一种pH及肠道菌群双响应补骨脂素脂质体及其制备方法

摘要

本发明属于药剂学技术领域，具体涉及一种pH及肠道菌群双响应结肠靶向补骨脂素脂质体及其制备方法，该脂质体采用薄膜水合法及超声分散制备得初级脂质体，后通过带有聚阴离子壳聚糖和聚阳离子果胶以静电逐层自组装的方式先后包裹含有补骨脂素的初级脂质体上，经双重修饰后的脂质体平均粒径在265nm左右，微观结构表明有明显的核壳结构，补骨脂素的包封率可达64.8％；该脂质体可抵抗胃酸及消化酶破坏和降解，提高补骨脂素的口服生物利用度，增强其结肠缓释作用，同时脂质体缓释的补骨脂素与肠道菌群产生相互作用从而提高抗溃疡性结肠炎效果。

权利要求

1.一种pH及肠道菌群双响应补骨脂素脂质体，其特征在于，所述脂质体是由壳聚糖和果胶在酸性条件下通过静电逐层自组装依次包裹于载有补骨脂素的初级脂质体上构成；

所述壳聚糖和果胶的质量比为1:1；

所述初级脂质体由质量比为30:6:1的大豆卵磷脂、胆固醇、补骨脂素组成；

所述初级脂质体是通过薄膜水合法及超声分散相结合的制备方法得到；

所述自组装过程的pH为5.5；

所述初级脂质体的制备步骤如下：

称取大豆卵磷脂、胆固醇、补骨脂素与有机溶剂以固液比为18.5 mg : 1 mL进行混合，搅拌混匀后在真空、水浴温度60℃、转速42 r/min的条件下避光旋蒸成膜，加入等体积pH为

7.4、0.05 M的磷酸盐缓冲盐水进行水化，获得乳白色液体置于冰浴中，利用细胞破碎仪在超声功率为130 W条件下，以1 s停止超声、1s超声循环程序超声处理8 min，获得初级脂质体，调节初级脂质体的pH为5.5，置于4℃冰箱保存备用；

所述pH及肠道菌群双响应补骨脂素脂质体的制备方法，包括以下步骤：S1、称取壳聚糖粉末溶解于含有1%乙酸的超纯水中，制备得到固含量为0.1 1%的壳聚~糖原液，经0.45 μm微孔滤膜过滤后调节pH为5.5，于4℃冰箱保存备用；

S2、称取果胶粉末溶解在超纯水中制备得到固含量为0.1 1%的果胶原液，经0.45 μm微~孔滤膜过滤后调节pH为5.5，于4℃冰箱保存备用；

S3、将壳聚糖、果胶原液用超纯水稀释10倍，分别获得壳聚糖溶液和果胶溶液；

S4、将初级脂质溶液体置于磁力搅拌器上，在室温状态下逐滴加入等体积的壳聚糖溶液，调节溶液的pH为5.5，搅拌下逐滴加入等体积脂质体‑壳聚糖溶液的果胶溶液，得到果胶‑壳聚糖修饰的载补骨脂素脂质体。

2.根据权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述初级脂质体的制备步骤中有机溶剂为体积比为9:1的无水乙醇和氯仿混合溶剂。

3.根据权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述步骤S1中的壳聚糖原液中壳聚糖固含量为0.6%。

4.根据权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述步骤S2中的果胶原液中果胶固含量为0.3%。

5.根据权利要求1 4任一项所述的pH及肠道菌群双响应补骨脂素脂质体在制备治疗溃~疡性结肠炎靶向制剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述溃疡性结肠炎靶向制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂或凝胶剂的口服剂型。

说明书

一种pH及肠道菌群双响应补骨脂素脂质体及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种pH及肠道菌群双响应补骨脂素脂质体及其制备方法，可用于治疗溃疡性结肠炎。技术背景

[0002] 炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一类慢性复发性肠道疾病，包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。其中，UC的发病部位主要累及远端结肠及直肠部位，其发病机制被认为是多种因素联合作用的结果，普遍认为可能与肠道菌群失调、氧化应激、遗传、环境等因素相关。其中，氧化应激在UC的发生发展中起着重要的作用：一方面，UC会不可避免地刺激机体产生过量自由基，另一方面，过多的自由基蓄积又可进一步加重炎症反应。因此，抑制氧化应激及减轻炎症是UC治疗的重要策略。

