含有益生菌的制剂在治疗肠胃疾病中的应用

摘要

本发明涉及含有益生菌的制剂在治疗肠胃疾病中的应用。本发明提供了特异性针对MAdCAM‑1的单克隆抗体，所述抗体能够特异性结合MAdCAM‑1进而阻断α4β7和MAdCAM‑1的相互作用进而起到治疗溃疡性肠炎，同时在治疗过程中通过添加益生菌能够协同的促进相应的治疗效果，具有较好的应用前景。

权利要求

1.一种用于治疗肠炎的药物组合物，其特征在于由特异性针对MAdCAM‑1的单克隆抗体

2A4和益生菌组成；其中，所述MAdCAM‑1的单克隆抗体2A4的轻链可变区如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示；所述益生菌是植物乳杆菌CGMCC NO.1258和动物双歧杆菌CGMCC No.9273二者制备的微胶囊。

2.特异性针对MAdCAM‑1的单克隆抗体和益生菌在制备用于治疗肠炎的药物组合物中的用途；其中，所述MAdCAM‑1的单克隆抗体2A4的轻链可变区如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示；所述益生菌是植物乳杆菌CGMCC NO.1258和动物双歧杆菌CGMCC No.9273二者制备的微胶囊。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述单克隆抗体2A4为液体制剂形式，制剂具有介于6.3与7.0之间的pH。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述液体制剂中含有所述单克隆抗体2A4、组氨酸缓冲剂和至少10mM柠檬酸盐。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于, 所述液体制剂存在于容器小瓶、药筒或注射器中。

说明书

含有益生菌的制剂在治疗肠胃疾病中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物领域，更具体的涉及含有益生菌的制剂在治疗肠胃疾病中的应用。

背景技术

[0002] 溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性、特发性、发作期与缓解期交替出现的炎症性肠道疾病，在我国UC的发病率和患病率均有逐年增加的趋势。UC通常发生在直肠和远端结肠，但也可能影响整个结肠，且该病可发生于任何年龄，但以15～30岁发病率较高，50—7O岁则相对较低。UC主要侵犯结肠黏膜和黏膜下层，表现为炎症和溃疡。已有资料显示各地区的发病率不同，发达地区较为一致，而在亚非、南美存在很大差异。

[0003] 目前，针对溃疡性结肠炎主要是采用药物治疗，目前主要有以下几类主要的药物类型。5‑氨基水杨酸(5‑ASA)制剂是治疗轻度和中度UC的主要药物，该类药物用于治疗UC开始于20世纪4O年代。临床上有大量可以口服的5‑ASA制剂，包括含有偶氮键的药物，比如柳氮磺胺啶、奥沙拉嗪、巴柳氮和控释剂型的美沙拉嗪。此类药物有很好的治疗效果，但由于需长期服用，所以临床依从性比较低。根据大量的临床试验，5‑ASA制剂的安全性总体来说是良好的。但是，柳氮磺胺嘧啶的使用因为它的不良反应(恶心、呕吐、腹痛、发热、皮疹、粒细胞缺乏症、嗜中性细胞减少、男性不育症、叶酸缺乏、自身免疫性溶血和罕见的肾毒性、肝毒性或胰腺炎)和较高的不能耐受率而受到限制。皮质类固醇药物可分为系统性和局部作用2种。皮质类固醇是治疗中度到重度且其他保守治疗疗效欠佳的UC一线药物，对重度UC有50％的缓解率。可使突发性的重度UC病死率显著下降。在20世纪后半期，糖皮质激素被广泛用来治疗活动期UC，使该病较高的病死率从75％降到了不足1％。系统性作用的皮质类固醇激素如泼尼松(0.25‑0.75mg/(kg·d))或甲基泼尼松龙(48mg)连续应用17周左右，缓解率
60％‑80％。局部作用的糖皮质激素布地奈德，可口服或灌肠使用治疗远端的UC，可有效地推迟或控制复发，并且该药的不良反应较少。二丙酸倍氯米松是一种新型的局部起效的皮质类固醇药物，该药安全性较好，主要治疗轻度到中度的活动期UC，采用回顾性多中心的方法对434例UC患者进行口服二丙酸倍氯米松(5mg/d)治疗，平均服药6.2周，缓解率和有效率分别为44.4和22.3％。

