一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料及其制备方法

摘要

本发明涉及一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料及其制备方法，所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料由复合水凝胶基质以及负载于所述复合水凝胶基质的抗菌肽；所述复合水凝胶基质由苯硼酸、线性亲水性多糖以及脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料交联形成，所述线性亲水性多糖为天然来源的并包含有羧基官能团的多糖。本发明基于苯硼酸与线性亲水性多糖以及所述脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料酯化生成动态共价键，充分利用动态共价键自身所具有的可逆性和平衡性，使所得水凝胶基质具有良好的溶胀性能，同时在一定条件下能够呈现出自修复能力，进而避免了现有水凝胶创面敷料其在使用后由于暴露在外部张力作用下或在组织活动时容易破裂或断裂的问题。

权利要求

1.一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其特征在于，包括如下具体操作步骤：S1、苯硼酸化线性亲水性多糖的制备

将线性亲水性多糖粉末溶解于纯水中，随后向该溶液中分别加入3‑氨基甲基苯硼酸以及氯化4‑(4,6‑二甲氧基‑1,3,5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉，待完全溶解后调节溶液的pH值至6.0～7.0，室温下搅拌后转移至透析袋中，在预定温度条件下用去离子水透析预定时间，得到的透析液冷冻干燥后得到所述苯硼酸化线性亲水性多糖；

其中，所述线性亲水性多糖为天然来源的并包含有羧基官能团的多糖，其选自海藻酸钠、透明质酸、羧甲基壳聚糖、肝素中的一种或多种；

3‑氨基甲基苯硼酸以及氯化4‑(4,6‑二甲氧基‑1,3,5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉所用摩尔比为1:1～1:1.5；

S2、脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料冻干粉的制备

S21、将清洗并处理好的猪小肠粘膜剪成小片后浸入含有0.25wt％胰蛋白酶以及

1mmol/L乙二胺四乙酸的PBS缓冲溶液中，在预定温度条件下搅拌预定时间，离心并收集沉淀；

S22、将步骤S21所得沉淀加入至含有1wt％聚乙二醇辛基苯基醚以及25mmol/L乙二胺四乙酸的PBS缓冲溶液中处理预定时间，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤沉淀若干次；

S23、将步骤S22所得沉淀浸入至含有30U/mL脱氧核糖核酸酶I以及10mmol/L氯化镁的PBS缓冲溶液中，在预定温度条件下搅拌预定时间，以完全去除组织中的细胞，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤沉淀若干次；

S24、将步骤S23所得沉淀用过氧乙酸浓度为0.1％的4％乙醇溶液浸泡灭菌1.5～2h，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤若干次后冻干得到冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织；

S25、按照每100mg冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织使用15mg胃蛋白酶的比例将步骤S24所得冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织与胃蛋白酶投入至乙酸溶液中，搅拌22～26h，使用滤布过滤除去较大的颗粒，随后将滤液转移到透析袋中，在预定温度条件下用去离子水透析预定时间，将滤液冻干，得到脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料冻干粉；

S3、负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备

称取预定量的步骤S1所得苯硼酸化线性亲水性多糖粉末溶解于PBS缓冲溶液中，得溶液A；称取预定量的步骤S2所得脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料冻干粉溶解于PBS缓冲溶液中，得溶液B；将天蚕素抗菌肽粉末分散至步骤溶液B中，随后将溶液A与溶液B混合均匀，即得所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料，且天蚕素抗菌肽在所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料中的浓度为0.05～1.0mg/L。

2.根据权利要求1所述的负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其特征在于：步骤S3中溶液A与溶液B的溶剂均为PBS缓冲溶液，其pH范围为7.0～8.0，溶液A中苯硼酸化线性亲水性多糖的质量浓度为5％，溶液B中脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料的质量浓度为5％，溶液A与溶液B混合的质量比为1:0.6～1:1.4。

3.根据权利要求1所述的负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述抗菌肽在溶液B中的质量浓度为0.01～0.1％。

4.根据权利要求1所述的负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其特征在于：步骤S1以及步骤S2中均使用截留分子量为6～8kDa进行透析，透析时间为2～3d。

5.根据权利要求1所述的负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其特征在于：步骤S21中为在35～40℃下搅拌5～7h；步骤S22中沉淀处理时间为23～25h；步骤S23中为在35～40℃下搅拌23～25h；步骤S24中搅拌时间为23～25h。

说明书

一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药生物材料技术领域，特别是涉及一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料及其制备方法。

背景技术

[0002] 皮肤是覆盖人体表面并直接接触外界环境的重要器官，具有感觉外界刺激、调节体温以及保护人体免受外界伤害的作用。由于与外界直接接触的特点，皮肤也成为最脆弱的组织之一。虽然大多数常见的皮肤损伤可以在一段时间内基本恢复到原来的外观，但成人皮肤损伤很难100％的恢复皮肤功能，而是通常伴随着疤痕组织的形成和皮肤附属物，如毛发，汗腺等的严重缺乏。皮肤创伤的修复分为止血，炎症，增殖，重塑四个连续协调的过程。但是，伤口愈合过程一般不能完美有序地进行，各种因素在任何阶段的影响都可能导致伤口修复异常，如过度炎症、烧伤、大面积皮肤组织损失、感染以及糖尿病等。