[0003] 口服给药因具有服用方便、快捷、患者依从性好等优点一直是人们最常用的给药途径。近年来，口服结肠靶向给药系统(Oral colon‑targeted drug delivery system,OCTDDS)的发展极大地弥补了传统口服制剂难以靶向结肠的缺陷。该项技术是依据结肠特殊的消化环境(如pH、肠道菌群、代谢酶等)，通过一定的制剂手段使得药物在上消化道不崩解释放、而在到达回盲部位后开始逐渐崩解和溶出，最终发挥局部或全身治疗作用的给药系统。但口服给药也存在着诸多缺陷，例如，对于蛋白质和肽类药物，其口服后易被胃肠道中的消化酶降解而失去疗效。此外，对于肠道类疾病如溃疡性结肠炎、结肠癌等，口服给药后药物通常未能到达疾病部位即被释放和吸收，一方面降低了药物疗效，另一方面增加了药物副作用。因此，如何克服口服药物难以靶向结肠的问题一直是人们关注的焦点。

[0004] 补骨脂素(Psoralen,P)主要来源于豆科植物补骨脂(Psoralea corylifolia Linn)的干燥成熟果实。中医认为，补骨脂性温，味辛，具补肾助阳、固精缩尿、温脾止泻、纳气平喘的功效，历代中医常用补骨脂素内服治疗肾虚和五更泄泻等。现代药理研究表明，补骨脂素具有免疫调节、抗骨质疏松、抗炎、抗氧化、抗菌、抗糖尿病、抗抑郁等多种活性。前期查阅文献发现，补骨脂素具有一定的抗炎作用，进一步发现肠道菌群产生的还原酶可通过还原作用参与补骨脂素的代谢，使补骨脂素转化生成一种具有更强抗氧化活性中间代谢产物的特点，可能作为用于抗溃疡性结肠炎的治疗药物。但补骨脂素水溶性差，直接口服生物利用度低。因此，开发一种有效递送补骨脂素的结肠靶向给口服制剂对补骨脂素的抗溃疡性结肠炎作用具有重大的意义。

[0005] 脂质体(Liposome)是一种具有与细胞膜结构类似的磷脂双分子层囊泡，可用于包埋亲水性、亲油性及两亲性药物成分，具有粒径小、药物包封率高、组织相容性好等优点。但常规脂质体通常稳定性差，静置后易出现聚集、分层等问题。且未经过任何修饰的常规脂质体直接口服通常难以抵挡胃酸恶劣的酸性条件，也易被消化道中的磷脂酶降解，存在药物过早释放或药物渗漏等问题。中国专利CN 104367549 A公开了一种包载补骨脂素‑阿霉素复合纳米结构脂质载体制剂及其制备方法，该专利采用固体脂质和液体脂质在乳化作用下对补骨脂素、阿霉素进行包裹，形成纳米结构的脂质载体，其主要通过提高补骨脂素‑阿霉素的包封率，提高药物在细胞内的聚集进而增加抗肿瘤疗效，但该脂质体采用乳化方法制备得到，且不涉及pH响应、结肠靶向以及肠炎的治疗作用和效果；中国专利CN 107320458 B公开了一种包封率高的补骨脂素聚合物纳米粒制剂及其制备方法，其采用补骨脂素与聚丙交酯‑乙交酯、有机溶剂形成有机相，将大豆磷脂、吐温‑80和乙醇形成水相，两相混合形成纳米乳液，该纳米乳液虽具有一定的缓释效果，但其难以抵抗胃酸和消化酶的作用，口服生物利用率也不高，难以达到较好的靶向定位给药效果；中国专利CN 113398073 A公开了一种用于治疗溃疡性结肠炎的丹参素钠自组装脂质体及其制备方法，其采用丹参素钠、磷脂、胆固醇、壳聚糖和海藻酸钠为原料，经逆相蒸发法及LbL自组装技术制备了丹参素钠自组装脂质体，其制备的口服丹参素钠自组装脂质体虽具有一定的治疗溃疡性结肠炎及改善溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群失衡的作用，但其选用的自组装材料壳聚糖及海藻酸钠形成的絮状沉淀使得脂质体分离困难，且其制备所得的脂质体药物包封率仅为30％～45.25％，结肠缓释效果不明显。

