椿象红球菌WM36在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用

摘要

本发明公开了椿象红球菌WM36在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用。本发明的椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)WM36具有0～12‰的盐度适应能力，可适应盐度交替变化的咸淡水养殖环境。本发明的椿象红球菌WM36应用于含氮水产养殖尾水处理领域，对水产养殖对象无不良影响，具有较高的水生生物生物安全性；并且对诺氟沙星、链霉素、硫酸庆大霉素、盐酸四环素、环丙沙星、左氧氟沙星等多种临床常用抗生素表现为敏感，生态安全性较高，具有良好的经济及环保效益，应用前景广阔。

权利要求

1.椿象红球菌（Rhodococcus rhodnii）WM36在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用，所述的椿象红球菌WM36保藏号：GDMCC No：61717，所述的咸淡水含氮污水的盐度范围为4‰~

12‰；所述的脱氮是去除咸淡水含氮污水中的 三种无机氮元素。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的咸淡水是咸淡水养殖尾水。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是在咸淡水含氮污水中接种椿象红球菌WM36，进行培养，对污水脱氮。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的咸淡水含氮污水的pH值为7。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的培养，温度为35℃。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的咸淡水含氮污水的中C/N为10 40。

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7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的培养为碳源使用柠檬酸钠、C/N=10、pH=7、T=35℃、盐度范围=4‰ 12‰。

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说明书

椿象红球菌WM36在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用

技术领域：

[0001] 本发明属于养殖尾水处理领域，具体涉及具有椿象红球菌WM36在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用。背景技术：

[0002] 咸淡水养殖是在河口等盐度变化水域进行水产养殖的一种方式。

[0003] 海鲈，又称花鲈，学名Lateolabrax maculatus，是我国海水养殖鲈鱼的主要种类。花鲈通常生活在近海海域，尤其喜欢生活在河口咸淡水湖泊中。花鲈属于肉食性鱼类，性凶猛。自然条件下，幼体主要捕食糠虾和端足类等，成体以虾类、鱼类为主食。人工养殖条件下，摄食人工配合颗粒饲料。花鲈肌肉营养价值高，其氨基酸组成丰富，富含人体所必需优质氨基酸，且比例均衡。脂肪酸以不饱和脂肪酸为主，高不饱和脂肪酸EPA和DHA含量高，号称 DHA之王。然而，海鲈养殖生产方式粗放，配套设施简陋，“高密度、强投饲”现有养殖的典型特征导致的养殖环境恶化，病害发生频率增加，养殖产量、品质不稳定，养殖风险加剧，影响市场竞争力和养殖效益。近年来，海鲈集约化养殖技术问题，包括种苗来源及质量、饲料营养、病害防治及养殖管理等受到人们关注。养殖水域污染、养殖品质已成为影响海鲈养殖提质增效的关键。

[0004] 以及 等水体浓度过高是海鲈养殖区主要的超标项，亦是评价养殖水体很重要的指标，它们的毒性也会直接影响水产养殖对象的生存和水产品质量。
生物脱氮是生物滤池设施中的关键生化过程。异养硝化‑好氧反硝化(HN‑AD)作为一种新型的生物脱氮技术，不但能够成功克服不同需氧量引起的硝化反硝化不相容问题，与自养生物相比，异养生物还拥有对有机底物更好的利用、更高的耐氧性和脱氮率等优势，近年来受到广泛关注。但至今为止对此类HN‑AD细菌的研究尚未完善，仍需要分离纯化得到更多的高效、稳定的 HN‑AD菌株作进一步确定。

[0005] 利用微生物降解水体中无机氮是进行养殖尾水处理的重要方法。目前已开发出硝化菌、反硝化菌、枯草芽孢杆菌等菌剂。然而，咸淡水养殖水域盐度交替变化，范围介于 0.5‰～12.0‰，目前针对广盐性咸淡水养殖水体的无机氮去除的菌种筛选及应用仍需加强。
发明内容：

[0006] 本发明的目的是提供椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)WM36在处理咸淡水含氮污水脱氮中的应用。椿象红球菌WM36具有较广的盐度适应能力，可被应用于去除咸淡水中无机氮元素及具有高效异养硝化和好氧反硝化功能，还具有水生生物安全性高、环境安全性高等特点，在咸淡水养殖尾水的脱氮处理方面具有很大的应用价值。