[0004] 抗肿瘤坏死因子(英夫利昔单抗)英夫利昔单抗是一种特异性阻断肿瘤坏死因子Ⅸ的单克隆抗体。对于中度到重度UC且用皮质激素治疗无效的患者，可以采用英夫利昔单抗治疗。虽然英夫利昔单抗对特定类型的UC有良好的治疗效果，但同时也存在严重的不良反应，因此临床使用时有必要密切观察服药后反应。Wilhelm等对英夫利昔单抗在UC疾病治疗中的作用研究，认为该药在治疗UC疾病方面有一定的疗效，但需要更进一步的临床试验，评估该药对疾病治疗和发展的影响。益生菌是一种可以改善微环境平衡的活性非致病性微生物，尤其在胃肠道其作用更为显著。

[0005] 益生菌主要包括酿酒用的酵母菌或乳酸菌，如乳酸杆菌和双歧杆菌，它们可以作为膳食补充剂或单独作为食品。Sang等为亍评估益生菌对UC的治疗效果，按其标准搜集了13个相关的临床随机试验，对其进行meta分析，结果认为治疗UC益生菌比安慰剂效果更佳。
Hegazy等曾将3O例轻度到中度的UC随机分为2组，进行为期8周的临床观察，一组口服柳氮磺胺嘧啶(2400g/d)，另一组口服同样剂量的含益生菌的柳氮磺嘧啶。他们认为口服含益生菌的补充剂在使患者保持缓解状态和预防复发方面是有帮助的。

[0006] 2020年3月获批的维得利珠单抗(Vedolizumab)是一种新型整合素拮抗剂，是一种肠道选择性抗淋巴细胞迁移药物，具有短期改善症状、快速疾病控制等优势，用于治疗传统疗法或TNF‑α抑制剂应答不足、失应答或不耐受的中重度活动性UC/克罗恩病(CD)成年患者。大量的真实世界研究已经证实维得利珠单抗长期治疗的疗效和安全性良好，且出现严重感染、输注相关反应和恶性肿瘤的发生率均较低。2020年11月9日，两例英夫利西单抗失应答的重症UC患者在南京大学医学院附属鼓楼医院消化科顺利完了维得利珠单抗的输注，11月18日，第三例UC患者顺利输注维得利珠单抗注射液，为该区域炎症性肠病(IBD)患者提供了全新的选择，有望造福更多IBD患者。相较系统性作用生物制剂而言，维得利珠单抗因为其可以特异性结合α4β7整合素,从而精准选择性抑制肠道炎症，所以并不影响全身性免疫功能。

[0007] 目前针对结合α4β7整合素的单克隆抗体已经有，由于α4β7和MAdCAM‑1是相互作用而起到治疗溃疡性肠炎，但是目前还没有针对MAdCAM‑1的单克隆抗体以及将所述单克隆抗体用于治疗溃疡性肠炎。

发明内容

[0008] 本发明克服现有技术的缺陷，提供一种特异性治疗溃疡性肠炎的药盒。

[0009] 具体的，所述药盒由特异性针对MAdCAM‑1的单克隆抗体和益生菌组成。

[0010] 更进一步的，所述MAdCAM‑1的单克隆抗体的轻链可变区如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

[0011] 在某些实施例中，本文提供的抗体涵盖其任何抗原结合片段。如本文所用，术语“抗原结合片段”是指由抗体的一部分形成的抗体片段，其包括一个或多个CDR或与抗原结合但不包括完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段的实例包含但不限于双功能抗体、Fab、Fab”、F(ab”)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv‑dsFv”)、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体所结合相同的抗原。

