一种提高山新杨抗旱性的MYB转录因子及其应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高山新杨抗旱性的MYB转录因子及其应用，所述MYB转录因子为MYB6，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明的转录因子MYB6正向调控山新杨的抗旱能力，利用转基因技术将转录因子MYB6过量表达可以获得耐旱的山新杨，可以为培育山新杨抗旱新品种提供基础。

权利要求

1.一种MYB转录因子在提高山新杨抗旱性中的应用，其特征在于，通过过表达山新杨中所述MYB转录因子来实现的，所述MYB转录因子为MYB6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种提高山新杨抗旱性的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用农杆菌介导的瞬时转化技术将包含权利要求1中所述MYB转录因子的重组表达载体转化到山新杨中。

说明书

一种提高山新杨抗旱性的MYB转录因子及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高山新杨抗旱性的MYB转录因子及其应用。

背景技术

[0002] 目前，我国国土的荒漠化、干旱、半干旱以及盐碱化比较严重，在拟新增造林林地中，困难立地占60％以上，使得造林难度加大。因此，选育优质、高抗的林木新品种是迫切需要解决的问题，其对生态环境的修复、森林功能的改善以及生态安全建设都起着重要的支撑作用。并且，由于干旱、半干旱面积占国土面积的一半以上，严重制约林业的产出和发展，因此，培育抗旱新品种是林业生产中亟待解决的关键问题。

[0003] 植物为了适应各种非生物胁迫，进化出了各种代谢途径和调控机制，由多基因参与，形成一个复杂的基因调控网络，其中，转录因子是调控胁迫响应基因表达的分子开关，相比功能基因，转录因子可以调控逆境中多个相关功能基因的表达，在很大程度上决定了植物对逆境胁迫的抗性大小。作为植物内分布最广的一类转录因子，MYB类转录因子广泛参与植物生长发育和各种代谢过程。当植物遭遇逆境胁迫时，MYB类转录因子可以通过其信号传导网络，迅速调节相关功能基因的表达，进而启动一系列生理生化反应，最终降低或者消除逆境对植物的伤害。

[0004] 山新杨树干通直，树姿秀丽整洁美观，生长速度快，不飞絮，具有重要的生态、观赏与经济价值。全球气候变化下频繁发生的干旱等极端天气严重影响山新杨的产出和发展，因此，挖掘具有增强山新杨抗旱能力的优质MYB类转录因子及利用其培育山新杨抗旱新品种，是当前山新杨生产迫切需要解决的科学问题。

发明内容

[0005] 本发明的目的之一是提供一种提高山新杨抗旱性的MYB转录因子，所述MYB转录因子为MYB6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0006] 本发明的目的之二是提供由所述提高山新杨抗旱性的MYB转录因子编码的蛋白。

[0007] 本发明的目的之三是提供含有所述提高山新杨抗旱性的MYB转录因子的重组过表达载体。

[0008] 进一步的，所述的重组过表达载体，是将SEQ ID NO.1所示的目的序列重组到pROK II载体上获得的。

[0009] 本发明的目的之四是提供含有所述的重组过表达载体的重组表达转化体。

[0010] 进一步的，所述重组表达转化体的宿主为农杆菌。

[0011] 本发明的目的之五是提供所述提高山新杨抗旱性的MYB转录因子在转化山新杨以提高山新杨抗旱性中的应用，通过促进山新杨中所述MYB转录因子的表达来实现的。

[0012] 本发明的目的之六是提供一种提高山新杨抗旱性的方法，包括以下步骤：

[0013] 利用高效瞬时转化技术将所述的重组表达转化体瞬时转化到山新杨中；

[0014] 或利用根癌农杆菌介导法，将所述的重组表达载体稳定遗传转化到山新杨中。

[0015] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0016] 本发明通过对山新杨MYB6转录因子进行干早胁迫下的表达分析以及对其瞬时转化山新杨后进行生理指标检测和稳定遗传转化后的组织化学染色分析，结果证实MYB6可以显著提高杨树的抗旱能力，可以利用其定向改造山新杨的抗旱能力，为培育山新杨抗旱新品种提供基础。