[0007] 优选，所述的咸淡水是咸淡水养殖尾水。

[0008] 优选，所述的脱氮是去除咸淡水含氮污水中的 三种无机氮元素。

[0009] 优选，是在咸淡水含氮污水中接种椿象红球菌WM36，进行培养，对污水脱氮。

[0010] 优选，所述的咸淡水含氮污水的pH值为7。

[0011] 优选，所述的培养，温度为15℃～35℃。

[0012] 优选，所述的咸淡水含氮污水的中C/N为10～40。

[0013] 优选，所述的咸淡水含氮污水的盐度生长范围为0～12‰。

[0014] 优选，所述的培养为碳源使用柠檬酸钠、C/N＝10、pH＝7、T＝35℃、SAL＝0～12‰。

[0015] 本发明所说的咸淡水指的是盐度介于淡水与海水之间的水域，大多见于河海交汇处。涨潮、退潮带来的盐度波动。

[0016] 本发明的椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)WM36具有0～12‰的盐度适应能力，可适应盐度交替变化的咸淡水养殖环境。本发明的椿象红球菌WM36应用于含氮水产养殖尾水处理领域，对水产养殖对象无不良影响，具有较高的水生生物生物安全性；并且对诺氟沙星、链霉素、硫酸庆大霉素、盐酸四环素、环丙沙星、左氧氟沙星等多种临床常用抗生素表现为敏感，生态安全性较高，具有良好的经济及环保效益，应用前景广阔。

[0017] Rhodococcus rhodnii WM36于2021年06月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心 (GDMCC)，保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No.61717。附图说明：

[0018] 图1为椿象红球菌WM36在营养琼脂平板上的菌落形态结果图；

[0019] 图2为椿象红球菌WM36的扫描电镜图及菌体大小统计结果图；

[0020] 图3为椿象红球菌WM36的革兰氏染色结果图；

[0021] 图4为椿象红球菌WM36的鱼类毒性试验结果图；

[0022] 图5为椿象红球菌WM36的常用抗生素耐药性实验结果图；

[0023] 图6为椿象红球菌WM36在不同有机碳源和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比结果图；

[0024] 图7为椿象红球菌WM36在不同pH和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比结果图；

[0025] 图8为椿象红球菌WM36在不同C/N和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比结果图；

[0026] 图9为椿象红球菌WM36在不同温度和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比结果图；

[0027] 图10为椿象红球菌WM36在不同盐度梯度和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮效果对比结果图；

[0028] 图11为在广东省珠海市斗门区昭信村(东经E:113°36′41″，北纬N:22°19′84″)取样现场图；

[0029] 图12为椿象红球菌WM36在广东省珠海市斗门区昭信村咸淡水养殖尾水中脱氮处理应用结果图；具体实施方式：

[0030] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步详细说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0031] 实验中 三种氮元素的测定与分析方法均参考于国标，其中的测定与分析根据《水质‑氨氮的测定‑纳氏试剂分光光度法》(GB HJ535‑2009)；
的测定与分析根据《水质‑硝酸盐氮的测定‑紫外分光光度法》(GB HJ/T346‑2007)；
的测定与分析根据《水质‑亚硝酸盐氮的测定‑分光光度法》(GB 7493‑87)。

[0032] 实验所用到的基础培养基使用121℃，20min高压蒸汽灭菌，其配方如下：

[0033] 微量元素溶液(g/L)：EDTA 50g，ZnSO4·7H2O 5.02g，CuSO4·5H2O 1.57g，FeSO4·7H2O 5.0g， CoCl2·6H2O 1.61g，(NH4)6Mo7O2·4H2O 1.1g，CaCl2·2H2O 5.5g，MnCl2·4H2O
5.06g，pH 6.0；

[0034] 富集培养基(g/L)：KH2PO4 1.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，Na2HPO4 7.9g，二水柠檬酸钠6.45g， NaNO3 0.8415g，NH4Cl 0.192g，NaNO2 0.362g，微量元素溶液2mL，pH 7.2；