[0006] 壳聚糖(Chitosan,CH)和果胶(Pectin,PT)作为天然来源的生物多糖，具有着良好的生物安全性和可降解性，可作为缓释载体在活性物质的胃肠道转运研究中发挥着重要的作用。单独使用壳聚糖对脂质体进行修饰保护效果有限，加入另一带相反电荷的果胶对脂质体进行双层修饰可能更好地保护脂质体在胃中结构不被破坏。在胃及小肠的酸性条件下，壳聚糖与果胶以静电作用结合，以此保护脂质体结构完整；而在到达微碱性的结肠时，壳聚糖及果胶间的静电作用减弱，药物在结肠处逐步降解。此外，基于肠道菌群主要在结肠富集的特点，具有多糖本质的壳聚糖及果胶可在结肠肠道菌群产生的糖苷酶作用下发生降解，进一步促成药物的释放。因此，选择壳聚糖及果胶对脂质体进行双层修饰，可获得具有pH及肠道菌群双响应的口服结肠靶向制剂。

[0007] 前期查阅国内外的相关文献和专利，尚未发现有将补骨脂素和自组装脂质体技术结合，采用壳聚糖和果胶修饰制备的pH及肠道菌群双响应补骨脂素脂质体用于溃疡性结肠炎治疗的相关研究报道，且补骨脂素与肠道菌群间的相互作用亦未见报道。综上所述，开发一种有效递送补骨脂素的结肠靶向给药制剂对研究补骨脂素的抗溃疡性结肠炎作用具有较大的意义。

发明内容

[0008] 针对上述现有技术中存在的问题，为了解决补骨脂素直接口服生物利用度低的缺陷，本发明提供了一种pH及肠道菌群双响应补骨脂素脂质体，采用薄膜水合法及超声分散相结合的方法制备得到壳聚糖‑果胶多层修饰的补骨脂素脂质体，所述脂质体平均粒径在265nm左右，透射电子显微镜下观察到明显的核壳结构，体内、体外实验证明材料具有结肠靶向及抗溃疡性结肠炎作用。

[0009] 本发明具体的技术方案如下：

[0010] 所述pH及肠道菌群双响应补骨脂素脂质体是由壳聚糖和果胶在酸性条件下通过静电逐层自组装，由壳聚糖和果胶依次包裹于载有补骨脂素的初级脂质体上构成；

[0011] 所述壳聚糖和果胶的质量比为1:1；

[0012] 所述初级脂质体由质量比为30:6:1的大豆卵磷脂、胆固醇、补骨脂素组成；

[0013] 所述自组装过程的pH为5.5；

[0014] 所述初级脂质体是通过薄膜水合法及超声分散相结合的制备方法得到，具体制备步骤如下：

[0015] 称取大豆卵磷脂、胆固醇、补骨脂素与机溶剂以固液比为18.5mg:1mL进行混合，搅拌混匀，然后在真空、水浴温度60℃、转速42r/min的条件下避光旋蒸成膜，加入等体积pH为7.4、0.05M的磷酸盐缓冲盐水进行水化，获得乳白色液体置于冰浴中，利用细胞破碎仪(Sonics VCX130W,Sonics,USA)在超声功率为130W条件下，以1s停止超声、1s超声循环程序超声处理8min，获得初级脂质体，调节初级脂质体的pH为5.5，置于4℃冰箱保存备用；

[0016] 进一步地，所述有机溶剂为体积比为9:1的无水乙醇和氯仿混合溶剂；

[0017] 本发明的一种pH及肠道菌群双响应补骨脂素脂质体的制备步骤如下：

[0018] S1、称取壳聚糖粉末溶解于含有1％乙酸的超纯水中，制备得到固含量为0.1～1％的壳聚糖原液，经0.45μm微孔滤膜过滤后调节pH为5.5，于4℃冰箱保存备用；

[0019] S2、称取果胶粉末溶解在超纯水中制备得到固含量为0.1～1％的果胶原液，经0.45μm微孔滤膜过滤后调节pH为5.5，于4℃冰箱保存备用；

[0020] S3、将壳聚糖、果胶原液用超纯水稀释10倍，分别获得壳聚糖溶液和果胶溶液；

[0021] S4、将初级脂质溶液体置于磁力搅拌器上，在室温状态下逐滴加入等体积的壳聚糖溶液，获得CH‑P‑NLP，调节溶液的pH为5.5，搅拌下逐滴加入等体积脂质体‑壳聚糖溶液的果胶溶液，得到果胶‑壳聚糖修饰的载补骨脂素脂质体PT/CH‑P‑NLP。

