猕猴桃转录因子AcARF1基因在抗灰霉病中的应用

摘要

一种猕猴桃转录因子AcARF1基因在猕猴桃果实抗灰霉病中的应用，该基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。本发明通过将植物激素生长素途径转录因子AcARF1抑制表达后,通过实验证实抑制表达AcARF1基因能够增强猕猴桃对灰霉病菌的抗性,具体表现为接种病毒后与对照相比,本发明获得的转基因果实的发病症状减轻,发病率降低,病菌含量减少,为猕猴桃抗病育种提供重要的基因库及新的种质资源。

权利要求

1.一种猕猴桃转录因子AcARF1基因在猕猴桃果实抗灰霉病中的应用，该基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示，通过抑制表达该AcARF1基因增强猕猴桃果实对灰霉病菌的抗性。

2. 一种包含猕猴桃转录因子AcARF1基因的工程菌，其特征在于：该基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示。

说明书

猕猴桃转录因子AcARF1基因在抗灰霉病中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种猕猴桃转录因子AcARF1基因在果实抗灰霉病中的应用。

背景技术

[0002] 猕猴桃(Actinidia Chinensis)营养丰富，素有“水果之王”等美誉。我国是猕猴桃的起源地和主产区，据联合国粮农组织(FAO)统计，2018年我国猕猴桃栽培面积达16.8万公顷，年产量约203.5万吨(http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC)。然而猕猴桃果实易遭受多种真菌病原菌的侵害而腐烂变质。由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病通常给猕猴桃产业造成高达30％以上的损失，严重威胁猕猴桃产业的健康发展。目前关于猕猴桃灰霉病的研究主要集中在应用防治、抗病生理及抗病蛋白筛选等方面。国内外关于猕猴桃对灰霉病抗性的分子机制研究相对迟缓，目前对抗灰霉病相关基因功能、调控机制还未见报道。

发明内容

[0003] 本发明目的在于提供一种猕猴桃AcARF1基因的新应用，通过抑制该基因的表达从而显著增强猕猴桃对灰霉病菌的抗性。

[0004] 本发明目的通过如下技术方案实现：

[0005] 一种猕猴桃转录因子AcARF1基因在猕猴桃果实抗灰霉病中的应用，该基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

[0006] 其中SEQ ID NO.1序列长度:1599bp；组成为436A；341C；385G；437T；百分比:27.3％ A；21.3％ C；24.1％ G；27.3％ T。分子量(kDa):ssDNA(单链):494.53dsDNA(双链):985.71。

[0007] 生长素响应因子(Auxin response factor,ARF)是IAA信号转导的关键因子，本发明根据红阳猕猴桃基因组数据库，克隆了猕猴桃AcARF1基因，并采用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术鉴定了该基因在灰霉病抗性中的功能。

[0008] 采用上述基因编码的蛋白在猕猴桃果实抗灰霉病中的应用，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且能表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

[0009] 本发明还提供一种包含上述猕猴桃转录因子AcARF1基因的工程菌。

[0010] 本发明具有如下有益效果：

[0011] 本发明通过将植物激素生长素途径转录因子AcARF1抑制表达后,通过实验证实抑制表达AcARF1基因能够增强猕猴桃对灰霉病菌的抗性,具体表现为接种病毒后与对照相比,本发明获得的转基因果实的发病症状减轻,发病率降低,病菌含量减少,为猕猴桃抗病育种提供重要的基因库及新的种质资源。

附图说明

[0012] 图1：本发明AcARF1基因在转基因农杆菌侵染猕猴桃后对照组中的表达量。

[0013] 图2：抑制表达AcARF1与对照组猕猴桃受灰霉菌侵染的表型观察。

[0014] 图3：抑制表达AcARF1与对照组猕猴桃受灰霉菌侵染3天和6天的病斑面积统计。

[0015] 图4：抑制表达AcARF1与对照组猕猴桃受灰霉菌侵染3天和6天POD活性变化。

[0016] 图5：抑制表达AcARF1与对照组猕猴桃受灰霉菌侵染3天和6天SOD活性变化。

[0017] 图6：抑制表达AcARF1与对照组猕猴桃受灰霉菌侵染3天和6天总酚含量变化。

具体实施方式

[0018] 下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本领域技术人员理解本发明，但本发明不限于具体实施方式的范围。

[0019] 以下实施例中涉及的各载体、猕猴桃品种‘红阳’猕猴桃，以及各种试剂均为市售，猕猴桃灰葡萄孢菌菌株由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供(ACCC CAASF‑122)。

[0020] 实施例1猕猴桃转录因子AcARF1基因的获得

[0021] 采用RNAiso Plus Kits(Takara,Japan)提取猕猴桃总RNA,采用TransScript All‑in‑One First‑Strand cDNA Synthesis Supermix for qPCR(One‑Step gDNA Removal)Kit(TransGen，China)反转录合成cDNA,总RNA采用Takara isoplus试剂盒提取。猕猴桃叶加入液氮研磨成粉，装入RNase‑free的1.5ml离心管中，加入1ml Fruitmate(Takara)试剂颠倒混匀后于4℃×12000g离心5min，将600μl上清液转移至新管，加入600μl RNAiso Plus，静置5min后4℃×12000g离心5min。将上清液转移到新管中加入300μl氯仿颠倒混匀，静置5min，4℃×12000g离心15min。将上清液转移至新的离心管，加600μl异丙醇混匀后静置10min，4℃×12000g离心10min。弃上清，沉淀中加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀4℃×
7500g离心5min，弃上清并风干。加入30μl RNase‑free ddH2O溶解沉淀。对所得的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统中进行成像分析。以总RNA为实验模板，采用全式金TransScript OneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒合成反转录产物。1.5ml的离心管中依次加入10μl 2×ES Reaction Mix,5μl Total RNA，2μl RNase‑free Water,1μl gDNA Remover,1μlEasyScript@RT/RI Enzyme，1μl Oligo(dT)，42℃孵化
30min，再于85℃孵化5s以终止反应。置于‑20℃冰箱保存。