[0003] 创面敷料可以覆盖伤口，提供抵御外部感染的临时屏障，并作为诱导模板，引导皮肤细胞重组以及随后宿主组织的浸润和整合，显示出对伤口愈合的显著效果。理想的皮肤创面敷料应满足以下要求：(1)良好的组织相容性，无毒性或炎症；(2)良好的保湿性，能维持创面湿润环境，促进细胞水合，对创面渗出物有一定的吸收；(3)有足够的物理机械强度，保证其完整性，避免材料破损引起的外来细菌入侵。许多创面敷料已被开发出来以促进伤口修复，如半透膜、半透泡沫、水胶和水凝胶。在这些敷料中，水凝胶因其良好的亲水性、生物相容性和像细胞外基质(ECM)这样的三维多孔结构而成为最具竞争力的敷料候选材料，也引起了许多研究人员的兴趣。

[0004] 在伤口愈合过程中，细菌感染会延长炎症阶段，过度的炎症不利于伤口的愈合，因此，在敷料中添加抗菌剂是有必要的，通过添加不同的抗菌剂可以得到不同的抗菌敷料，常规的抗生素抗菌敷料虽然能够起到较好的抗菌效果，但是抗生素的过度使用易使细菌产生耐药性；常规的无机纳米粒子抗菌敷料如纳米银敷料等，虽然有较好的抗菌性能，但由于其较大的细胞毒性，不可避免的会给创面带来一定程度的损害。同时，普通的水凝胶敷料暴露在外部张力或组织活动下时容易破裂或断裂。水凝胶的破裂除了会导致自身性能恶化甚至丧失外，还会进一步引起外来细菌的入侵，导致伤口感染。

发明内容

[0005] 基于此，本发明的目的在于，提供一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料，其具有良好的抗菌作用，且具有一定自愈性能的优点。

[0006] 一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料，其由复合水凝胶基质以及负载于所述复合水凝胶基质的抗菌肽；所述复合水凝胶基质由苯硼酸、线性亲水性多糖以及脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料交联形成，所述线性亲水性多糖为天然来源的并包含有羧基官能团的多糖。

[0007] 本发明实施例所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料，其选用线性亲水性多糖以及脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料与苯硼酸交联形成复合水凝胶基质，基于苯硼酸(PBA)与线性亲水性多糖以及脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料所含有的氨基官能团与羧基官能团发生酯化反应，通过该反应交联成胶进而得到可作为创面敷料的水凝胶。该交联反应通过动态共价键的形成，充分利用动态共价键自身所具有的可逆性和平衡性，使所得水凝胶基质具有良好的溶胀性能，同时在一定条件下能够呈现出自修复能力，进而避免了现有水凝胶创面敷料其在使用后由于暴露在外部张力作用下或在组织活动时容易破裂或断裂，不仅导致自身性能恶化甚至丧失，还进一步引起外来细菌入侵，引发伤口感染的问题，同时，该动态共价键还能赋予所述水凝胶基质适宜的柔软度，使用时不会对伤口造成异物感，在伤口愈合后可轻易自创免除剥离，不会对创面造成二次损伤。

[0008] 另外，本发明中通过选用天然来源的线性亲水性多糖以及脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料，使制得的水凝胶材料具有良好的生物相容性，且脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(SIS)作为一种细胞外基质(ECM)，其免疫原性较小，绝大多数成分为I型和III型胶原，可提供一定的机械强度，同时SIS中还保留有多种细胞因子，如基本成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，这些成分对组织重塑和伤口愈合起到了重要作用，应用于创面敷料时可有效促进创面修复。

[0009] 进一步在所述复合水凝胶基质中负载抗菌肽材料，相对于无机纳米抗菌粒子以及抗生素，抗菌肽(AMPs)因其抗菌机制与抗生素不同，不容易产生耐药性，从而在众多的抗生素替代品中，AMPs因其广谱的抗菌、抗真菌、抗病毒和免疫增强作用而备受关注。抗菌肽的抗菌性能优良，且不易产生耐药性，且负载于所述复合水凝胶基质时还能够参与动态共价键的形成，进而表现出缓释的特点，可起到长效抗菌的作用。

[0010] 进一步地，所述线性亲水性多糖选自海藻酸钠、透明质酸、羧甲基壳聚糖、肝素中的一种或多种，其生物相容性良好。

[0011] 进一步地，所述抗菌肽为天蚕素抗菌肽，其为动物抗菌肽，其对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌具有很强的杀伤力，在所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料中的浓度为0.05～1.0mg/L。

[0012] 另外，本发明实施例还提供一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其包括如下具体操作步骤：