附图说明

[0017] 图1为MYB6转录因子在山新杨根、茎、叶中的表达。

[0018] 图2为MYB6转录因子过表达载体瞬时转化到山新杨中蛋白浓度(A)、SOD活性(B)、POD活性(C)和H2O2浓度(D)的检测结果。

[0019] 图3为MYB6过表达载体稳定遗传转化到山新杨中的卡那霉素抗性苗，a：愈伤组织，b：芽的分化，c‑e：生根苗。

[0020] 图4为MYB6稳定遗传转化过表达株系的PCR检测，图中，1：PCR扩增的模板为野生型山新杨DNA(对照)，2‑5：PCR扩增的模板分别为4个pROK II‑MYB6过表达株系山新杨植株的DNA，M：DNA Marker(DL2000)。

[0021] 图5为MYB6稳定遗传转化过表达株系的qRT‑PCR分析。

[0022] 图6为MYB6稳定遗传转化过表达株系的组织化学染色分析，DAB染色(A)、NBT染色(B)、EB染色(C)。

具体实施方式

[0023] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0024] 实施例1：山新杨MYB6转录因子的表达分析

[0025] 对两个月大的山新杨土培苗进行7个时间点的干旱胁迫处理(以水处理作为对照)，然后分别提取根、茎、叶组织的RNA，反转录成cDNA后，进行MYB6转录因子的实时荧光定量PCR(qRT‑PCR)分析。

[0026] 结果如图1所示，MYB6在山新杨的根、茎、叶中均呈现为上调表达，其中在处理12h的叶中表达量为对照组的3.6倍，在处理6h的根和茎中表达量分别为对照组的5.625倍和4.48倍，该结果说明MYB6与山新杨的抗旱性相关。

[0027] 实施例2：山新杨MYB6转录因子的瞬时侵染及生理指标检测

[0028] 以山新杨cDNA为模板，利用引物MYB6‑F(5′‑CTCTAGAGGATCCCCGGGATGGATGTTAAAG‑3′)和MYB6‑R(5′‑TCGAGCTCGGTACCCGGGTCACAAGTTGTT‑3′)扩增SEQ ID NO.1所示的目的基因序列，将目的基因序列重组到pROK II载体上得到重组过表达载体，利用电击转化法将其转入农杆菌感受态细胞EHA105中，然后利用高效瞬时转化技术将其瞬时转化到山新杨中，进行干旱胁迫出理后，进行生理指标检测，具体实验步骤如下：

[0029] 1)MYB6过表达载体的高效瞬时转化山新杨：

[0030] 用50ml的1/2MS液体培养基(加入150μM的乙酰丁香酮)等比例重悬含有MYB6过表达载体的农杆菌菌体(OD600nm为0.5‑0.6)，28℃，180rpm摇1h。将培养3周的山新杨组培生根苗放入培养基中侵染12h；然后用20％PEG胁迫处理12h。

[0031] 2)利用南京建成的试剂盒进行总蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢(H2O2)的生理指标检测。

[0032] 结果如图2所示，其中植物总蛋白的含量结果如图2A所示，在干旱胁迫下，植物体内正常的蛋白质合成会受到抑制。因此，转基因后植物的总蛋白含量越高，说明基因的抗逆性越强。

[0033] 超氧化物歧化酶(SOD)的活性结果如图2B所示，SOD能够通过催化超氧阴离子自由基的歧化反应，抵御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的损伤，有效地增强植物的抗逆功能，因此，转基因后植物SOD活性越高，说明基因的抗逆性越强。

[0034] 过氧化物酶(POD)活性结果如图2C所示，POD是清除植物体内氧自由基伤害的重要保护酶，与植物的抗逆能力密切相关。在本研究中，转基因后植物的POD活性越高，说明基因的抗逆性越强。

[0035] H2O2含量结果如图2D所示，是细胞内的氧化代谢产物，H2O2的含量越高代表细胞的受损伤程度越大，植物的抗逆境胁迫能力也就越差。在本项目中，转基因后植物的H2O2含量越低，说明基因的抗逆性越强。