[0022] 采用如下引物序列进行PCR扩增：

[0023] 上游引物：atgattacgtttatagattcgaaagat(SEQ ID NO.3)

[0024] 下游引物：caatccccactcaacattcc(SEQ ID NO.4)

[0025] 扩增产物连接至克隆载体pMD‑19T simple vector(TransGen，China)，转化大肠杆菌Top10,筛选阳性克隆进行测序验证，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，再利用ORF Finder软件将所得基因翻译成氨基酸序列，按氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0026] SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为红阳猕猴桃的AcARF1序列信息(CDS)。序列长度:1599bp。组成：436A；341C；385G；437T。百分比:27.3％ A；21.3％ C；24.1％ G；27.3％ T。分子量(kDa):ssDNA(单链):494.53dsDNA(双链):985.71。

[0027] SEQ ID NO.2所示的编码氨基酸序列信息：Translation of DNAMAN1(1‑1599)通用codeTotal amino acid number:532,MW＝59449；Max ORF starts at AA pos 1(may be DNA pos 1)for 532AA(1596bases),MW＝59449ORIGIN。

[0028] 实施例2 AcARF1基因的遗传转化

[0029] 1、表达载体构建：

[0030] PCR克隆基因干扰片段：以猕猴桃cDNA为模板，使用Phanta Super‑Fidelity DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增。PCR反应体系如表1所示，反应程序如表2所示，PCR反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中进行观察分析。将正确扩增的条带切胶回收，并进行琼脂糖凝胶电泳检测，将回收得到的片段保存于‑20℃。电泳检测条带单一，切胶回收目的基因片段、片段长度395bp，如SEQ ID NO.7序列所示，采用如下引物：

[0031] 上游引物ccatccatccatctttcacc(SEQ ID NO.5)

[0032] 下游引物acgggggaaattgtatcctc(SEQ ID NO.6)。

[0033] 表1 PCR反应体系

[0034]名称 用量
cDNA 2μl
5×SF Buffer 5μl
ZoCCoAOMT‑Ford(短引物) 1μl
ZoCCoAOMT‑Rev(短引物) 1μl
10Mm dNTPMix 0.5μl
Phanta Super‑Fidelity DNA Polymerase 0.5μl
ddH2O 15μl
Total Volume 25μl

[0035] 表2 PCR反应条件

[0036]

[0037] 将上述AcARF1的SEQ ID NO.7所示基因片段连接至克隆载体pMD‑19B(全式金)，XbaI/BamHI双酶切回收的AcARF1基因片段和pTRV2载体，纯化回收基因片段和载体骨架，T4DNA连接酶酶连后转化大肠杆菌DH5α，涂布Kana抗性平板，对抗性菌落进行PCR检测，并从中挑取PCR阳性的菌样提取质粒，采用载体上通用引物：RV‑XIAYOU(5’aacctaaaacttcagacacg3’)(SEQ ID NO.8)进行测序。测序结果和参考序列相一致。将构建好的AcARF1‑pTRV2载体和pTRV1按照1：1比例混合转化农杆菌GV301。

[0038] 2、抗病性分析

[0039] 上述农杆菌GV301通过注射方式瞬时转化授粉后130d大小均匀、无损伤、无病虫害的近成熟状态‘红阳’猕猴桃果实。随后每天固定时间在注射孔周围取材并于‑80度冰箱保存。采用qRT‑PCR技术检测AcARF1的表达量，7天后该基因表达量明显下降(图1)。随后采用10μL灰葡萄孢菌(104‑106个/mL)孢子悬浮液和无菌水分别对转基因组及对照组猕猴桃果实进行侵染。表型观察(图2)和病斑面积(图3)统计结果显示，在灰葡萄孢菌侵染3天时已经可以看到两组猕猴桃腐烂程度出现明显的差异；6天时对照组猕猴桃果实伤口周围发生大面积腐烂，AcARF1发生沉默的果实伤口处则表现出相对轻微的腐烂症状。进一步检测转基因及对照组猕猴桃在灰葡萄孢菌侵染过程中防御酶、抗性物质含量的变化(图4‑6)。采用愈创木酚法测定过氧化物酶POD活性，以每分钟内470nm处的光密度增加0.01为1个酶活力单位；采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定超氧化物歧化酶SOD活性，以抑制NBT光化还原50％的酶用量为1个酶活力单位；采用福林酚法测定总酚含量。结果显示，AcARF1沉默表达后POD、SOD及总酚含量均有所增加，且在灰霉菌侵染后3天增加明显。这些结果说明灰葡萄孢菌侵染可以诱导猕猴桃果实POD、SOD酶活性和总酚含量增加，而AcARF1沉默表达的果实受灰霉菌侵染后相关生理指标的增加更明显。