一种影响高山美利奴羊毛长性状的SNP分子标记及其应用

摘要

本发明属于分子遗传学技术领域，具体涉及影响高山美利奴羊毛长性状的SNP分子标记及应用。所述SNP分子标记位于国际绵羊参考基因组Oar_v4.0版本第22号染色体上第24178878个核苷酸位点T/C突变。本发明还涉及了利用PCR技术检测上述SNP分子标记的特异性引物对和含有该引物对的试剂盒及核苷酸多态性检测方法，与传统检测法相比，该技术具有准确性高，检测速度快，成本低，结果容易判断等优点。将SNP位点检测用于开展高山美利奴羊毛长性状早期选择，缩短培育周期、加快培育进程，建立一种高山美利奴羊毛长性状早期选择技术，减少高山美利奴羊毛长优良性状的育种时间，降低育种成本，具有很高的应用价值。

权利要求

1.一种检测与高山美利奴羊毛长性状相关的SNP分子标记的试剂在检测高山美利奴羊毛长中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第22号染色体上第24178878位点的碱基处；突变碱基为T或C；所述SNP分子标记碱基为T时，基因型为TT；当所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为TC或CC；所述基因型CC的高山美利奴羊毛长显著大于基因型TT或TC。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括用于扩增含有所述SNP分子标记的核苷酸序列的引物对。

3.一种扩增含有权利要求2中所述的SNP分子标记的核苷酸序列的特异性引物对在用于检测高山美利奴羊毛长中的应用，其特征在于，所述的引物对序列为：F：5'‑ AGTCTTTCCTTGCCTCTT ‑3'；R：5'‑ GTCTTTAGCCCAACCTTT‑3'；

所述检测高山美利奴羊毛长的方法包括：

（1）提取高山美利奴羊血液基因组DNA为模板DNA；

（2）利用特异性引物对，将步骤（1）获得的待测高山美利奴羊血液的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

（3）将步骤（2）获得的PCR扩增产物纯化，进行基因分型检测，所述SNP分子标记碱基为T时，基因型为TT；所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为TC或CC；所述基因型CC的高山美利奴羊毛长显著大于基因型TT或TC。

4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增体系25μL：金牌Mix 22μL，上、下游引物各1μL，模板DNA 1μL。

5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增程序：98℃ 2min；94℃ 10s，54℃ 10s，72℃ 10s，共35个循环；72℃延伸1min。

说明书

一种影响高山美利奴羊毛长性状的SNP分子标记及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子遗传学技术领域，具体涉及一种影响高山美利奴羊毛长性状的SNP分子标记及其应用。

背景技术

[0002] 羊毛是指覆盖在羊体表面的一层具有纺织价值的纤维，是皮肤的衍生物。羊毛是毛纺工业的主要原料，约占毛纺原料的97％，主要用来加工服装面料、毛线、毛毯等产品。在羊毛生产和育种实践中，羊毛性状是重要的经济性状，主要包括毛长、产毛量、平均纤维直径、弯曲度、断裂强度、伸度、净毛率等多个指标，与织造产品和经济效益密切相关。由于人口增长，羊毛的需求已经超过了供给。随着市场需求的变化，生产优质羊毛已成为山羊育种的主要目标。

[0003] 高山美利奴羊是以甘肃高山细毛羊为母本，澳洲美利奴羊为父本，综合利用现代先进生物技术和育种技术，经过20年育成的世界首例适应海拔2400～4070m高山寒旱生态区，羊毛纤维直径主体为19.0～21.5μm的美利奴羊新品种。羊毛长也是决定其经济价值的一项重要指标，并且羊毛品质的客观检验在羊毛销售中越来越受到重视，它与纺织性能、育种和生产三者间结合的越来越紧密。

[0004] 研究表明，羊毛性状受到遗传因素和非遗传因素的影响，其中功能基因在毛囊发育、羊毛生长以及羊毛的理化特性方面发挥了重要的作用。与传统育种方法相比，分子标记辅助选择方法具有许多优势，例如可以明显缩短世代间隔，提高选择准确性，提前选择时间，同时对它低遗传力性状、早期未表现的性状、活体难以度量或者度量难度较大、成本较高的性状，有良好的选择效果。但是，若想将分子标记辅助选择方法成功应用于羊毛长性状的生产实践中，需要寻找到调控产毛性状的关键基因或与之相连锁的分子遗传标记。近年来，国内外细毛羊遗传育种专家一直致力于挖掘控制羊毛性状的候选基因或分子标记的研究，但至今没有建立起细毛羊毛性状分子标记体系，且一大批调控羊毛性状的重要基因资源仍未得到有效的挖掘与利用。