[0013] S1、苯硼酸化线性亲水性多糖的制备

[0014] 将线性亲水性多糖粉末溶解于纯水中，随后向该溶液中分别加入3‑氨基甲基苯硼酸(PBA)以及氯化4‑(4,6‑二甲氧基‑1,3,5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉(DMTMM)，待完全溶解后调节溶液的pH值至6.0～7.0，室温下搅拌后转移至透析袋中，在预定温度条件下用去离子水透析预定时间，得到的透析液冷冻干燥后得到所述苯硼酸化线性亲水性多糖；

[0015] S2、脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(SIS)冻干粉的制备

[0016] S21、将清洗并处理好的猪小肠粘膜剪成小片后浸入含有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS缓冲溶液中，在预定温度条件下搅拌预定时间，离心并收集沉淀；

[0017] S22、将步骤S21所得沉淀加入至含有聚乙二醇辛基苯基醚(Triton‑X‑100)和乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS缓冲溶液中处理预定时间，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤沉淀若干次；

[0018] S23、将步骤S22所得沉淀浸入至含有脱氧核糖核酸酶I(DNase  I)及氯化镁(MgC12)的PBS缓冲溶液中，在预定温度条件下搅拌预定时间，以完全去除组织中的细胞，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤沉淀若干次；

[0019] S24、将步骤S23所得沉淀用过氧乙酸的乙醇溶液浸泡灭菌，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤若干次后冻干得到冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织；

[0020] S25、将步骤S24所得冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织与胃蛋白酶投入至乙酸溶液中，搅拌预定时间，使用滤布过滤除去较大的颗粒，随后将滤液转移到透析袋中，在预定温度条件下用去离子水透析预定时间，将滤液冻干，得到脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料冻干粉；

[0021] S3、负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备

[0022] 称取预定量的步骤S1所得苯硼酸化线性亲水性多糖粉末溶解于PBS缓冲溶液中，得溶液A；称取预定量的步骤S2所得脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料冻干粉溶解于PBS缓冲溶液中，得溶液B；将抗菌肽粉末分散至步骤溶液B中，随后将溶液A与溶液B混合均匀，即得所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料。

[0023] 本发明实施例所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其首先使用苯硼酸对线性亲水性多糖进行改性处理，赋予其苯硼酸结构，进一步与自制脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料上所富含的氨基与羧基官能团发生反应，达到交联形成动态共价键的目的，制备方法操作简单，且对设备条件及温度条件要求低，能耗低，制备成本低，便于大规模临床应用。

[0024] 进一步地，步骤S1中3‑氨基甲基苯硼酸(PBA)以及氯化4‑(4,6‑二甲氧基‑1,3,5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉(DMTMM)所用摩尔比为1:1～1:1.5。

[0025] 进一步地，步骤S21中为使用含有0.25wt％胰蛋白酶以及1mmol/L乙二胺四乙酸的PBS缓冲溶液对猪小肠粘膜进行处理；

[0026] 步骤S22中为使用含有1wt％聚乙二醇辛基苯基醚以及25mmol/L乙二胺四乙酸的PBS缓冲溶液对步骤S21所得沉淀进行处理；

[0027] 步骤S23中为使用含有30U/mL脱氧核糖核酸酶I以及10mmol/L氯化镁的PBS缓冲溶液对步骤S22所得沉淀进行处理；

[0028] 步骤S24中为使用过氧乙酸浓度为0.1％的4％乙醇溶液对步骤S23所得沉淀浸泡灭菌1.5～2h；

[0029] 步骤S25中为按照每100mg冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织使用15mg胃蛋白酶的比例加入至乙酸溶液中搅拌22～26h。

[0030] 进一步地，步骤S3中溶液A与溶液B的溶剂均为PBS缓冲溶液，其pH范围为7.0～8.0，溶液A中苯硼酸化线性亲水性多糖的质量浓度为5％，溶液B中脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料的质量浓度为5％，溶液A与溶液B混合的质量比为1:0.6～1:1.4。

[0031] 进一步地，步骤S4中所述抗菌肽在所述复合水凝胶基质溶液中的质量浓度为0.01～0.1％。

[0032] 进一步地，步骤S21中为在35～40℃下搅拌5～7h；步骤S22中沉淀处理时间为23～25h；步骤S23中为在35～40℃下搅拌23～25h；步骤S24中搅拌时间为23～25h。

[0033] 为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

[0034] 图1为对比例1所述可自愈水凝胶创面敷料的自愈性能示意图；

[0035] 图2为实施例4中制备的SA和SA‑PBA的核磁氢谱图；

[0036] 图3为对比例1、2、3中制备的三组可自愈水凝胶创面敷料的弹性模量(G')和粘性模量(G")随角频率变化的关系图；

[0037] 图4为实施例4制得的负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料进行AMP体外释放曲线图。

具体实施方式

[0038] 为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过本发明的具体实施方式做详细的说明。

[0039] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于本发明在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不为违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受以下公开的实施例的限制。