[0036] 实施例3：山新杨MYB6转录因子的稳定遗传转化及组织化学染色分析[0037] 1)将实施例2的重组过表达载体，用电击转化法将其转入农杆菌感受态细胞EHA105中，然后利用农杆菌介导法，将含有pROK II‑MYB6过表达载体的EHA105农杆菌稳定遗传转化到山新杨中，经过卡那霉素筛选，获得卡那霉素抗性苗(图3)，并提取抗性苗的DNA，利用载体引物pROK II‑F(5′‑TCGAGCTCGGTACCCGGGTCACAAGTTGTT‑3′)和pROK II‑R(5′‑GATGTGCTGCAAGGCGATT‑3′)进行PCR检测(图4)，载体引物扩增空载为447bp，基因条带为975bp，因此目的条带长度为1422bp，从图中可以看到位置正确，说明获得4个转基因山新杨株系然后对提取转基因株系的RNA，反转录成cDNA后，进行qRT‑PCR分析(图5)，获得MYB6在过表达山新杨转基因中的表达变化，结果显示，在4个过表达株系中，MYB6的表达量明显高与野生型株系，在过表达株系OE1中MYB6的表达量约为野生型的9倍，OE2株系中MYB6的表达量约为野生型的6倍，OE3株系中MYB6的表达量约为野生型的4倍，OE4株系中MYB6的表达量约为野生型的5倍。我们选择OE1和OE2两个株系用于组织化学染色分析。

[0038] 2)将生根培养基中生长2‑3周的山新杨过表达转基因OE1和OE2株系和野生型组培苗，分别用20％PEG溶液浸泡处理12h，以未胁迫处理的山新杨为对照，取植株叶片用于DAB、NBT和Evans Blue染色，具体步骤如下：

[0039] (1)DAB染色：分别取未胁迫处理和胁迫处理12h的各转基因和野生型山新杨叶片，置于100ml三角瓶中，加入DAB染色液，室温过夜染色。染色结束后，使用75％乙醇与5％甘油配制的脱色液，进行煮沸脱色。

[0040] (2)NBT染色：染色与脱色方法DAB。

[0041] (3)EB染色：分别取未胁迫处理和胁迫处理12h的各转基因和野生型山新杨叶片，置于100ml三角瓶中，加入EB染色液，真空干燥15‑30min，维持真空状态6h。染色结束后，使用75％乙醇与5％甘油配制的脱色液，进行煮沸脱色。

[0042] 染色结果如图6所示，DAB染色(图6A)可以反应细胞中过氧化物酶的活性和H2O2的含量，其氧化过程可以形成棕黄色沉淀。通过染色的深浅，可以判断细胞中过氧化物酶的含量，其含量越高，细胞受损伤越严重，染色越深，从图中可以看到，在对照组中，过表达与野生型植株的叶片颜色均为浅棕，二者并无明显差异，说明细胞受损伤程度大致相同。在PEG处理下，MYB6过表达株系OE1和OE2植株叶片的颜色为浅棕，野生型叶片颜色更深棕，表明两个过表达株系与野生型相比，过氧化物酶含量更低，因此说明，过表达转基因株系在干旱胁迫后受损伤程度比野生型山新杨低。

[0043] 细胞中H2O2释放出的超氧阴离子能够氧化NBT，形成蓝色沉淀，通过染色的深浅，可以判断细胞中H2O2的含量，其含量越高，细胞受损伤越严重。如图6B所示。在对照组中，过表达株系与野生型植株的叶片颜色差异较小，呈现浅蓝色，说明细胞受损伤程度大致相同。在干旱处理下，山新杨MYB6的过表达株系OE1和OE2植株叶片的颜色为浅蓝，野生型叶片颜色为蓝黑，表明两个过表达株系的H2O2含量更低植株在胁迫后受损伤程度比野生型山新杨低。

[0044] EB染色可以区分死细胞与活细胞，颜色越深，死细胞越多，植株受损伤程度越严重，如图6C所示。在对照组中，转基因株系和野生型植株的叶片颜色无明显差异，均较浅，说明细胞受损伤程度大致相同。在PEG处理下，山新杨MYB6的过表达株系OE1和OE2植株叶片的颜色为浅蓝，野生型叶片颜色为深蓝，表明两个过表达株系的死细胞数量更少，植株在胁迫后受损伤程度比野生型山新杨低。

[0045] 综合以上实验结果，说明山新杨MYB6基因具有较为显著的抗旱能力。

[0046] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

[0047] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。