[0035] BTB固体培养基(g/L)：二水柠檬酸钠6.45g，1％BTB(溴麝香草酚蓝)乙醇溶液1mL， KH2PO4 1.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，Na2HPO4 7.9g，NaNO3 0.8415g，NH4Cl 0.192g，NaNO20.362g，微量元素溶液2mL，琼脂20g，pH 7.0～7.5；

[0036] 单一氮源发酵培养基(DMⅠ)(g/L)：二水柠檬酸钠6.45g，KH2PO4 1.5g，MgSO4·7H2O0.01g，Na2HPO4 7.9g，NH4Cl 0.6036g，微量元素溶液2mL，pH 7.0；

[0037] 单一氮源发酵培养基(DMⅡ)(g/L)：二水柠檬酸钠6.45g，MgSO4·7H2O 0.01g，KH2PO4 1.5g，Na2HPO4 7.9g，NaNO3 0.9590g，微量元素溶液2mL，pH 7.0；

[0038] 单一氮源发酵培养基(DMⅢ)(g/L)：二水柠檬酸钠6.45g，KH2PO4 1.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，Na2HPO4 7.9g，NaNO2 0.375g，微量元素溶液2mL，pH 7.0。

[0039] 实施例1

[0040] 一、样品采集

[0041] 本发明的水质及底泥样品从淡水养殖池塘水样、底泥混合物中筛选分离获得；样品采集根据《土壤环境监测技术规范》(HJ/T 166‑2004)中的“混合样品采集方法”，采用梅花点采样法定点取样，从养殖池塘中采集表层、中层以及深层水体和底泥于无菌采样袋中，4℃冷藏运输储藏备用。

[0042] 二、菌株富集、分离与筛选

[0043] 样品预处理：分别取池塘底泥和水样，在超净工作台内接入装有无菌生理盐水的大口三角烧瓶中，并放入少许灭菌的玻璃珠，振荡打散底泥样品，使泥样中的微生物充分悬浮于生理盐水中。

[0044] 初步富集培养与平板涂布：取22.2mL上述混合液体加入到装有200mL富集培养基的 500mL锥形瓶中，摇床内30℃，180r/min培养2～3天。每天向富集培养基中加入1mL浓度为质量百分比5％的NH4Cl溶液以保持培养基内 离子浓度。水样则取10ml接种于含90ml富集培养基的300mL大口三角烧瓶中，摇床内30℃，180r/min振荡1h。分别取(1) 中经过预处理的泥样原液1mL，于超净工作台内接入装有9mL无菌生理盐水的试管中，移液枪轻轻吹打或震荡混匀。从该试管取出1mL液体接入到新的装有9mL无菌生理盐水的试管中，重‑2 ‑8 ‑2 ‑8
复该操作，依次把底泥和水样原液梯度稀释为10 ～10 浓度。分别取10 ～10 浓度梯度的底泥和水样浓度的原液100μL～200μL，涂布于BTB固体平板培养基中，每个梯度设置3 个平行组，1个空白对照组，对照组以等量的无菌生理盐水涂布，在恒温生化培养箱中30℃倒置培养2～3天。

[0045] 分离纯化及初筛：用接种环挑取上述不同形态的菌落。采用平板划线分离法在BTB固体平板培养基上划线进行分离纯化，挑取单菌落反复划线纯化3～4次。点接初筛：使用接种针挑取纯化后菌株点接于BTB反硝化鉴定培养基中培养2～3天。根据菌落生长情况和菌落周围 BTB培养基中蓝色晕圈大小挑选出反硝化能力高的菌株，通常来说蓝色晕圈越大，反硝化能力越高。接种于斜面30℃恒温培养2～3天后试管置于4℃保藏。

[0046] 硝化与反硝化性能复筛：用接种环取上述得到的菌株活化斜面接种于营养肉汤中，再以 1％的接种量分别接种至以NH4Cl、NaNO3以及NaNO2作为唯一无机氮源的DMⅠ、DMⅡ以及DMⅢ发酵培养基中，30℃，180r/min震荡培养，0h、24h、48h取培养液测其OD600。5000r/min， 5min低速离心后取上清液，分别测定 三种氮元素含量。由此获得菌株WM36。