[0040] 实施例1

[0041] 本发明实施例1提供一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料，其由复合水凝胶基质以及负载于所述复合水凝胶基质的抗菌肽；所述复合水凝胶基质由苯硼酸、线性亲水性多糖以及脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料交联形成，所述线性亲水性多糖为天然来源的并包含有羧基官能团的多糖。具体地，在本实施例中，为海藻酸钠。海藻酸钠(SA)是一种线性亲水性多糖，具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性，由于其良好的生物相容性和良好的生物可吸收性，已经在医学领域得到了广泛的应用。所述抗菌肽为天蚕素抗菌肽，其对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌具有很强的杀伤力，且不易产生抗药性，其在所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料中的浓度为0.05mg/L。

[0042] 实施例2

[0043] 本发明实施例2提供一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料，其由复合水凝胶基质以及负载于所述复合水凝胶基质的抗菌肽；所述复合水凝胶基质由苯硼酸、线性亲水性多糖以及脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料交联形成，所述线性亲水性多糖为天然来源的并包含有羧基官能团的多糖。具体地，在本实施例中，为透明质酸。透明质酸是一种酸性粘多糖，是D‑葡萄糖醛酸及N‑乙酰葡糖胺组成的双糖单位糖胺聚糖，以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。所述抗菌肽为天蚕素抗菌肽，其对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌具有很强的杀伤力，且不易产生抗药性，其在所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料中的浓度为0.5mg/L。

[0044] 实施例3

[0045] 本发明实施例3提供一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料，其由复合水凝胶基质以及负载于所述复合水凝胶基质的抗菌肽；所述复合水凝胶基质由苯硼酸、线性亲水性多糖以及脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料交联形成，所述线性亲水性多糖为天然来源的并包含有羧基官能团的多糖。具体地，在本实施例中，为羧甲基壳聚糖和肝素。羧甲基壳聚糖是一种重要的水溶性壳聚糖衍生物，其具备良好的生物相容性和生物降解性，在水凝胶和愈合创伤类生物材料中广泛应用。肝素是动物体内一种天然抗凝血物质，其能够缓解疼痛、抗凝、抑制炎症反应、促进血管再生，恢复局部血供，并能影响胶原的合成和降解，创面愈合后皮肤光滑，减轻瘢痕及瘢痕挛缩。所述抗菌肽为天蚕素抗菌肽，其对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌具有很强的杀伤力，且不易产生抗药性，其在所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料中的浓度为1.0mg/L。

[0046] 实施例4

[0047] 本发明实施例4提供一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其包括如下具体操作步骤：

[0048] S1、苯硼酸化海藻酸钠(SA‑PBA)的制备

[0049] 称取1g海藻酸钠(SA)，将其溶解于20mL纯水中，随后向该溶液中分别加入0.38g(0.25mmol)3‑氨基甲基苯硼酸(PBA)以及0.83g(0.3mmol)氯化4‑(4,6‑二甲氧基‑1,3,5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉(DMTMM)，待完全溶解后用1mol/L的盐酸溶液调节溶液的pH值至6.5，在室温下搅拌72h后转移至截留分子量为6～8kDa透析袋中，在室温条件下用去离子水透析3d，得到的透析液用台式冻干机冷冻干燥后得到所述苯硼酸化海藻酸钠(SA‑PBA聚合物偶联物)，将产物保存于干燥器中备用；

[0050] S2、脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(SIS)冻干粉的制备

[0051] S21、将新鲜的猪小肠肠道内污物去除，清洗干净，用小刀将小肠组织刮除，直到其变为半透明状得到猪小肠粘膜，将处理好的猪小肠粘膜剪切成2cm×2cm的尺寸，随后将其浸入含有0.25wt％胰蛋白酶以及1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸缓冲溶液(PBS缓冲溶液)中，于磁力搅拌器在37℃下以300rpm的转速搅拌6h，以8000rpm的转速离心并收集沉淀；

[0052] S22、将步骤S21所得沉淀加入至含有1wt％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton‑X‑100)以及25mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS缓冲溶液中处理24h，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤沉淀若干次；

[0053] S23、将步骤S22所得沉淀浸入至含有30U/mL脱氧核糖核酸酶I(DNase I)以及10mmol/L氯化镁(MgC12)的PBS缓冲溶液中，在37℃下搅拌24h，以完全去除组织中的细胞，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤沉淀若干次；

[0054] S24、将步骤S23所得沉淀用过氧乙酸浓度为0.1％的4％乙醇溶液浸泡灭菌2h，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤若干次后冻干得到冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织；

[0055] S25、按照按照每100mg冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织使用15mg胃蛋白酶的比例将步骤S24所得冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织与胃蛋白酶投入至0.5mol/L的乙酸溶液中，搅拌24h，使用滤布过滤除去较大的颗粒，随后将滤液转移到截留分子量为6～8kDa的透析袋中，在室温下用去离子水透析3d，将滤液冻干，得到脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(SIS)冻干粉；

