一种用于番茄黄化斑驳相关病毒检测的抗体及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202210183324.8
文献号 : CN114230661B
文献日 : 2022-05-03
发明人 : 李正刚 , 何自福 , 汤亚飞 , 佘小漫 , 于琳 , 蓝国兵
申请人 : 广东省农业科学院植物保护研究所
摘要 :
本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种用于番茄黄化斑驳相关病毒检测的抗体及其制备方法和应用。本发明要解决的技术问题是为TYMaV的检测提供一种新选择。本发明还提供了一种用于番茄黄化斑驳相关病毒检测的抗体，该抗体以TYMaV的核衣壳N基因的编码蛋白为抗原制备得到。本发明还进一步提供了所述抗体的制备和应用方法。本发明克隆了番茄黄化斑驳相关病毒的核衣壳N基因序列，并对序列进行了分析和实验，获得了可用于制备番茄黄化斑驳相关病毒检测抗体的抗原序列。利用该抗体可以快速准确检测番茄及其他感病样品中的番茄黄化斑驳相关病毒，为番茄黄化斑驳相关病毒的监测、诊断及致病机制研究具有重要的应用价值。
权利要求 :
1.一种用于番茄黄化斑驳相关病毒检测的抗体，其特征在于，该抗体以TYMaV的核衣壳N基因的编码蛋白为抗原制备得到；所述TYMaV的核衣壳N基因序列的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2第213～412位所示，TYMaV的核衣壳N基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1第
637～1236位或SEQ ID No.5所示；所述抗体的制备方法，包括如下步骤：将SEQ ID No.1第
637～1236位或SEQ ID No.5所示核苷酸克隆到原核表达载体上，转化大肠杆菌，收集表达蛋白；以表达蛋白为免疫原对模式动物进行三次免疫注射，在第一次免疫一个月后开始收集血清，分离纯化得到抗体。
2.采用权利要求1所述抗体检测番茄黄化斑驳相关病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤： 样品制备，SDS‑PAGE电泳，转膜至硝酸纤维素膜上，封闭，一抗反应，二抗反应，显色，检测；一抗为权利要求1所述抗体，所述二抗为羊抗兔HRP。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，在一抗反应中，在封闭液中按照1︰2000稀释比例加入抗体。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于，在二抗反应中，按1︰10000比例稀释比例加入羊抗兔HRP二抗。
说明书 :
一种用于番茄黄化斑驳相关病毒检测的抗体及其制备方法和
应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种用于番茄黄化斑驳相关病毒检测的抗体及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 番茄是全世界范围内重要的蔬菜和水果作物，同时也被广泛应用于生物和非生物胁迫科学研究。在番茄生产过程中，病毒病是为害番茄的主要病害之一，病毒病具有种类
多、变异快、防控难的特点，快速准确鉴定出病毒种类对番茄病毒病的防控具有重要作用。
多、变异快、防控难的特点，快速准确鉴定出病毒种类对番茄病毒病的防控具有重要作用。
[0003] 番茄黄化斑驳相关病毒 (tomato yellow mottle‑associated virus, TYMaV)是近几年在番茄上刚发现的新病毒，造成番茄叶片卷曲、皱缩、黄化斑驳等症状，影响了番茄
的生长及产量 （Xu et al. Journal of Virology, 2017, 91 (11):e00173‑17）。TYMaV是
胞质弹状病毒属病毒，其基因组为13000 nt左右的负义单链RNA。除了可以侵染番茄，TYMaV
的其他寄主目前暂无报道，TYMaV的传播方式也未知。对TYMaV的检测方式仅限于RT‑PCR，无
抗原抗体相关检测方法。
的生长及产量 （Xu et al. Journal of Virology, 2017, 91 (11):e00173‑17）。TYMaV是
胞质弹状病毒属病毒，其基因组为13000 nt左右的负义单链RNA。除了可以侵染番茄，TYMaV
的其他寄主目前暂无报道，TYMaV的传播方式也未知。对TYMaV的检测方式仅限于RT‑PCR，无
抗原抗体相关检测方法。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是为TYMaV的检测提供一种新选择。
[0005] 本发明还提供了一种用于番茄黄化斑驳相关病毒检测的抗体，该抗体以TYMaV的核衣壳N基因的编码蛋白为抗原制备得到。
[0006] 进一步的，所述TYMaV的核衣壳N基因序列的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2第213～412位所示。
