清，加入100mL冰水，重悬；在4℃下5000rmp离心5min，去除上清，加入50mL冰水，重悬；在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入4mL冰山梨醇(1M)，重悬；在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入2mL冰山梨醇(1M)，重悬，收集备用。

[0039] 1.4将待转化的pPIC9‑OCLyz1A质粒利用Bgl II限制性内切酶进行线性化，电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞；取转化菌液均匀涂于MD固体平板上培养，挑取阳性单克隆，即毕赤酵母GS115重组菌株，置于甘油管中冻干保存。

[0040] 2、发酵培养

[0041] 2.1将表达菌株(毕赤酵母GS115重组菌株)在MD固体平板上进行划线活化，待菌落长出，挑取单克隆至50mL YPD液体培养基中，30℃、200rpm摇床培养。

[0042] 2.2菌体生长至OD600～1.0，吸取500μL菌液转接至200mL的BMGY液体培养基中进行摇瓶培养，30℃摇床孵育2天。

[0043] 2.3 5000rpm离心5min，收集菌体，转接至100mL BMMY液体培养基中进行摇瓶培养，30℃摇床孵育4天，每隔12h加入500μL甲醇作为诱导物。

[0044] 2.4结束诱导后，12000rpm离心10min，收集发酵液上清。

[0045] 以上步骤中涉及的培养基的配方(相应的固体培养基均加入20g/L琼脂粉)：

[0046] 1)YPD液体培养基(1L)：酵母提取物10g、胰蛋白胨20g及葡萄糖20g。

[0047] 2)MD固体平板(1L)：琼脂糖20g及葡萄糖20g。

[0048] 3)BMGY液培养基(1L)：酵母提取物10g、胰蛋白胨20g及甘油10mL，121℃灭菌15min后于无菌操作台上加入YNB 100mL及500×生物素2mL。

[0049] 4)BMMY液体培养基(1L)：酵母提取物10g及胰蛋白胨20g，121℃灭菌15min后于无菌操作台上加入YNB 100mL、500×生物素2mL及甲醇5mL。

[0050] 其中，以100mL计，500×生物素含0.02g生物素。

[0051] 3、对发酵液中的重组蛋白进行鉴定

[0052] 3.1收集蛋白样品

[0053] 发酵液上清为蛋白样品。

[0054] 3.2蛋白电泳

[0055] 利用SDS‑PAGE电泳对发酵液上清中的瘤胃原虫O.caudatus溶菌酶OCLyz1A重组蛋白进行鉴定。

[0056] 3.2.1试剂

[0057] 甘油，四甲基乙二胺(TEMED)，过硫酸铵(APS)，甲醇，冰乙酸，乙醇，十二烷基磺酸钠(SDS)；

[0058] 磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH 6.2)：11.70g磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、7.86g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)及0.372g乙二胺四乙酸二钠(EDTA‑2Na)，定容于1000mL无菌水中。

[0059] 变性蛋白电泳缓冲液(1×)配制：1.25mol/L甘氨酸、0.125mol/L Tris及5g/L SDS。

[0060] 3.2.2配制分离胶和浓缩胶

[0061] 凝胶配制时间约2h，按照以下配方(表1)配制浓缩胶和分离胶：

[0062] 表1.分离胶和浓缩胶配方

[0063]

[0064] 注：SDS、APS和TEMED在最后连续依次添加。

[0065] 分离胶凝固后(约30min)，在其上加入4％浓缩胶，待其完全凝固后，即为蛋白凝胶，取下置于4℃备用。

[0066] 3.2.3蛋白制样

[0067] 将发酵液上清40μL与5×SDS‑PAGE Sample Buffer(康润生物)缓冲液10μL混合煮沸5min，12000rmp离心1min，尽量取上面溶液，得蛋白样品‑缓冲液混合物。

[0068] 3.2.4电泳

[0069] 将蛋白凝胶安装到电泳槽上，并在槽内添加1×变性蛋白电泳缓冲液。

[0070] 上样：在1.5×5mm上样孔里，添加20μL蛋白样品‑缓冲液混合物。

[0071] 电泳条件设置：开始以80V电压跑胶30min，当蛋白样品跑到分离胶后将电压调至120V。

[0072] 3.2.5染色、脱色

[0073] 将蛋白凝胶放入考马斯亮蓝G‑250染色液(康润生物)里孵育15‑30min。孵育后用水清洗两遍，将蛋白凝胶放入脱色液，脱色时间约为3h，期间更换2次脱色液。

[0074] 所述脱色液的配方：10％的乙醇及10％的冰乙酸。

[0075] 3.2.6观察

[0076] 在凝胶成像仪中观察条带情况。结果表明：出现目标分子量大小的明显蛋白条带(大小约为26.6KD)，几乎没有其他杂质条带，即通过毕赤酵母GS115重组菌株的分泌表达，可以非常容易的获得瘤胃原虫O.caudatus溶菌酶OCLyz1A重组蛋白，具体见图1。

[0077] (二)反刍动物瘤胃原虫O.caudatus特异溶菌酶OCLyz1A抑菌活性

[0078] 利用LB琼脂培养基以及藤黄微球菌(ATCC 4698)和大肠杆菌(CVCC 3367)进行抑菌测试。

[0079] 将LB琼脂培养基灭菌后分别混入藤黄微球菌、大肠杆菌，倒平板，待培养基冷却凝固后，先在每个平板上放置0.5cm直径的牛津杯，分别在每个牛津杯中加入200μL发酵上清液和含空载体的酵母(转化有pPIC9的菌株)培养液上清(阴性对照)，置于37℃培养箱中，24h后观察抑菌圈的生长情况，并拍照。

[0080] 所述LB琼脂培养基配方(1L)：氯化钠10g、酵母提取物5g、胰蛋白胨10g及琼脂粉20g，121℃高压灭菌21min。

[0081] 由图2可知，本发明构建的毕赤酵母GS115重组菌株，其分泌表达产物对藤黄微球菌具有抑菌活性，出现明显的抑菌圈，而对大肠杆菌却不具备抑制作用，具体见图2。

[0082] 根据《食品安全国家标准食品添加剂溶菌酶》(GB 1886.257‑2016)的要求，对瘤胃原虫O.caudatus特异性的溶菌酶(即溶菌酶OCLyz1A)进行溶菌酶活性测定。一个溶菌酶活力单位定义为25℃、pH 6.2条件下，使用藤黄微球菌悬浊液在450nm处每分钟引起吸光度变化为0.001所需溶菌酶的量。最终测定OCLyz1A的酶活为4302U/mL。