[0047] 三、菌株种属鉴定

[0048] 提取菌株WM36的DNA，以菌株DNA为模板进行16S rDNA扩增，扩增上游引物(27F)：5'‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3'，下游引物(1492R)：5'‑GGCTACCTTGTTACGACTT‑3'。采用常规扩增体系进行PCR。1％琼脂糖凝胶电泳分析结果。PCR产物测序由上海生物工程有限公司完成。菌株的16s rDNA序列长度为1423bp，核苷酸测序结果如下(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)：

[0049] GGAAGGCGGGTGCTTACCATGCAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTTCGGGGGTACACG AGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCAGAGGCTGCATGGCTTTTGGTGGAAAGGTT TACTGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACG GCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGG ACGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTA GGCGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAAACCAGCAGCTCAACTGCTGGCTTGCAGGCGATA CGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTG AGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAA GCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGT TTGACATATACCGGAAAGCCGTAGAGATACGGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA CCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCAC ACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTA GTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAG CCGTCGAAGGTGATCGTCAGTT。

[0050] 菌株革兰氏反应阴性(图3)，菌体长为1.42±0.31μm，宽为0.56±0.06μm，直杆状，无鞭毛(图2)；菌落在营养琼脂上为白色不透明，表面干燥，呈圆形、扁平状，边缘完整(图 1)。

[0051] 表1菌株WM36生理生化特征

[0052]

[0053]

[0054] 注：“+”为阳性；“‑”为阴性

[0055] 综合菌株的16s rDNA测序结果、细菌形态、菌落形态以及生理生化等各项鉴定项目，判断菌株为椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)。查阅相关资料发现尚无以椿象红球菌 (Rhodococcus rhodnii)净化养殖尾水或其他含氮污水中无机氮的相关报道。该菌株命名为椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)WM36，该菌株已于2021年06月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：61717，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070。

[0056] 四、椿象红球菌WM36环境安全评价

[0057] 1、鱼类毒性试验：选取体长在3±1cm范围内，健康的斑马鱼(Danio rerio)(购置于广东省广州市荔湾区芳村花地湾的广州花地湾花鸟鱼虫批发市场)，于持续曝气的大水体中暂养与稳定30～45天，期间正常喂食与定期换水。状态稳定后随机分配到15L玻璃缸中，设置加入菌液的实验组和加入等体积无菌水的对照组，每个实验组30条斑马鱼，每组设置3个重复。取过夜培养的菌液，3000r/min，5min离心后弃上清，用无菌PBS缓冲液重悬，重复1～2次后用灭菌水悬浮，根据测定的标准曲线得到OD600与菌浓度之间的关系，调节实验6
水体中菌量约1×10CFU/mL，空白对照组则加入等量的灭菌水。实验期间，实验对象正常喂养且每三天对实验水体进行完全更换，换水后重复上述方法分别加入菌液和灭菌水，记录下每个组斑马鱼存活率，实验持续10d。

[0058] 2、常用抗生素耐药性实验：抗生素耐药性实验(抗生素纸片药敏试验)评判标准根据《抗菌药物敏感性试验的技术要求》(WS/T 639‑2018)(见表2)，实验方法依据上述标准中的“纸片扩散法”要求进行。具体步骤如下：

[0059] a)配制MHA(广东环凯微生物科技有限公司)平板，校正pH 7.2～7.4；

[0060] b)使用打孔器和定性滤纸打出直径约6mm的纸片，灭菌后干燥备用；

[0061] c)根据抗菌药物种类制作对应药物含量的纸片；

[0062] d)取菌株分别接种于营养肉汤培养基中，30℃，180r/min培养至对数期；

[0063] e)取100～150μL菌液在MHA平板上均匀涂布，室温干燥5min；

[0064] f)用无菌镊子将含有抗生素的纸片贴于MHA平板中央，每个实验重复3次，另设置3 个含有无菌水的纸片贴于MHA平板中央作为空白对照；

[0065] g)15min内倒置平板，于30℃恒温培养18h；

[0066] h)使用IP54金属壳数显游标卡尺(永康市晶思达贸易有限公司)测量抑菌圈直径；

[0067] 表2抗生素耐受性评判标准

[0068]

[0069]