[0056] S3、负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料(SA‑PBA/AMP/SIS水凝胶)的制备[0057] 称取0.05g的步骤S1所得SA‑PBA溶解于1mL的pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，得SA‑PBA质量浓度为5％的溶液A；称取预定量的步骤S2所得脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料冻干粉溶解于PBS缓冲溶液中，配置得到SIS质量浓度为5％的溶液B；将天蚕素抗菌肽(AMP)粉末分散至溶液B中，且抗菌肽其分散的质量浓度为0.1％，随后将溶液A与溶液B按照1:1的质量比混合均匀，即得SA‑PBA质量浓度以及SIS质量浓度均为2.5％的所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料(SA‑PBA/AMP/SIS水凝胶)，其中所述SA‑PBA/AMP/SIS水凝胶中AMP的最终浓度为0.5mg/mL。

[0058] 实施例5

[0059] 本发明实施例5提供一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其包括如下具体操作步骤：

[0060] S1、苯硼酸化海藻酸钠(SA‑PBA)的制备

[0061] 称取1g海藻酸钠(SA)，将其溶解于20mL纯水中，随后向该溶液中分别加入0.38g(0.25mmol)3‑氨基甲基苯硼酸(PBA)以及0.83g(0.3mmol)氯化4‑(4,6‑二甲氧基‑1,3,5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉(DMTMM)，待完全溶解后用1mol/L的盐酸溶液调节溶液的pH值至6.5，在室温下搅拌72h后转移至截留分子量为6～8kDa透析袋中，在室温条件下用去离子水透析2d，得到的透析液用台式冻干机冷冻干燥后得到所述苯硼酸化海藻酸钠(SA‑PBA聚合物偶联物)，将产物保存于干燥器中备用；

[0062] S2、脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(SIS)冻干粉的制备

[0063] S21、将新鲜的猪小肠肠道内污物去除，清洗干净，用小刀将小肠组织刮除，直到其变为半透明状得到猪小肠粘膜，将处理好的猪小肠粘膜剪切成2cm×2cm的尺寸，随后将其浸入含有0.25wt％胰蛋白酶以及1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸缓冲溶液(PBS缓冲溶液)中，于磁力搅拌器在35℃下以300rpm的转速搅拌5h，以8000rpm的转速离心并收集沉淀；

[0064] S22、将步骤S21所得沉淀加入至含有1wt％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton‑X‑100)以及25mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS缓冲溶液中处理24h，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤沉淀若干次；

[0065] S23、将步骤S22所得沉淀浸入至含有30U/mL脱氧核糖核酸酶I(DNase I)以及10mmol/L氯化镁(MgC12)PBS缓冲溶液中，在35℃下搅23h，以完全去除组织中的细胞，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤沉淀若干次；

[0066] S24、将步骤S23所得沉淀用过氧乙酸浓度为0.1％的4％乙醇溶液浸泡灭菌1.5h，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤若干次后冻干得到冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织；

[0067] S25、按照按照每100mg冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织使用15mg胃蛋白酶的比例将步骤S24所得冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织与胃蛋白酶投入至0.5mol/L的乙酸溶液中，搅拌23h，使用滤布过滤除去较大的颗粒，随后将滤液转移到截留分子量为6～8kDa的透析袋中，在室温下用去离子水透析2d，将滤液冻干，得到脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(SIS)冻干粉；

[0068] S3、负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料(SA‑PBA/AMP/SIS水凝胶)的制备[0069] 称取0.05g的步骤S1所得SA‑PBA溶解于1mL的pH＝7.0的PBS缓冲溶液中，得SA‑PBA质量浓度为5％的溶液A；称取预定量的步骤S2所得脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料冻干粉溶解于PBS缓冲溶液中，配置得到SIS质量浓度为5％的溶液B；将天蚕素抗菌肽(AMP)粉末分散至溶液B中，且抗菌肽其分散的质量浓度为0.1％，随后将溶液A与溶液B按照1:0.6混合均匀，即得所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料(SA‑PBA/SIS水凝胶)。

[0070] 实施例6

[0071] 本发明实施例6提供一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其包括如下具体操作步骤：

[0072] S1、苯硼酸化海藻酸钠(SA‑PBA)的制备

[0073] 称取1g海藻酸钠(SA)，将其溶解于20mL纯水中，随后向该溶液中分别加入0.38g(0.25mmol)3‑氨基甲基苯硼酸(PBA)以及0.83g(0.3mmol)氯化4‑(4,6‑二甲氧基‑1,3,5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉(DMTMM)，待完全溶解后用1mol/L的盐酸溶液调节溶液的pH值至6.5，在室温下搅拌72h后转移至截留分子量为6～8kDa透析袋中，在室温条件下用去离子水透析3d，得到的透析液用台式冻干机冷冻干燥后得到所述苯硼酸化海藻酸钠(SA‑PBA聚合物偶联物)，将产物保存于干燥器中备用；