[0022] 优选地，所述壳聚糖原液中壳聚糖固含量为0.6％；

[0023] 优选地，所述果胶原液中果胶固含量为0.3％；

[0024] 本发明的pH及肠道菌群双响应补骨脂素脂质体可用于制备治疗溃疡性结肠炎靶向制剂；

[0025] 本发明的pH及肠道菌群双响应补骨脂素脂质体作为结肠靶向制剂可为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂或凝胶剂的口服剂型，但不仅限于所述剂型。

[0026] 本发明采用在酸性条件下，通过壳聚糖、果胶对补骨脂素进行多层修饰，在修饰前，为控制共轭纳米粒子的粒径，将壳聚糖和果胶原液稀释10倍；在酸性条件下，首先将带正电荷的壳聚糖稀释液(CH)滴加入带负电的初级脂质体上，获得CH‑P‑NLP，然后将带负电荷的果胶稀释液(PT)滴加入带正电荷的壳聚糖修饰的初级脂质体(CH‑P‑NLP)上，获得果胶‑壳聚糖修饰的补骨脂素脂质体PT/CH‑P‑NLP，整个修饰过程中保持酸性条件。

[0027] 本发明采用壳聚糖、果胶对补骨脂素进行双层修饰得到具有与细胞膜结构类似的磷脂双分子层囊泡的脂质体，粒径小约为265nm、药物包封率高、组织相容性好，利用两种带有相反电荷的聚合物大分子间强的静电相互作用，使得带不同电荷的聚电解质能够通过逐层吸附的方式组装在另一带电基质的表面上，从而在带电基质表面形成一种聚合物膜。本发明对补骨脂素脂质体表面进行修饰，显著提高了补骨脂素包封率及脂质体在酸性条件下的稳定性，制备的脂质体直接口服后壳聚糖及果胶聚电解质层可以保护脂质体不被胃酸及消化酶破坏和降解，不产生药物过早释放或药物渗漏增强其缓释效果，采用的果胶与壳聚糖修饰也不会造成脂质体分离困难，导致血药浓度下降等情况，进而脂质体缓释的补骨脂素与肠道菌群间的相互作用产生抗溃疡性结肠炎，可提高药物的生物利用度。

[0028] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：

[0029] (1)本发明所得的壳聚糖‑果胶修饰的补骨脂素脂质体(PT/CH‑P‑NLP)为pH及肠道菌群双响应制剂，具有结肠靶向作用。

[0030] (2)本发明制备的PT/CH‑P‑NLP制剂具有改善硫酸葡聚糖钠盐(Dextran sulphate sodium,DSS)诱导的C57BL/6溃疡性结肠炎小鼠症状的作用。

[0031] (3)本发明制备的PT/CH‑P‑NLP制剂对补骨脂素脂质体包封率可达64.8％，显著提高了补骨脂素口服过程中的生物利用度以及药物缓释作用。

附图说明

[0032] 图1为补骨脂素(P)、壳聚糖(CH)、果胶(PT)、初级脂质体(P‑NLP)、脂质体(PT/CH‑P‑NLP)的傅里叶红外光谱图。

[0033] 图2为P‑NLP(a)、PT/CH‑P‑NLP(b)的透射电镜图。

[0034] 图3为PT/CH‑P‑NLP在模拟胃液(HCl，pH1.2)、模拟小肠液(PBS，pH6.8)及模拟结肠液(pH7.4，gut flora)条件下孵育2h前后透射电镜图。