[0012] 关于抗体的“Fab”是指抗体的由通过二硫键与单一重链的可变区和第一恒定区结合的单一轻链(可变区和恒定区)组成的部分。

[0013] “Fab’”是指包含一部分铰链区的Fab片段。

[0014] “F(ab’)2”是指Fab’的二聚体。

[0015] 关于抗体(例如IgG、IgA或IgD同型)的“Fc”是指由通过二硫键与第二重链的第二和第三恒定结构域结合的第一重链的第二和第三恒定结构域组成的抗体的部分。关于IgM和IgE同型抗体的Fc进一步包括第四恒定结构域。抗体的Fc部分负责各种效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody‑dependent cell‑mediated cytotoxicity；ADCC)和补体依赖性细胞毒性(complement dependent cytotoxicity；CDC)，但不在抗原结合中起作用。

[0016] 关于抗体的“Fv”是指带有完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由与单一重链的可变区结合的单一轻链的可变区组成。

[0017] 如本文所述，本发明的抗体的氨基酸序列的微小变异，条件是氨基酸序列维持至少75％、更优选地至少80％、90％、95％，且最优选地99％的变异。特别地，预期保守氨基酸取代。保守取代是氨基酸家族中发生的那些，其与他们的侧链相关。遗传编码的氨基酸通常被分为以下家族：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和(4)不带电极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。氨基酸的其他族包括(i)丝氨酸及苏氨酸，其为脂肪族‑羟基家族；(ii)天冬酰胺及谷氨酰胺，其为含酰胺家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸，其为脂肪族家族；和(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其为芳香族家族。例如，合理预期以异亮氨酸或缬氨酸对亮氨酸分离取代、以谷氨酸对天冬氨酸分离取代、以丝氨酸对苏氨酸分离取代或以结构相关的氨基酸类似取代氨基酸将不会对所得分子的结合或特性具有重大影响，特别是如果取代不涉及框架位置中的氨基酸。氨基酸改变是否导致功能肽可以容易地通过测定多肽衍生物的特异性活性进行确定。测定方法不特别限定，可通过本领域已知方法进行测定。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以通过本领域技术人员容易地制备。优选片段或类似物的氨基‑和羧基‑端发生在功能域边界附近。结构域和功能域可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开或私人序列数据库比较来鉴定。优选地，使用计算机化比较方法来鉴定序列基序或预测的蛋白质构形域(其发生在已知结构和/或功能的其他蛋白质中)。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。

[0018] 进一步的，本发明维持人类患者溃疡性肠炎病临床缓解的药盒，其对人为300mg剂量，该组合物每4周或8周给人类患者服用一次。

[0019] 更进一步的，抗体为液体制剂形式，制剂可具有介于约6.3与约7.0之间的pH。制剂的pH可在约6.5与约6.8之间。制剂可具有介于约6.1与约7.0之间或介于约6.2与6.8之间的pH。

[0020] 在一些实施方案中，稳定液体药物制剂含有抗体、缓冲剂和至少约10mM柠檬酸盐。缓冲剂可为组氨酸缓冲剂。

[0021] 在另一方面，本发明涉及一种稳定液体药物制剂，所述制剂包含至少约100mg/ml至约200mg/ml抗体、缓冲剂和至少约5mM柠檬酸盐。缓冲剂可为组氨酸缓冲剂。

[0022] 在另一方面，本发明涉及一种稳定液体药物制剂，所述制剂包含抗体和至少约10mM柠檬酸盐。制剂可进一步含有聚山梨醇酯80。

[0023] 在另一方面，本发明涉及一种稳定液体药物制剂，所述制剂包含抗体和至少约5mM柠檬酸盐。制剂可进一步含有聚山梨醇酯80。

[0024] 在另一方面，本发明涉及一种稳定液体药物制剂，所述制剂包含抗体、柠檬酸盐、组氨酸、精氨酸和聚山梨醇酯80的混合物。制剂可存在于容器(如小瓶、药筒、注射器或自动注射器)中。