[0007] 具体的，TYMaV的核衣壳N基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1第637～1236位或SEQ ID No.5所示。
[0008] 本发明还提供了所述抗体的制备方法，包括如下步骤：将SEQ ID No.1第637～1236位或SEQ ID No.5所示核苷酸克隆到原核表达载体上，转化大肠杆菌，收集表达蛋白；
以表达蛋白为免疫原对模式动物三次免疫注射，在第一次免疫一个月后开始收集血清，分
离纯化得到抗体。
以表达蛋白为免疫原对模式动物三次免疫注射，在第一次免疫一个月后开始收集血清，分
离纯化得到抗体。
[0009] 本发明还提供采用所述抗体检测番茄黄化斑驳相关病毒的方法，包括如下步骤：包括如下步骤： 样品制备，SDS‑PAGE电泳，转膜至硝酸纤维素膜上，封闭，一抗反应，二抗反
应，显色，检测。
应，显色，检测。
[0010] 具体的，在一抗反应中，在封闭液中按照1︰2000稀释比例加入抗体。
[0011] 其中，在二抗反应中，按1︰10000比例稀释比例加入羊抗兔HRP二抗。
[0012] 本发明的有益效果：本发明克隆了番茄黄化斑驳相关病毒的核衣壳N基因序列，并对序列进行了分析和实验，获得了可用于制备番茄黄化斑驳相关病毒检测抗体的抗原序
列。并进一步纯化核衣壳蛋白并制备核衣壳蛋白多克隆抗体，利用该抗体可以快速准确检
测番茄及其他感病样品中的番茄黄化斑驳相关病毒，为番茄黄化斑驳相关病毒的监测、诊
断及致病机制研究具有重要的应用价值。
列。并进一步纯化核衣壳蛋白并制备核衣壳蛋白多克隆抗体，利用该抗体可以快速准确检
测番茄及其他感病样品中的番茄黄化斑驳相关病毒，为番茄黄化斑驳相关病毒的监测、诊
断及致病机制研究具有重要的应用价值。
附图说明
[0013] 图1、N蛋白二级结构分析。
[0014] 图2、N蛋白亲疏水性、抗原性分析。
[0015] 图3 、蛋白小量纯化表达检测结果，M为Marker，1为未诱导对照（BL21），2和3为IPTG诱导的pET30a‑N（213～412）。
[0016] 图4、蛋白大量表达的检测结果；M：Marker；1：超声后全菌；2：超声后上清；3：超声后沉淀。
[0017] 图5、蛋白纯化检测结果；M：Marker；1：纯化蛋白稀释5倍；2：纯化蛋白稀释10倍。
[0018] 图6、蛋白纯化检测结果；M：Marker；1：蛋白原样；2：流穿；3：15mM 咪唑洗脱；4：60mM 咪唑洗脱；5～7：500mM 咪唑洗脱。
[0019] 图7、抗体效价检测。
[0020] 图8、实际样品检测结果；S1、S2、S3：样品1、2、3；H：健康对照；α‑TYMaVN代表抗体。
具体实施方式
[0021] 下述实施例中用到的主要试剂、遗传资源和设备
[0022] JM109大肠杆菌感受态细胞：上海唯地生物技术有限公司 （DL1020）
[0023] BL21大肠杆菌感受态细胞：上海唯地生物技术有限公司 （EC1002）
[0024] Taq酶：宝生物工程（大连）有限公司 （R004Q）
[0025] pMD19‑T载体：北京全式金生物技术股份有限公司 (CT301‑01)
[0026] 质粒提取试剂盒：北京全式金生物技术股份有限公司 （EM101‑01）
[0027] 基因合成：北京华大蛋白质研发中心有限公司
[0028] 引物合成：生工生物工程（上海）股份有限公司
[0029] 镍柱：GE Healthcare （17531806）
[0030] 基因测序：北京擎科生物科技有限公司
[0031] 实施例1 TYMaV N基因全长克隆
[0032] 提取TYMaV侵染病样总RNA，反转录成cDNA。设计PCR引物扩增N基因全长，PCR引物为：N‑F（SEQ ID No.3）atgaacactttggcattacaattgt和N‑R（SEQ ID No.4）
ttactcgttgggtgtagcagcat。扩增体系：cDNA 3 μL，N‑F 1 μL，N‑R 1 μL，rTaq Mix 10 μL，
ddH2O 5 μL，总体积 20 μL。扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，32
个循环；72℃ 8 min，4℃ 1 min。扩增产物连接到pMD‑19T载体上，测序得到N基因全长序列
为1239bp（SEQ ID No.1），其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2。
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个循环；72℃ 8 min，4℃ 1 min。扩增产物连接到pMD‑19T载体上，测序得到N基因全长序列
为1239bp（SEQ ID No.1），其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2。
[0033] SEQ ID No.1：N基因全长序列