[0070] 鱼类毒性试验中，在正常条件下养殖10天，对照组斑马鱼存活率为100％，实验组6 4
含菌量约为10CFU/mL，高于常见病原菌的致病剂量(10CFU/mL)。实验组斑马鱼存活率高于 
96.7％，与对照组无显著差异(p>0.05)。初步判断椿象红球菌WM36具有较高的水生生物生物安全性(见图4)。菌株WM36抗生素耐药性实验结果显示(表3和图5)，椿象红球菌WM36 对所使用的多种常见临床抗生素皆表现为敏感(图5)，表明其生态安全性较高。实验同时为做好菌株使用环节中的防范和应急措施提供指导。

[0071] 表3抗生素耐药性实验

[0072]

[0073] 五、椿象红球菌WM36最优生长及脱氮条件

[0074] 不同有机碳源对椿象红球菌WM36生长及脱氮性能影响

[0075] 选择草酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠以及柠檬酸钠四种碳源，固定C/N＝10，30℃、180r/min、 pH＝7.0。以DM发酵培养基为基础，草酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠四种有机碳源每升培养基加入量分别为0.67g、0.81g、0.41g、1.29g；作为单一无机氮源的NH4Cl(DMⅠ)、 NaNO3(DMⅡ)、NaNO2(DMⅢ)每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入不同有机碳源的上述反硝化培养基中，于0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h 取培养液测定其OD600，5000r/min，5～10min低速离心后取上清分别测定 三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析选择草酸钠、琥珀酸钠、乙酸钠以及柠檬酸钠四种不同的有机碳源对椿象红球菌WM36生长情况及好氧反硝化作用的影响。

[0076] (2)不同C/N对椿象红球菌WM36生长及脱氮性能影响

[0077] 选择柠檬酸钠作为反硝化培养基碳源，固定30℃、180r/min、pH＝7.0等条件，设置C/N 梯度为10、20、30、40。每种梯度的培养基柠檬酸钠加入量为1.29g/L、2.58g/L、3.87g/L、 5.16g/L；作为单一无机氮源的NH4Cl(DMⅠ)、NaNO3(DMⅡ)、NaNO2(DMⅢ)每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以 30℃，180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入上述反硝化培养基中，于0h、8h、16h、
24h、32h、40h、48h取培养液测定其OD600，5000r/min，5～10min低速离心后取上清分别测定三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白
对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析10、20、30、40四种不同的C/N 对椿象红球菌WM36生长情况及好氧反硝化作用的影响。

[0078] (3)不同pH对椿象红球菌WM36生长及脱氮性能影响

[0079] 固定C/N＝10，30℃、180r/min、柠檬酸钠为单一有机碳源等条件，设置pH梯度为5、6、7、8、9。作为单一无机氮源的NH4Cl(DMⅠ)、NaNO3(DMⅡ)、NaNO2(DMⅢ)每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以 30℃，180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入上述反硝化培养基中，于0h、 8h、16h、24h、
32h、40h、48h取培养液测定其OD600，5000r/min，5～10min低速离心后取上清分别测定三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白
对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析5、6、7、8、9四种不同的pH 对椿象红球菌WM36生长情况及好氧反硝化作用的影响。

[0080] (4)不同温度对椿象红球菌WM36生长及脱氮性能影响

[0081] 固定C/N＝10、pH＝7.0、180r/min、柠檬酸钠为单一有机碳源等条件，设置温度梯度为15℃、 20℃、25℃、30℃、35℃。作为单一无机氮源的NH4Cl(DMⅠ)、NaNO3(DMⅡ)、NaNO2(DMⅢ) 每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入上述反硝化培养基中，于0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h取培养液测定其OD600，5000r/min，5～10min低速离心后取上清分别测定 三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析15℃、20℃、25℃、30℃、 35℃五种不同的温度对椿象红球菌WM36生长情况及好氧反硝化作用的影响。