[0025] 根据另一个优选的实施方案，所述益生菌的组成为：植物乳杆菌CGMCC NO.1258和动物双歧杆菌CGMCC No.9273。所述益生菌可以被制备成为微胶囊的形式来使用。

[0026] 有益效果

[0027] 本发明提供了特异性针对MAdCAM‑1的单克隆抗体，所述抗体能够特异性结合MAdCAM‑1进而阻断α4β7和MAdCAM‑1的相互作用进而起到治疗溃疡性肠炎，同时在治疗过程中通过添加益生菌能够协同的促进相应的治疗效果，具有较好的应用前景。

附图说明

[0028] 图1SDS‑PAGE检测蛋白结果图

[0029] 图2hsp70和JNK的表达量结果图

具体实施方式

[0030] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：下述实施例中所用材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径获得。

[0031] 实施例1MAdCAM‑1的制备

[0032] 设计引物，F：5’‑TGGATCCATGCAAAGCTTGCAGGTGAAG‑3’，R：5’

[0033] ‑AAGGATCCTTAGACGGGGATGGCCTGG‑3’，以人DNA为模板，以F和R为引物，采用PCR进行扩增，条件为94℃lmin，49℃30s，72℃lmin)×5；(94℃1min，65℃30s，72℃1min)×25，共30个循环。回收PCR产物，将其克隆至pGEM‑T载体中鉴定正确后，双酶切获得MAdCAM‑1连接到pQE30载体上，重组成功的质粒,经双酶切后,电泳可产生两条带,分别是MAdCAM‑1插入片段和PQE30的载体的酶切产物。取阳性克隆分别送Invitrogen公司测序,经序列比对,测序结果与GenBank中MAdCAM‑1序列保持一致。

[0034] 将pQE30‑MAdCAM‑1重组质粒转化入M15感受态细胞,接种于LB固体培养基；37℃孵育过夜后挑取单个菌落接种于LB液体培养基；37℃振荡培养过夜。接种过夜培养的重组菌60μL至各加3mL含Amp和kana的LB培养基；37℃振荡培养至OD600约为0.5；以最佳诱导条件
1
(0.5mmol·L‑IPTG,28℃条件下诱导6h),诱导200mL菌液,沉淀以10mLPBS悬浮后超声破碎，离心10000r/min 25min，收集沉淀，沉淀用10mL包涵体洗涤液洗涤3次，再用9倍体积的含4mol/L尿素的TE缓冲液(含20mmol/Ltris‑HC1，1mmo1/L EDTA，pH8.0)洗涤，过夜，分别保留上清和沉淀，按10mL/g的比例用含8mol/L尿素的缓冲液(含0.2mol/L NaC1，0.1mol/LTris‑HCl，1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，pH8.0)溶解沉淀，4℃搅拌过夜，4℃低温离心，上清即为目的蛋白。上述包涵体裂解液用含8mol/L尿素的缓冲液(含20mmol/Ltris‑HC1，
1mmol/LEDTA，pH8.0)稀释至0.2mg/mL，加入DTT至终浓度1mmol/L，室温放置4h，用含4、3、
2mol/L尿素的透析外液(含20mmol/Ltris‑HC1，1mmol/LEDTA，3mmol/LGSH，0.5mmol/L GSSG，pH8.0)进行4℃梯度透析复性24h，将复性的溶液进行亲和纯化，SDS‑PAGE检测目标蛋白，结果如图1所示。