[0035] 图4为实验进程图，以及补骨脂素(P)、初级脂质体(P‑NLP)、脂质体(PT/CH‑P‑NLP)、SASP对小鼠体重和DAI评分影响。

[0036] 图5为补骨脂素(P)、初级脂质体(P‑NLP)、PT/CH‑P‑NLP、SASP对小鼠结肠长度的影响。

[0037] 图6为补骨脂素(P)、初级脂质体(P‑NLP)、PT/CH‑P‑NLP、SASP对小鼠结肠组织中炎症因子表达的影响。

具体实施方式

[0038] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

[0039] 本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

[0040] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

[0041] 实施例1初级脂质体P‑NLP的制备

[0042] 称取150mg大豆卵磷脂和30mg胆固醇，与5mg补骨脂素溶解于9mL无水乙醇及1mL氯仿制备的混合有机溶剂中，将其置于磁力搅拌器上，避光搅拌混合均匀，随后，将混合溶液转移至圆底烧瓶中，置于旋转蒸发仪中，真空下蒸发成薄膜(水浴60℃，转速45转/min)，然后用10mL磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH7.4,0.05M)通过涡旋混合的方式水化，获得乳白色溶液。为了获得初级脂质体，使用细胞破碎仪在超声功率130W下超声处理初级脂质体8min(1s停止超声，1s超声循环)，在超声处理步骤中，样品保存在冰浴中以保护脂质体结构不被热破坏，随后将制备所得的初级脂质体P‑NLP调节至pH5.5，4℃储存。

[0043] 实施例2壳聚糖、果胶功能化脂质体PT/CH‑P‑NLP的制备

[0044] S1、称取0.3g壳聚糖粉末溶解于50mL含有1％乙酸的超纯水中，制备得到壳聚糖原液，经0.45μm微孔滤膜过滤后调节pH为5.5，于4℃冰箱保存备用；

[0045] S2、称取0.15g果胶粉末溶解在50mL超纯水中制备得到果胶原液，经0.45μm微孔滤膜过滤后调节pH为5.5，于4℃冰箱保存备用；

[0046] S3、将壳聚糖、果胶原液用超纯水稀释10倍，分别获得壳聚糖溶液和果胶溶液；

[0047] S4、将实施例1制备的初级脂质溶液体置于磁力搅拌器上，在室温状态下逐滴加入等体积的壳聚糖溶液，获得CH‑P‑NLP，调节溶液的pH为5.5，搅拌下逐滴加入等体积脂质体‑壳聚糖溶液的果胶溶液，得到40mL果胶‑壳聚糖修饰的载补骨脂素脂质体PT/CH‑P‑NLP。

[0048] 试验例1脂质体包封率的测定

[0049] 脂质体包封率采用紫外分光光度法(UV)测定，溶剂为95％乙醇，检测波长为246nm,结果显示补骨脂素浓度在3.75～12.25μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，线性回归方程为Y＝0.1319X+0.0006，r＝0.9993。取实施例2制备所得的PT/CH‑P‑NLP溶液，4℃下10000g离心40min，收集上清液，上清液中则为游离的P。取1mL上清液置于95℃水浴上挥干水分，加入10mL 95％乙醇超声充分溶解，246nm处测得吸光度值，代入标准曲线计算，结果为游离的补骨脂素含量，则补骨脂素包封率＝(总药物量‑游离药物量)/总药物量，最终计算得补骨脂素包封率为64.8％。

[0050] 试验例2粒径、PDI及Zeta电势测定

[0051] 取一定量P‑NLP、CH‑P‑NLP及PT/CH‑P‑NLP溶液用去离子水稀释10倍，在室温下使用纳米粒度及Zeta电位分析仪(90Plus PALS,Brookhaven,USA)测定溶液中相应纳米粒子的粒径、多分散指数(PDI)及Zeta电势，仪器每次进行三次读数，每个样品重复测定三次，数据以means±SEM表示。

[0052] 各材料粒径、PDI及Zeta测试结果如表1所示，三种溶液PDI均在0.1～0.3之间，表明溶液纳米粒子粒径分散相对集中，其中，P‑NLP粒子平均粒径在140nm左右，由于磷脂中3‑
PO4 离子存在的缘故，P‑NLP溶液电势为‑24mV左右；壳聚糖修饰后，CH‑P‑NLP粒径略有增+
加，平均粒径在197nm左右，因壳聚糖中NH3离子的存在，使得CH‑P‑NLP溶液电势由负转为正；果胶修饰后的双层脂质体PT/CH‑P‑NLP粒径进一步增大，平均粒径265nm左右，电势由正‑
转负，是果胶中‑COO，表明果胶与CH‑P‑NLP脂质体结合成功。

[0053] 表1：脂质体平均粒径、多分散指数及Zeta电位

[0054]