[0074] S2、脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(SIS)冻干粉的制备

[0075] S21、将新鲜的猪小肠肠道内污物去除，清洗干净，用小刀将小肠组织刮除，直到其变为半透明状得到猪小肠粘膜，将处理好的猪小肠粘膜剪切成2cm×2cm的尺寸，随后将其浸入含有0.25wt％胰蛋白酶以及1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸缓冲溶液(PBS缓冲溶液)中，于磁力搅拌器在40℃下以300rpm的转速搅拌7h，以8000rpm的转速离心并收集沉淀；

[0076] S22、将步骤S21所得沉淀加入至含有1wt％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton‑X‑100)以及25mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS缓冲溶液中处理25h，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤沉淀若干次；

[0077] S23、将步骤S22所得沉淀浸入至含有30U/mL脱氧核糖核酸酶I(DNase I)以及10mmol/L氯化镁(MgC12)的PBS缓冲溶液中，在40℃下搅25h，以完全去除组织中的细胞，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤沉淀若干次；

[0078] S24、将步骤S23所得沉淀用过氧乙酸浓度为0.1％的4％乙醇溶液浸泡灭菌2h，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤若干次后冻干得到冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织；

[0079] S25、按照按照每100mg冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织使用15mg胃蛋白酶的比例将步骤S24所得冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织与胃蛋白酶投入至0.5mol/L的乙酸溶液中，搅拌25h，使用滤布过滤除去较大的颗粒，随后将滤液转移到截留分子量为6～8kDa的透析袋中，在室温下用去离子水透析3d，将滤液冻干，得到脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(SIS)冻干粉；

[0080] S3、负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料(SA‑PBA/AMP/SIS水凝胶)的制备[0081] 称取0.05g的步骤S1所得SA‑PBA溶解于1mL的pH＝8.0的PBS缓冲溶液中，得SA‑PBA质量浓度为5％的溶液A；称取预定量的步骤S2所得脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料冻干粉溶解于PBS缓冲溶液中，配置得到SIS质量浓度为5％的溶液B；将天蚕素抗菌肽(AMP)粉末分散至溶液B中，且抗菌肽其分散的质量浓度为0.1％，随后将溶液A与溶液B按照质量比为1:1.4混合均匀，即得所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料(SA‑PBA/SIS水凝胶)。

[0082] 实施例7

[0083] 本发明实施例7提供一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其与实施例4的区别在于：制得的负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料(SA‑PBA/AMP/SIS水凝胶)中天蚕素抗菌肽(AMP)的最终浓度为0.05mg/mL。

[0084] 实施例8

[0085] 本发明实施例8提供一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其与实施例4的区别在于：制得的负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料(SA‑PBA/AMP/SIS水凝胶)中天蚕素抗菌肽(AMP)的最终浓度为0.1mg/mL。

[0086] 实施例9

[0087] 本发明实施例9提供一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其与实施例4的区别在于：制得的负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料(SA‑PBA/AMP/SIS水凝胶)中天蚕素抗菌肽(AMP)的最终浓度为0.2mg/mL。

[0088] 实施例10

[0089] 本发明实施例10提供一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其与实施例4的区别在于：制得的负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料(SA‑PBA/AMP/SIS水凝胶)中天蚕素抗菌肽(AMP)的最终浓度为0.8mg/mL。

[0090] 实施例11

[0091] 本发明实施例10提供一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其与实施例4的区别在于：制得的负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料(SA‑PBA/AMP/SIS水凝胶)中天蚕素抗菌肽(AMP)的最终浓度为1.0mg/mL。

[0092] 对比例1

[0093] 对比例1提供一种可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其包括如下具体操作步骤：

[0094] S1、苯硼酸化海藻酸钠(SA‑PBA)的制备

[0095] 称取1g海藻酸钠(SA)，将其溶解于20mL纯水中，随后向该溶液中分别加入0.38g(0.25mmol)3‑氨基甲基苯硼酸(PBA)以及0.83g(0.3mmol)氯化4‑(4,6‑二甲氧基‑1,3,5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉(DMTMM)，待完全溶解后用1mol/L的盐酸溶液调节溶液的pH值至6.5，在室温下搅拌72h后转移至截留分子量为6～8kDa透析袋中，在室温条件下用去离子水透析3d，得到的透析液用台式冻干机冷冻干燥后得到所述苯硼酸化海藻酸钠(SA‑PBA聚合物偶联物)，将产物保存于干燥器中备用；

[0096] S2、脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(SIS)冻干粉的制备

[0097] S21、将新鲜的猪小肠肠道内污物去除，清洗干净，用小刀将小肠组织刮除，直到其变为半透明状得到猪小肠粘膜，将处理好的猪小肠粘膜剪切成2cm×2cm的尺寸，随后将其浸入含有0.25wt％胰蛋白酶以及1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸缓冲溶液(PBS缓冲溶液)中，于磁力搅拌器在40℃下以300rpm的转速搅拌7h，以8000rpm的转速离心并收集沉淀；