[0035] 从图1可以看出，泳道3为目的蛋白洗脱液，纯度较好；泳道1和泳道2为流穿液，基本没有目的蛋白，泳道1只有微弱的靶标蛋白，表明纯化较为干净。

[0036] 实施例2MAdCAM‑1单克隆抗体的制备

[0037] 1)免疫BALB/c小鼠。①第1次免疫:在100μL 0.5mg/mL实施例1制备的重组MAdCAM‑1蛋白中加入CFA 100μL进行乳化，用上述乳化液免疫6～8周龄小鼠。②第2次免疫:完成第1次免疫的2～3周后，在100μL0.5mg/mL重组MAdCAM‑1蛋白中加入IFA 100μL进行乳化，用上述乳化液第2次免疫上述6～8周龄小鼠。③第3次免疫:完成第2次免疫的2～3周后进行第3次免疫。方法同第2次免疫。第3次免疫完成后的第10天进行尾部静脉取血。2)测定抗体滴度。用1μg/mL的抗原溶液包被96孔酶标板；将1∶100的小鼠血清在96孔酶标板中进行倍比稀释，测定小鼠血清中的抗体滴度，筛选血清抗体滴度达到1∶10000以上的小鼠用于的细胞融合。3)细胞融合。取出免疫小鼠的脾脏，在无菌的组织培养皿中加入4mL细胞培养液(含
1.64％RPMI1640、0.2％NaHCO3、1％Penicillin‑streptomycin、10％灭活新生牛血清)，将脾脏放入上述组织培养皿中打碎；将NS‑1骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞在50mL离心管中按1∶10的比例混合后，1500r/min离心5min，去上清液后慢慢加入1mL50％PEG3000；用RPMI1640培养基洗去PEG3000；采用半胶质培养基克隆法筛选杂交瘤细胞；在96孔细胞培养板中培养杂交瘤细胞(37℃，5％CO2)；培养3d后用间接ELISA法筛选阳性生长的细胞克隆孔，选择其中较高读数的4株进行克隆和亚克隆，最终获得2株分泌抗MAdCAM‑1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2A4和4C7。

[0038] 将2A4杂交瘤细胞腹腔注射小鼠，等待小鼠腹腔明显变大，收集小鼠腹水。采用蛋白A柱进行纯化，将纯化好的单抗溶液装入透析袋中，将吸水剂PEG 20000撒在透析袋周围，室温下静置4h以上使溶液中的水分渗出；用Lowry法测其蛋白浓度为1.55mg/mL。

[0039] 采用小鼠单抗分型试剂盒进行鉴定，操作步骤严格按照说明书进行，经检测，2A4为Ig2a类免疫球蛋白。

[0040] 本发明制备的2A4单抗通过Western blot检测确定了其只与MAdCAM‑1结合，而不与其他诸如BSA、血浆中蛋白结合，具有较好的特异性。

[0041] 实施例3 2A4抗体特性鉴定

[0042] (1)单抗亲和力的测定：应用间接ELISA法，以1μg/mL的浓度用MAdCAM‑1包被酶标板，封闭后加入倍比稀释的纯化单抗进行孵育，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，酶标仪读取OD450nm吸光值。连续几个稀释度的OD450nm读数不再增大时视为抗原抗体100％结合，以抗体浓度(mol/L)为横坐标，OD450nm吸光值为纵坐标做散点图，以读数最大值一半时抗原抗体结合率为50％，生成对数趋势线和公式。将OD450nm最大值的一半代入公式，求出此时的抗体浓度即为亲和力解离常数(Kd)。结果显示，2A4单克隆抗体的亲和力接力常数为10
3.31×10‑ (M)，具有较好的结合效果。