[0005] 为了加快羊毛产业的发展，从分子水平上选择与羊毛长性状相关的候选基因或与QTL相连锁的分子标记，成为了育种工作者实现辅助选择的首要条件。其中SNP是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。SNP分子标记具有遗传稳定、突变率低、便于自动化检测等优点。因此，寻找与羊毛长性状紧密连锁的分子辅助标记基因，筛选调控羊毛长性状的功能基因，是实现现代分子育种技术与常规育种技术有机结合，提高繁殖经济效率的有益手段。

[0006] 本发明发现了一种影响高山美利奴羊毛长性状的SNP分子标记，位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第22号染色体上第24178878位点的碱基处，突变碱基为T或C。所述SNP分子标记碱基为T时，基因型为TT；所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为TC或CC；所述基因型CC的高山美利奴羊毛长显著大于基因型TT或TC(p<0.05)；TT和TC基因型个体间并未表现出显著差异(p>0.05)。本发明提供的利用PCR技术检测与高山美利奴羊毛长相关的核苷酸多态性的方法，该技术准确性高，检测速度快，成本低廉，并且结果判读更容易。利用本方法可对毛长相关的SNP位点多态性实现自动化检测，通过对高山美利奴羊毛长性状相关的SNP位点进行检测，可用于育种早期选留，将CC基因型个体保留下来，提高高山美利奴羊选育准确性，在对高山美利奴羊进行大规模分子精准育种中具有潜在的应用价值。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种影响高山美利奴羊毛长性状的SNP分子标记，并通过检测所述SNP分子标记碱基类型，实现毛长高山美利奴羊的基因分型，所述SNP分子标记碱基为T时，基因型为TT；所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为TC或CC；所述基因型CC的高山美利奴羊毛长显著大于基因型TT或TC(p<0.05)；TT和TC基因型个体间并未表现出显著差异(p>0.05)；通过基因分型分析高山美利奴羊毛长，进行选育育种。具体包括以下内容：

[0008] 第一方面，本发明提供了一种检测与高山美利奴羊毛长性状相关的SNP分子标记的试剂在检测高山美利奴羊毛长中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本22号染色体上第24178878位点的碱基处，突变碱基为T或C。

[0009] 优选地，所述SNP分子标记碱基为T时，基因型为TT；所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为TC或CC；所述基因型CC的高山美利奴羊毛长显著大于基因型TT或TC。

[0010] 优选地，所述试剂包括用于扩增含有所述SNP分子标记的核苷酸序列的引物对。

[0011] 优选地，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP分子标记位于第383位。

[0012] 第二方面，本发明提供了一种检测与高山美利奴羊毛长性状相关的SNP分子标记的试剂在高山美利奴羊育种中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第22号染色体上第24178878位点的碱基处，突变碱基为T或C。

[0013] 优选地，所述SNP分子标记碱基为T时，基因型为TT；所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为TC或CC；所述基因型CC的高山美利奴羊毛长显著大于基因型TT或TC。

[0014] 优选地，所述试剂包括用于扩增含有所述SNP分子标记的核苷酸序列的引物对。

[0015] 优选地，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP分子标记位于第383位。

[0016] 第三方面，本发明提供了一种用于扩增上述第一或二方面所述的含有SNP分子标记的核苷酸序列的特异性引物对，所述的引物对序列为：

[0017] F：5'‑AGTCTTTCCTTGCCTCTT‑3'；R：5'‑GTCTTTAGCCCAACCTTT‑3'。

[0018] 第四方面，本发明提供了一种上述第三方面所述的特异性引物对在用于检测高山美利奴羊毛长，或用于高山美利奴羊育种中的应用。

[0019] 优选地，实现检测高山美利奴羊毛长，或高山美利奴羊育种的方法包括：

[0020] (1)提取高山美利奴羊血液基因组DNA为模板DNA；

[0021] (2)利用特异性引物对，将步骤(1)获得的待测高山美丽奴羊血液的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