[0098] S22、将步骤S21所得沉淀加入至含有1wt％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton‑X‑100)以及25mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS缓冲溶液中处理25h，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤沉淀若干次；

[0099] S23、将步骤S22所得沉淀浸入至含有30U/mL脱氧核糖核酸酶I(DNase I)以及10mmol/L氯化镁(MgC12)的PBS缓冲溶液中，在40℃下搅25h，以完全去除组织中的细胞，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤沉淀若干次；

[0100] S24、将步骤S23所得沉淀用过氧乙酸浓度为0.1％的4％乙醇溶液浸泡灭菌2h，离心并收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤若干次后冻干得到冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织；

[0101] S25、按照按照每100mg冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织使用15mg胃蛋白酶的比例将步骤S24所得冻干脱细胞猪小肠粘膜下层组织与胃蛋白酶投入至0.5mol/L的乙酸溶液中，搅拌25h，使用滤布过滤除去较大的颗粒，随后将滤液转移到截留分子量为6～8kDa的透析袋中，在室温下用去离子水透析3d，将滤液冻干，得到脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(SIS)冻干粉；

[0102] S3、可自愈水凝胶创面敷料(SA‑PBA/SIS水凝胶)的制备

[0103] 称取0.05g的步骤S1所得SA‑PBA溶解于1mL的pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，得SA‑PBA质量浓度为5％的溶液A；称取预定量的步骤S2所得脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(SIS)冻干粉溶解于PBS缓冲溶液中，配置得到SIS质量浓度为5％的溶液B；将溶液A与溶液B按照1：1的质量比混合均匀，即得SA‑PBA质量浓度以及SIS质量浓度均为2.5％的可自愈水凝胶创面敷料(2.5％SA‑PBA/2.5％SIS水凝胶)。

[0104] 对比例2

[0105] 对比例2提供一种可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其区别在于：制备得到SA‑PBA质量浓度为2.5％、SIS质量浓度为1.5％的可自愈水凝胶创面敷料(2.5％SA‑PBA/1.5％SIS水凝胶)。

[0106] 对比例3

[0107] 对比例3提供一种可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其区别在于：制备得到SA‑PBA质量浓度为2.5％、SIS质量浓度为3.5％的可自愈水凝胶创面敷料(2.5％SA‑PBA/1.5％SIS水凝胶)。

[0108] 对对比例1制得的2.5％SA‑PBA/2.5％SIS水凝胶的自愈性能进行检测。具体地，请参照图1，图1为对比例1所述可自愈水凝胶创面敷料的自愈性能示意图，如图所示，本发明的技术方案通过选用线性亲水性多糖以及脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料与苯硼酸交联形成复合水凝胶基质，基于苯硼酸与线性亲水性多糖以及所述脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料所含有的氨基官能团与羧基官能团发生酯化反应，通过该反应交联成胶进而得到可作为创面敷料的水凝胶。该交联反应通过动态共价键的形成，充分利用动态共价键自身所具有的可逆性和平衡性，使所得水凝胶基质具有良好的溶胀性能，同时在一定条件下能够呈现出自修复能力。

[0109] 对实施例4中所制得的SA以及SA‑PBA进行核磁共振氢谱分析。具体地，为以氘代重水作为溶剂，分别称取3～5mg SA和SA‑PBA溶解，待溶液完全溶解至澄清后，装入干净的核磁管中，利用核磁共振光谱仪在室温条件下进行核磁结构测定，并采用MestReNova软件进行图谱分析，请参照图2，图2为实施例4中制备的SA和SA‑PBA的核磁氢谱图，从图中看出，SA‑PBA在化学位移ppm＝7～8的区间内出现吸收峰，归属于苯硼酸结构中苯环上的氢，证明SA‑PBA合成成功。

[0110] 对对比例1‑3所制得的可自愈水凝胶创面敷料进行流变学测试。具体地，为用直径为25mm的不锈钢平行板转头进行流变学测量。其中，G'表征样品的弹性模量，G"表征样品的粘性模量。将SA‑PBA及SIS溶液在模具中混合成胶后，并自所述模具中将得到的水凝胶取出，于常温下从0.1到10rad/s的进行动态应变扫描，确定水凝胶的线性粘弹性范围，记录弹性模量(G')和粘性模量(G")变化曲线，得到图3，图3为对比例1、2、3中制备的2.5％SA‑PBA/1.5％SIS、2.5％SA‑PBA/2.5％SIS、2.5％SA‑PBA/3.5％SIS三组可自愈水凝胶创面敷料的弹性模量(G')和粘性模量(G")随角频率变化的关系图，当弹性模量大于粘性模量时，水凝胶表现为凝胶态，从图中看出，当水凝胶成胶后，随着角频率的增加，G'始终大于G"，表明水凝胶能够稳定呈现为凝胶态，同时2.5％SA‑PBA/2.5％SIS组水凝胶的弹性模量要明显大于其他两组，表现出更好的强度。