[0034] atgaacactttggcattacaattgtcaaacaccgattacgatgacctagcttcgataacagtagcgcctggaggaagcaatgttgcgtggaatgatgaagacgtgtcgtctattaggcgatattctctagctgtgatggattct
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tgagtacggttcatctggctgccaatttgcgagacccagataacatcactcagtgcctactgatgacaccacccca
ttcgagaccggcgataatccaaacgacactccccaccattagagctattcaagaggatattacagaagaagaaaga
aacactctagcgctgttgaatgtcgatgtaaatatagagaatcaggacaatggcaatcagaaccgtcaagaagaga
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tcagtgtcgttcggctcagaatgtgtccggtggattgagaagggctatcgatcgattcaagacatggtacgatggc
aacaccgacatcttcgatgatatcagtttctctatagatgcgctgaatcagctgaaggaagcgatatctagaaagc
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[0035] SEQ ID No.2：N蛋白氨基酸序列
[0036] MNTLALQLSNTDYDDLASITVAPGGSNVAWNDEDVSSIRRYSLAVMDSPTMVLHGGYVFESLNNNTRVDTNVLMSTVHLAANLRDPDNITQCLLMTPPHSRPAIIQTTLPTIRAIQEDITEEERNTLALLNVDVNIENQDNGNQNR
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[0037] 利用geneious和DNAstar Lasergene软件对N蛋白序列二级结构及亲疏水性、抗原性等分析，分析结果见图1和图2，分析显示，N蛋白具有较大跨膜区，二级结构也比较多，综
合比较分析N蛋白213 412aa具有较好的抗原表位，容易表达，所以选取213～412aa作为免
~
疫原制备抗体。
合比较分析N蛋白213 412aa具有较好的抗原表位，容易表达，所以选取213～412aa作为免
~
疫原制备抗体。
[0038] 实施例2 蛋白表达纯化
[0039] 根据大肠杆菌蛋白表达偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下， 对N基因213～412 aa编码核苷酸序列进行密码子优化，优化后原核表达序列如SEQ ID No.5所示。
[0040] SEQ ID No.5：优化后原核表达序列
[0041] gatgcattaaatcaactaaaagaagctataagccgtaaaccggagattacctcgacctgggttttgtacttggcggttaccgagaacgagaaaaccctgctgaagcagtccaagggtatgattgaatacctgggcctgcaagta
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[0042] 合成以上核苷酸序列，并通过酶切连接方法构建到pET30a载体上，酶切及测序验证。将验证好的载体pET30a‑N（213～412aa）转化BL21大肠杆菌。从转化的平板挑单克隆到
1.5 mL含相应抗性的 LB液体培养基中，37℃，200 rpm培养。培养至OD=0.6 0.8，IPTG（0.5
~
mM）诱导，37℃，200 rpm培养2 h。取1 mL诱导的菌液，12000 rpm，离心1 min，弃上清，沉淀
用50 100 μL 10 mM Tris‑HCl（pH8.0）溶液吹散（加入缓冲液的量视菌体量而定），加入与
~
缓冲液等体积的 2×loading buffer，100℃煮5 min，12% SDS‑PAGE电泳检测。检测结果见
图3，经过IPTG诱导的样品可以表达出预期大小的蛋白 (2和3泳道)，未经IPTG诱导则没有
目的蛋白表达，说明该蛋白可以成功诱导表达。
1.5 mL含相应抗性的 LB液体培养基中，37℃，200 rpm培养。培养至OD=0.6 0.8，IPTG（0.5
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用50 100 μL 10 mM Tris‑HCl（pH8.0）溶液吹散（加入缓冲液的量视菌体量而定），加入与
~
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图3，经过IPTG诱导的样品可以表达出预期大小的蛋白 (2和3泳道)，未经IPTG诱导则没有