[0022] (3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物纯化，进行基因分型检测，所述SNP分子标记碱基为T时，基因型为TT；所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为TC或CC；所述基因型CC的高山美利奴羊毛长显著大于基因型TT或TC。

[0023] 优选地，所述的特异性引物对序列为：

[0024] F：5'‑AGTCTTTCCTTGCCTCTT‑3'；R：5'‑GTCTTTAGCCCAACCTTT‑3'。

[0025] 优选地，所述PCR扩增体系25μL：金牌Mix 22μL，上、下游引物各1μL，模板DNA 1μL。

[0026] 优选地，所述PCR扩增程序：98℃2min；94℃10s，54℃10s，72℃10s，共35个循环；72℃延伸1min。

[0027] 第五方面，本发明提供了一种用于检测高山美利奴羊毛长，或用于高山美利奴羊育种的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述第三方面所述的特异性引物对。

[0028] 本发明的有益效果是：①本发明提供了一种影响高山美利奴羊毛长的SNP分子标记，所述的SNP分子标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第22号染色体上第24178878位点的碱基处，突变碱基为T或C；所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为TC或CC；所述基因型CC的高山美利奴羊毛长显著大于基因型TT或TC(p<0.05)；TT和TC基因型个体间并未表现出显著差异(p>0.05)。②本发明提供了利用PCR技术检测与高山美利奴羊毛长相关的核苷酸多态性的方法，该技术准确性高，检测速度快，成本低廉，并且结果判读更容易。利用本方法可对高山美利奴羊毛长相关的SNP位点多态性实现自动化检测，通过对高山美利奴羊毛长相关的SNP位点进行检测，可用于育种早期选留，将CC基因型个体保留下来，提高高山美利奴羊选育准确性，在对高山美利奴羊进行大规模分子精准育种中具有潜在的应用价值。

附图说明

[0029] 图1PCR扩增结果；

[0030] 图2PCR产物经纯化并测序后所得到的基因型分析结果，其中TT为TT型，TC为TC型，CC为CC型。

具体实施方式

[0031] 下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。需要指出的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

[0032] 下述实施例中所有试验的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0033] 下述实施例中所有试验的实验条件如无特殊说明，均为常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0034] 本发明所述的SNP是单核苷酸多态性的简称，指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

[0035] 实施例1高山美利奴羊不同基因型与毛长之间的相关性

[0036] 1.样品采集

[0037] 样品来自甘肃省绵羊繁殖技术推广站，采集具有生产记录的117只高山美利奴羊血样，每只羊静脉采血5mL于加入EDTA‑K2抗凝剂的采血管中，血样采集完毕后迅速混匀，放入含有冰袋的采样箱中暂存，运回实验室后于‑20℃冰箱冷冻保存，用以DNA的提取。每只羊毛长记录由甘肃省绵羊繁育技术推广站提供。

[0038] 2.主要试剂及仪器

[0039] EDTA‑K2真空采血管购自江苏宇力医疗器械有限公司；血液基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；NanoDrop2000分光光度计美国Thermo  Fisher Scientific公司；DL2000 Marker、琼脂糖、核酸染料均购自北京索莱宝科技有限公司；金牌Mix(green)购自北京擎科新业生物技术有限公司；电泳仪购于北京六一仪器厂；PCR仪购自BioRad公司。

[0040] 3.方法

[0041] 3.1血液基因组DNA的提取

[0042] 采用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组提取试剂盒，从血样中提取基因组DNA，将提取出的DNA置于紫外分光光度计下检测浓度与纯度，浓度＞20ng/μL、OD260/OD280在1.7‑1.9之间即满足实验需要，存放于‑20℃保存备用。

[0043] 3.2引物设计

[0044] 参考国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第22号染色体基因序列(GenBank登录号：NC_019479.2)，利用primer premier5.0软件设计一对特异性引物，包含g24178878T>C SNP位点；所述引物序列为：

[0045] F：5'‑AGTCTTTCCTTGCCTCTT‑3'；R：5'‑GTCTTTAGCCCAACCTTT‑3'；

[0046] 扩增片段长度464bp SEQ ID No.1)，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