[0111] 对本发明实施例4制得的负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料进行AMP体外释放实验。具体地，精密称取AMP标准品2.0mg置于10mL的容量瓶，用PH＝7.4的PBS溶解至刻度后摇匀，所得的溶液即为AMP母液。然后用PBS将AMP母液分别稀释成浓度为10μg/mL，30μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL的溶液。采用紫外分光光度计于221nm处检测溶液吸光度，根据吸光度与浓度的关系作标准曲线。按实施例4制备的负载AMP的水凝胶，将其放置到10mL PH＝7.4的PBS中，37℃摇床振荡。开始计时，分别在预先设定时间点即1、2、4、6、8、10、12、
24、48、72、96h时分别取1mL上清液于EP管，然后补加入等量的PBS缓冲溶液，于相同条件下进行后续释放实验，用紫外分光光度计检测取出的上清液中AMP吸光度，根据标准曲线计算浓度，计算AMP的累积释放百分数。每个样品平行做三次，结果以平均值和标准偏差表示，记录相关数据，并做得SA‑PBA/AMP/SIS水凝胶中AMP的体外释放曲线如图4所示，图4为实施例
4制得的负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料进行AMP体外释放曲线图，从图中可看到，AMP可在4天内从水凝胶中持续释放，起到长效抗菌的作用。

[0112] 对对比例1以及本发明实施例4、7～11所制得的水凝胶进行体外抗菌测试。具体地，为用革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌评价水凝胶的抗菌性能。将抗菌试验中的细菌光密度值(Optical Density，简称OD值)调整为0.1。将水凝胶样品与细菌悬液在37℃的生化培养箱中共培养，12h后，对共混菌液进行OD值测量。将100μL的菌悬液稀释后接种在LB琼脂平板上，37℃培养24h后计数可培养菌落数，以作为对照样品，用以下公式

[0113] AR(％)＝(Nc‑Ns)/Nc×100

[0114] 计算抗菌率(AR)，其中Nc为对照样品的平均菌落数，Ns为水凝胶样品的平均细菌菌落数，相关数据如表1所示：

[0115] 表1：不同水凝胶的体外抗菌测试结果

[0116]

[0117] 从表中看出，不添加AMP的水凝胶(对比例1)抗菌率为负值，这可能是纯水凝胶材料为细菌提供了营养物质的缘故，而添加了AMP后，水凝胶表现出抗菌性，当水凝胶中AMP浓度为0.5mg/mL时(实施例4)，其对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的抗菌率分别达到96.53％和93.22％，表明在此浓度下，水凝胶表现出良好的抗菌作用。

[0118] 综上所述，本发明实施例1～3所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料，其选用线性亲水性多糖以及脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料与苯硼酸交联形成复合水凝胶基质，基于苯硼酸(PBA)与线性亲水性多糖以及脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料所含有的氨基官能团与羧基官能团发生酯化反应，通过该反应交联成胶进而得到可作为创面敷料的水凝胶。该交联反应通过动态共价键的形成，充分利用动态共价键自身所具有的可逆性和平衡性，使所得水凝胶基质具有良好的溶胀性能，同时在一定条件下能够呈现出自修复能力，进而避免了现有水凝胶创面敷料其在使用后由于暴露在外部张力作用下或在组织活动时容易破裂或断裂，不仅导致自身性能恶化甚至丧失，还进一步引起外来细菌入侵，引发伤口感染的问题，同时，该动态共价键还能赋予所述水凝胶基质适宜的柔软度，使用时不会对伤口造成异物感，在伤口愈合后可轻易自创免除剥离，不会对创面造成二次损伤。

[0119] 另外，本发明中通过选用天然来源的线性亲水性多糖以及脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料，使制得的水凝胶材料具有良好的生物相容性，且脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料(SIS)作为一种细胞外基质(ECM)，其免疫原性较小，绝大多数成分为I型和III型胶原，可提供一定的机械强度，同时SIS中还保留有多种细胞因子，如基本成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，这些成分对组织重塑和伤口愈合起到了重要作用，应用于创面敷料时可有效促进创面修复。

[0120] 进一步在所述复合水凝胶基质中负载抗菌肽材料，相对于无机纳米抗菌粒子以及抗生素，抗菌肽(AMPs)因其抗菌机制与抗生素不同，不容易产生耐药性，从而在众多的抗生素替代品中，AMPs因其广谱的抗菌、抗真菌、抗病毒和免疫增强作用而备受关注。抗菌肽的抗菌性能优良，且不易产生耐药性，且负载于所述复合水凝胶基质时还能够参与动态共价键的形成，进而表现出缓释的特点，可起到长效抗菌的作用。

[0121] 本发明实施例4～11所述负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料的制备方法，其首先使用苯硼酸对线性亲水性多糖进行改性处理，赋予其苯硼酸结构，进一步与自制脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料上所富含的氨基与羧基官能团发生反应，达到交联形成动态共价键的目的，制备方法操作简单，且对设备条件及温度条件要求低，能耗低，制备成本低，便于大规模临床应用。

[0122] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。