[0043] (2)单抗可变区序列鉴定：

[0044] 按照制造商的说明书，用凯杰(Qiagen)RNeasy微小试剂盒(凯杰)从单细胞分选的B细胞培养物提取RNA。使用凯杰一步RT‑PCR试剂盒(凯杰，目录号：210212)扩增人类抗体基因。基于公开的现有技术设计RT‑PCR引物。RT‑PCR产物用作用于用英杰(Invitrogen)pfx50 DNA聚合酶扩增抗体可变区的嵌套式PCR中的模板，正向和反向嵌套式PCR引物的设计是基于如前所描述的在人类IgG重链和轻链可变区的构架1区开始处的序列。随后，嵌套式PCR产物用作用于将抗体轻链和重链PCR产物与连接子序列连接的重叠PCR中的模板，且用输注HD克隆试剂盒(克隆科技公司(Clontech)，目录号：639649)克隆到质粒载体中以用于测序。鉴定并获得了抗体的轻链可变区和重链可变区序列分别如下所示。

[0045] 轻链可变区序列(SEQ ID NO：1)：

[0046] DIVITQRPALMAASPGEKVTITCELQLNMFGCYAPWYQQKSGISPKPWIYSAKRRVRGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCWLYFHFWREFGAGTKLELK

[0047] 重链可变区序列(SEQ ID NO：2)：

[0048] EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSKGAMMWIKQRPGQGLEWIGWKGHPKLPWRTCKEINGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGHWNHTYMWGLGTTLAVSS

[0049] 实施例4益生菌微胶囊的制备

[0050] 益生菌的组成为：植物乳杆菌CGMCC NO.1258和动物双歧杆菌CGMCC No.9273，具体制备方法如下：

[0051] (1)菌泥的制备

[0052] 将植物乳杆菌CGMCC NO.1258和动物双歧杆菌CGMCC No.9273分别在37℃培养24h后得到发酵液；其中培养的培养基成分为：安琪酵母浸粉FM808 5g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸二胺2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.05g/L、安琪酵母蛋白胨
10g/L，使用浓度为2mol/L的食品级氢氧化钠将pH调制7.0±0.1；将发酵液菌液在4℃、
4000rpm下离心10min，弃去上清液，获得菌泥。

[0053] (2)益生菌微胶囊的制备

[0054] 称取5.0g右旋糖酐40加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解。再称取2.0g海藻酸钠粉末溶解在上述制备的右旋糖酐40溶液中，静置溶解。随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为4：1的比例与菌泥混合均匀后，通过微胶囊造粒仪，在蠕动泵泵速15ml·min‑1、2000Hz的振动频率下，形成液滴，在垂直滴入0.3M CaCl2溶液中，固化40min，洗涤过滤，备用。

[0055] (3)壳聚糖盐酸盐包衣

[0056] 稀释壳聚糖盐酸盐至7％(m/v)，在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤(2)所得物加入到壳聚糖盐酸盐溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到微胶囊。

[0057] (4)冷冻干燥

[0058] 将步骤(3)所得微胶囊加入到体积分数为5.0％的右旋糖酐40溶液中，平衡30min，随后放到‑45.0℃冰箱中预冻6h，再在‑40.0℃下真空冷冻干燥36h，得到益生菌微胶囊制剂。

[0059] 实施例5结肠炎小鼠治疗实验

[0060] 动物分组与处理：雄性Balb/c小鼠随机分为7组，分别为正常组、模型组、阴性对照(生理盐水，NS)组、单抗组、益生菌组、益生菌联合单抗处理组，每组10只。正常组自由饮用双重蒸馏水，其余5组小鼠自由饮用2.5％DSS 7d建立急性UC动物模型。从造模前2d开始，阴性组、单抗组、益生菌组、益生菌联合单抗组分别给予无菌生理盐水每次0.2ml，2次/d灌胃、单抗(腹腔内注射20mg/kg的实施例2的单克隆抗体，1次/2d)、益生菌微胶囊10mg/d灌胃、单抗(腹腔内注射20mg/kg的实施例2的单克隆抗体，1次/2d)联合益生菌微胶囊10mg/d灌胃。造模第8d上午折颈法处死小鼠，取出结肠，取部分远端结肠组织甲醛固定、石蜡包埋、切片，HE染色。实验期间每天记录小鼠体重、大便性状与隐血情况。按照综合小鼠体质量、大便性状和隐血情况进行DAI积分，结果如表1所示。