目的蛋白表达，说明该蛋白可以成功诱导表达。
[0043] 进一步的进行了蛋白大量表达的检测。具体如下：接100 μL活化的菌液到 5 mL相应抗性 LB液体培养基中，37℃培养过夜，200 rpm。将培养的菌液转接到250 mL相应抗性
LB液体培养基中，37℃，200 rpm，培养至OD=0.6～0.8，IPTG（0.5 mM）16℃诱导过夜。收菌：
8000 rpm，离心6 min。弃上清。超声破菌：菌体用20～30 mL 10 mM Tris‑HCl（pH 8.0）溶液
吹散，超声波破碎（500 W，180次，每次5 s，间隔5 s）。 电泳确定表达形式：取100 μL超声后
的菌悬液，12000 rpm，离心10 min，取50 μL上清至另一EP管，上清去除干净后沉淀用50 μL
10 mM Tris‑HCl（pH 8.0）溶液吹散。12% SDS‑PAGE电泳检测。检测结果见图4，结果显示目
的蛋白绝大部分在沉淀中，上清中只有少部分。
LB液体培养基中，37℃，200 rpm，培养至OD=0.6～0.8，IPTG（0.5 mM）16℃诱导过夜。收菌：
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吹散，超声波破碎（500 W，180次，每次5 s，间隔5 s）。 电泳确定表达形式：取100 μL超声后
的菌悬液，12000 rpm，离心10 min，取50 μL上清至另一EP管，上清去除干净后沉淀用50 μL
10 mM Tris‑HCl（pH 8.0）溶液吹散。12% SDS‑PAGE电泳检测。检测结果见图4，结果显示目
的蛋白绝大部分在沉淀中，上清中只有少部分。
[0044] 进一步的，对蛋白大量表达后收集的沉淀进行纯化。具体如下：
[0045] （1）20 30 ml 10 mM Tris‑HCl（pH8.0）溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10 ~
min。
min。
[0046] （2）12000 rpm，离心10 min，上清转入另一管中保存。
[0047] （3）20 30 mL 10 mM Tris‑HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，静置10 min。~
[0048] （4）12000 rpm，离心10min，弃上清。
[0049] （5）重复（3）、（4）一次。
[0050] （6）先加入少量的10 mM Tris‑HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，再加5 10 mL含8 M尿素~
的10 mM Tris‑HCl（pH8.0）溶液溶解蛋白。
的10 mM Tris‑HCl（pH8.0）溶液溶解蛋白。
[0051] （7）12000 rpm，离心10 min，收集上清，取50 μL进行12% 的SDS‑PAGE电泳检测。检测结果见图5，结果显示加入8M尿素可以将目的蛋白从沉淀中溶解出来。
[0052] 用8M尿素是为了将目的蛋白溶解在上清中以便于下一步继续纯化；如果目的蛋白绝大部分在上清中，那加8M尿素步骤则可省略。继续纯化是因为上一步获得的上清不仅有
目的蛋白，还有很多其他杂蛋白，所以需要利用镍柱将目的蛋白特异吸附分离纯化，最终获
得仅包含目的蛋白的溶液。进一步纯化的具体如下：
目的蛋白，还有很多其他杂蛋白，所以需要利用镍柱将目的蛋白特异吸附分离纯化，最终获
得仅包含目的蛋白的溶液。进一步纯化的具体如下：
[0053] （1）用去离子水洗镍柱（Ni Sepharose 6 Fast Flow，GE Healthcare），至pH 7.0。
[0054] （2）挂镍，至pH 2 3。~
[0055] （3）去离子水洗柱至pH 7.0。
[0056] （4）10mM Tris‑HCl（pH 8.0）溶液平衡镍柱，约100 mL。
[0057] （5）含8M尿素、0.5 M氯化钠的10 mM Tris‑HCl（pH 8.0）溶液平衡镍柱，约50 mL。
[0058] （6）稀释样品上样。样品中含0.5 M氯化钠、8 M尿素、10 mM Tris‑HCl（pH 8.0）。
[0059] （7）上样结束后，用含8M尿素、0.5 M氯化钠的10 mM Tris‑HCl（pH 8.0）溶液洗柱。
[0060] （8）分别用含15 mM咪唑、60 mM咪唑、500 mM咪唑的10 mM Tris‑HCl（pH 8.0）（含8 M尿素、0.5 M氯化钠）溶液洗脱，分别收集蛋白峰。
[0061] （9）12% SDS‑PAGE电泳检测蛋白纯化效果。检测结果见图6，结果显示60 mM及500 mM咪唑洗脱效果较好，杂蛋白较少，量也比较充足，可以用于抗体制备。
[0062] 实施例3抗体制备
[0063] 1. 免疫
[0064] 1)免疫用兔子为2.0kg左右的新西兰大白兔。免疫之前耳静脉取阴性血清：用75%酒精擦拭兔子耳部静脉，擦至静脉充分扩张；用注射器插入静脉抽取阴性血1～2 mL；全血