[0047] 3.3PCR扩增与测序

[0048] PCR扩增体系25μL：金牌Mix(green)22μL，上、下游引物各1μL，模板1μL。

[0049] PCR扩增程序：98℃2min；94℃10s，54℃10s，72℃10s，共35个循环；72℃延伸1min。

[0050] PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，采用直接测序法进行测序，扩增的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，SNP标记位于SEQ ID No.1所示核苷酸序列的383位。

[0051] 由北京擎科新业生物技术有限公司完成测序。利用生物分析软件Vector NTI advance11.5软件对PCR产物测序结果进行比对，分析测序峰图，完成分型。

[0052] 3.4统计分析

[0053] 根据基因分型结果，统计各位点不同基因型的个体数。利用Popgen32软件计算所述SNP位点的基因频率、基因型频率、有效等位基因数(Ne)、位点杂合度(He)、Hardy‑Weinberg平衡检验，利用PIC计算软件计算多态信息含量。采用IBM SPSS Statistics 22软件中一般线性模型分析高山美利奴羊不同基因型与毛长的关联性，结果以“平均值±标准误”表示。

[0054] 4.结果

[0055] 4.4PCR扩增及测序结果

[0056] 用1.5％琼脂糖凝胶检测高山美利奴羊第22号染色体所述SNP位点扩增产物(结果如图1所示)，条带清晰无杂带，特异性良好，PCR产物片段大小为464bp符合预期大小，可以进行下一步实验。

[0057] PCR产物经纯化并测序后所得到的峰图及序列见图2。由图2可知，所述SNP位点发生T‑C突变，存在TT、TC、CC三种基因型。

[0058] 4.2统计分析结果

[0059] 从群体遗传学角度对高山美利奴羊第22号染色体所述SNP位点的基因型和等位基因频率进行分析。由表1可见，在所述SNP位点上，TC基因型频率最高，为优势基因型，T等位2
基因频率为51.7％，表现为优势等位基因。由χ适应性检验表明，SNP位点处于Hardy‑Weinberg平衡状态(P>0.05)(表1)。该位点期望杂合度为0.492，多态信息含量(polymorphism information content，简称PIC)为0.371，0.25＜PIC＜0.50，属于中度多态。

[0060] 表1高山美利奴羊第22号染色体g24178878T>C SNP位点多态性

[0061]

[0062] 4.3高山美利奴羊不同基因型与毛长的关联分析

[0063] 采用IBM SPSS Statistics 22软件中一般线性模型分析高山美利奴羊不同基因型与毛长的关联性，CC基因型的高山美利奴羊个体的毛长显著长于TC基因型个体(p<0.05)，TT和TC基因型个体间并未表现出显著差异(p>0.05)。通过检测高山美利奴羊高山美利奴羊第22号染色体所述SNP位点的碱基，能够判断高山美利奴羊的毛长。结果见表2。

[0064] 表2高山美利奴羊不同基因型与毛长之间的相关分析

[0065]

[0066] 注：同一行数据间标有不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。

[0067] 综上所述，本发明所述的SNP分子标记位于国际绵羊参考基因组Oar_v4.0版本第22号染色体上第24178878个碱基处；变异类型为T/C，存在三个基因型，当所述的第22号染色体上第24178878个碱基为T时，基因型为TT；当所述的第22号染色体上第24178878个碱基为C时，基因型为TC或CC；通过不同基因型与毛长的关联分析，发现所述CC基因型的高山美利奴羊个体的毛长显著长于TC基因型个体(P<0.05)；TT和TC基因型个体间未表现出显著差异(P>0.05)。

[0068] 上述结果表明，通过检测高山美利奴羊第22号染色体上第24178878个核苷酸位点的碱基，能够判断高山美利奴羊的毛长，为高山美利奴羊长毛型的分子标记辅助育种提供依据，可以加强高山美利奴羊长毛型早期选择、提高选种准确性、缩短培育周期、加快培育进程。通过所述的特异性引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，通过优选该SNP分子标记的优势等位基因，能够增加高山美利奴羊毛长的遗传进展，采用与毛长性状相关的分子标记进行毛长优良性状甄选时，具有操作简单的优点，可以辅助筛选毛长的高山美利奴羊，提高品种甄选的精确度，减少高山美利奴羊毛长优良性状的育种时间，降低育种成本，增加核心竞争。