[0061] 表1各组肠炎小鼠DAI评分

[0062] 组别 n DAI评分正常组 10 0.00±0.00
模型组 10 6.90±2.01
阴性对照组 10 6.88±1.98
单抗组 10 2.38±0.85
益生菌组 10 3.84±0.90
益生菌联合单抗处理组 10 1.29±0.32

[0063] 从表1可以看出，正常对照组小鼠在饮食、活动及大便性状方面均正常，且质量有不同程度增加。其余5组小鼠在造模第3d出现体重减轻、毛发无光泽、活动减少、精神萎靡、粘液便，严重者可见肉眼血便，同时伴有不同程度的质量下降。正常组小鼠DAI积分始终维持在零水平，与各组比较差异有统计学意义(P<0.05)；模型组小鼠DAI积分相对高于其它各组，单抗组和益生菌组以及益生菌联合单抗处理组DAI积分维持在相对较低的水平，它们与模型组和阴性组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组小鼠DAI积分高达6.90，联合处理组最低达到了1.29±0.32，具有显著的降低DAI积分的效果。

[0064] 其次，组织学损伤评分：按照Dielemen等评分标准。炎症：无(0分)，轻度(1分)，重度(2分)；病变深度：无(0分)，粘膜下层(1分)，肌层(2分)，浆膜层(3分)；隐窝破坏：无(0分)，基底1/3隐窝被破坏(1分)，基底2/3隐窝被破坏(2分)，仅有完整的表面上皮(3分)，全部隐窝和上皮被破坏(4分)；病变范围(％)：0‑25计1分，26—50计2分，50‑75计3分，76‑100计4分。每个切片随机选取10个以上高倍视野(400倍)进行计分，取平均值作为组织学损伤计分。结果见表2。

[0065] 表2各组肠炎小鼠组织学评分

[0066]组别 n 组织学评分
正常组 10 0.00±0.00
模型组 10 10.56±1.89
阴性对照组 10 10.38±1.69
单抗组 10 5.20±0.77
益生菌组 10 6.93±0.56
益生菌联合单抗处理组 10 2.01±0.21

[0067] 从表2的结果可以看出，正常组小鼠结肠粘膜结构完整，腺体排列整齐，隐窝正常，杯状细胞无减少，未见粘膜糜烂、出血，无炎性细胞浸润。模型对照组与阴性对照组，结肠粘膜缺失，腺体不完整，有炎性细胞浸润，呈典型炎症改变。单抗组、益生菌组、益生菌联合单抗组组粘膜损伤程度轻，炎症细胞浸润减少，组织学评分降低，与模型和阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，特别是益生菌联合单抗处理组组织学评分只有2.01±0.21，达到了较好的治疗效果。

[0068] 免疫组织化学染色法：免疫组化SABC法检测小鼠结肠粘膜hsp70和JNK的表达，按照SABC染色试剂盒说明书步骤进行，其中以PBS代替一抗作阴性对照。结果判断以出现棕黄色颗粒为阳性，计算机图像分析系统自动记录阳性细胞平均光密度。结果如图2所示。

[0069] 从图2可以看出，正常组HSP70含量较高，各实验组含量下降，采用单抗以及益生菌治疗后，能增加其表达量，差异有统计学意义<0.05)，特别是益生菌联合单抗处理组治疗后其表达量达到了0.57±0.04。而JNK在正常组微量表达，在模型组以及阴性对照组表达显著增加，应用单抗和益生菌治疗后，能抑制其表达，差异有统计学意义(P<0.05)，特别是益生菌联合单抗处理组治疗后其表达量达到了0.08±0.005。本研究结果显示单抗联合益生菌具有较好的治疗效果其作用机制之一可能是通过抑制JNK信号传导通路和增加热休克蛋白的表达，从而达到对UC的治疗作用。

[0070] 应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。