在室温静置30～120min后，5000rpm离心10min，收取血清。
在室温静置30～120min后，5000rpm离心10min，收取血清。
[0065] 2)取400μg目的蛋白，用生理盐水稀释到200～500μL，再加入等体积弗氏佐剂（初次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂）；用混匀仪器将溶液和佐剂混匀，形
成油包水；将混匀好的免疫原进行背部皮下注射免疫，打8～10个点。
成油包水；将混匀好的免疫原进行背部皮下注射免疫，打8～10个点。
[0066] 3)每隔12天进行一次加强免疫，每次免疫量为200μg蛋白，共进行三次加强免疫。
[0067] 4)最后一次加强免疫后7天进行耳静脉取血，然后进行ELISA免疫效价测定。
[0068] a)试剂配制
[0069] 包被液：碳酸钠‑碳酸氢钠缓冲液，pH9.6
[0070] PBS缓冲液pH7.4
[0071] 封闭液：1%BSA或脱脂奶粉 in PBS
[0072] 洗液：PBST（0.05%吐温，PBS）
[0073] 显色液：1%A液+10%B液（A液：含1%TMB 的 DMSO；B液：含0.1% H2O2 的柠檬酸缓冲液）
[0074] 终止液：2M硫酸
[0075] 二抗：山羊抗兔IgG/HRP
[0076] b)实验步骤
[0077] [1]用包被液稀释抗原，终浓度为2μg/mL，100μL/孔，4℃，过夜；后用洗液洗涤2次。
[0078] [2]封闭液封闭，200μL/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗涤1次。
[0079] [3]多抗血清从200倍开始2倍梯度稀释（in PBS），空白对照（blank）为PBS，阴性对照（negative）为阴性血清200倍稀释（in PBS）；均为100μL/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液洗涤
3次。
3次。
[0080] [4]加入PBS稀释20000倍的二抗，100μL/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗涤3次。
[0081] [5]显色，显色液100μL/孔，显色时间为5～15min。
[0082] [6]每孔加入50μL终止液终止。
[0083] [7]双波长（450nm，630nm）测吸光值，记录保存数据，并进行分析。结果见表1和图7，抗体效价达到了102400，符合要求。
[0084] 表1 TYMaV‑N抗体效价测定
[0085] 名称 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 102400 空白 阴性Anti‑TYMaV‑N(213～412aa) 1.506 1.502 1.535 1.407 1.388 1.385 1.33 1.22 1.127 0.925 0.085 0.381
[0086] 5)颈动脉取阳性血：用麻醉剂麻醉兔子（戊巴比妥钠，30mg/kg，静脉、腹腔、肌肉注射均可）；兔子麻醉后，用固定架固定；用手术器械剪开脖子外层皮毛，于气管侧面下方找到
颈动脉，止血钳夹紧动脉管并剪断放血，收集，5000rpm离心10min，两次离心后收取血清。
颈动脉，止血钳夹紧动脉管并剪断放血，收集，5000rpm离心10min，两次离心后收取血清。
[0087] 实施例4 实际样品检测
[0088] 试剂配制：2×SDS loading buffer；上层胶缓冲液；下层胶缓冲液；Arc‑Bis；5×SDS电泳buffer；10×TBST缓冲液；转膜缓冲液；脱脂奶粉；ECL化学发光显色液。
[0089] 1)样品制备：称取植物组织样本，研磨后加入300～400 μL 1×SDS loading buffer，充分混匀，沸水浴10 min，离心，12000 rpm，10 min，取上清。
[0090] 2)SDS‑PAGE凝胶电泳：取上清20 μL，进行SDS‑PAGE电泳，120V，2h左右，待溴酚蓝跑出后停止。
[0091] 3)转膜：电转移方法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上（200 mA，60 min）。
[0092] 4)封闭：将膜浸入含有5%脱脂奶粉的1×TBST缓冲液中，37℃孵育2h。
[0093] 5)一抗反应：封闭结束后在封闭液中按照1︰2000稀释比例加入TYMaV‑N抗体，37℃孵育1h。
[0094] 6)二抗反应：一抗反应结束后，将膜在1×TBST缓冲液中漂洗3次，每次10 min。然后按1:10000比例加入羊抗兔HRP二抗，37℃孵育40 min。
[0095] 7)ECL显色：二抗反应结束后，将膜在1×TBST缓冲液中漂洗3次，每次10 min。加入化学发光底物，通过化学发光仪查看结果。
[0096] 结果见图8，发病样品中可以检测到大小为46 kDa N蛋白的条带，而健康对照则没有条带，说明所制备的抗体可以成功用于TYMaV病毒的检测。