[0082] (5)不同盐度对椿象红球菌WM36生长及脱氮性能影响

[0083] 固定C/N＝10、pH＝7.0、180r/min、T＝30℃柠檬酸钠为单一有机碳源等条件，通过改变与调整培养基中NaCl的浓度，设置培养基盐度梯度为0‰、4‰、8‰、12‰。作为单一无机氮源的NH4Cl(DMⅠ)、NaNO3(DMⅡ)、NaNO2(DMⅢ)每升培养基加入量分别为0.02675g、0.04g、0.0345g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，180r/min培养1天，再以1％(v/v)的接种量，分别接入上述反硝化培养基中，于0h、8h、16h、24h、32h、40h、 48h取培养液测定其OD600，5000r/min，5～10min低速离心后取上清分别测定
三种氮元素含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析0‰、4‰、8‰、12‰四种不同的盐度对椿象红球菌WM36生长情况及脱氮作用的影响。

[0084] 通过图6对比分析可以看出，椿象红球菌WM36能够用柠檬酸钠和乙酸钠等有机碳源生长。在使用乙酸钠生长时生长速度减慢；最适宜的生长和脱氮的pH为7(图7)；在C/N为 10‑40范围内皆能生长且降解 而C/N条件在20‑40范围内时， 和 的降
解能力受到抑制(图8)；温度梯度实验表明，椿象红球菌WM36在T＝35℃时的生长速度和无机氮降解效率明显要大于15‑30℃(图9)；盐度梯度实验中，菌株WM36在0～12‰的盐度范围内，生长速度和无机氮降解效率皆不受影响(图10)，说明菌株WM36对盐度的适应范围广。综上所述，该菌最佳生长和脱氮条件为碳源使用柠檬酸钠、C/N＝10、pH＝7、T＝35℃，盐度生长范围为0～12‰。 最高可分别达到82.6％、94.6％、86.1％。

[0085] 六、椿象红球菌WM36在咸淡水养殖尾水的应用

[0086] 采集珠海市斗门区昭信村咸淡水养殖区养殖池塘与生态沟渠的水样(图11)，现场使用光学盐度计测量取样点水质的盐度值。4℃冷藏运输回实验室备用，并于当天完成水样的无机氮元素指标测定。分别取60‑100mL养殖池塘与生态沟渠的水样，过滤去除固体颗粒与悬浮物后，使用0.22μm/25mm针头式过滤器过滤灭菌，转移至经过高压蒸汽灭菌的锥形瓶内备用。取菌株WM36接种于营养肉汤培养基中，以30℃，180r/min活化18h，再以1％(v/v) 的接种量将处于对数期的菌液分别接入两种水样中，30℃，180r/min震荡培养。于0h、12h、 24h、48h、72h取水样测定其OD600，5000r/min、5～10min低速离心后取上清分别测定三种氮元素含量。

[0087] 经分析，咸淡水养殖区养殖池塘与生态沟渠的基本水质数据均值如表4所示。

[0088] 表4咸淡水养殖区水质数据

[0089]

[0090] 由于养殖区的生态沟渠与昭信村河涌相连接，水体盐度交替变化(图11)，造成表4中养殖池塘与生态沟渠水体中的盐度不一致。从无机氮处理结果的数据可知，菌株WM36能同时适应盐度为2‰的养殖池塘水体和盐度值为8‰的生态沟渠养殖尾水，能在其中生长并降解净化水体的无机氮。利用菌株WM36处理72h后，养殖池塘水样中的降解率最高可分别达到68.2％、95.2％、85.4％，期间无 积
累；生态沟渠养殖尾水水样中的 降解率最高可分别达到44.8％、
87.5％、69.5％，期间无 积累(图12)。说明本发明菌种在咸淡水养殖尾水处理能力方面具有重要的应用价值。

[0091] 本发明的椿象红球菌WM36应用于含氮咸淡水养殖尾水处理领域，该菌株盐度适应范围广，对水产养殖对象无不良影响，具有较高的水生生物生物安全性；并且对多种临床常用抗生素表现为敏感，生态安全性较高。因此适宜在淡水、咸淡水(盐度≤12‰)的养殖水体应用；其同时具有异养硝化和好氧反硝化功能；可利用多种有机碳源，具有较好的水体有机碳去除能力，具有良好的经济及环保效益，应用前景广阔。

[0092] 上述实施例并不是对本发明的实施例进行限定，而是为了说明本发明所作的举例。对于熟知该领域的研究人员而言，在上述实施例的基础上仍可做出其他变动和润饰。凡是属于本发明的实施例或技术方案范围内所作出的引申或改动仍处于本发明的专利涵盖范围之列。