[0055] Values areexpressed as means±AEM

[0056] 试验例3 FTIR傅里叶红外光谱

[0057] 为验证壳聚糖及果胶与P‑NLP成功结合，根据溴化钾(KBr)圆盘法使用FTIR光谱仪(Nicolet IS10,Thermo,USA)对补骨脂素(P)、壳聚糖(CH)、果胶(PT)、初级脂质体(P‑NLP)及PT/CH‑P‑NLP进行FTIR分析，具体操作方法为：将P‑NLP及PT/CH‑P‑NLP样品溶液冷冻干燥后与KBr以1:100的比例混合然后磨成细粉(P、CH及PT为粉末状态，可直接与KBr研磨)，FITR‑1 ‑1扫描范围从4000cm 到650cm ，使用Oringin分析软件进一步分析获得的数据。

[0058] FITR结果如图1所示，P在3430cm‑1处的峰为P中苯环及羰基的大共轭峰，1710cm‑1‑1 ‑1则为P羰基(C＝O)特征吸收峰。样品CH及PT在3500cm ～2800cm 间强而宽的峰为多糖特征‑1 ‑1 ‑1
吸收峰，其中3450cm 为CH及PT的羟基(H‑O)伸缩震动吸收峰；CH在2910cm 及PT在2940cm‑1 +
处的峰为CH及PT苯环上碳氢伸缩震动峰；CH在1638cm 处的吸收峰为壳聚糖氨基(‑NH3)特‑1 ‑1 ‑1
征峰，而1748cm 为果胶羧基特征峰；1086cm 为CH碳氧(‑C‑O‑C)伸缩震动峰，1450cm 为PT碳氢(‑C‑H2‑)伸缩震动峰。

[0059] 在P‑NLP中，P的羰基特征峰减弱，表明补骨脂素被成功包裹进脂质体中。在样品‑1 ‑1PT/CH‑P‑NLP中,大豆卵磷脂P‑O‑C特征峰吸收波数从1070cm 移动到1090cm ，猜测是CH与‑1 +
磷脂基团结合所致；同时，大豆卵磷脂970cm 处的季氨基[‑N(CH3)3]峰减弱，猜测是磷脂被壳聚糖包裹所致。样品PT/CH‑P‑NLP中，CH氨基特征峰与PT羧基特征峰的消失，表明CH与PT结合成功。因此，上述材料特征峰的改变证实了P、CH和P‑NLP之间发生了强烈的静电相互作用，从而形成了PT/CH‑P‑NLP。

[0060] 试验例4TEM透射电子显微镜

[0061] 使用TEM观察实施例1制得的P‑NLP及实施例2中制得的PT/CH‑P‑NLP，具体操作步骤如下：

[0062] 将镀碳支持膜铜网放置于封口膜上，滴加一滴样品(约30μm)于镀碳铜网膜上，停留10min，用滤纸从边缘部分吸去多余溶液，待样品吸附到镀碳铜网膜上时，将膜置于封口膜上，滴一滴醋酸双氧铀染液染色90s，用滤纸吸去多余的染液，置于滤纸上并干燥3h后置于透射电镜下观察。

[0063] TEM结果如附图2显示，初级脂质体P‑NLP(图2中的a)表面光滑，可看出明显的双层膜结构，壳聚糖及果胶修饰后，PT/CH‑P‑NLP(图2中的b)表现出了明显的核‑壳结构，且脂质体双层膜明显增厚，证实了壳聚糖及果胶在P‑NLP上的成功包覆。

[0064] 试验例5体外模拟胃肠道条件下PT/CH‑P‑NLP崩解情况

[0065] 首先制备肠道菌群液：收集约1.5g健康成人(来自年龄20～30岁的健康成人志愿者，无烟酒史，近三个月未服用过任何抗生素类或其他药物)粪便，加入50mL高压灭菌后的PBS溶液，在旋涡混合仪上剧烈震荡2～3min后，用四层纱布过滤，将滤液转移至无菌离心管中，4℃下1500rpm离心5min，收集上清液转移至新离心管中，4℃下12000rpm离心10min，沉淀用20mL PBS吹打混匀制得肠道菌群液备用。

[0066] 取1mL实施例2中制备得的PT/CH‑P‑NLP溶液分别与9mL模拟胃液(HCl，pH1.2)、模拟小肠液(PBS,pH6.8)及模拟结肠液(pH7.4，含10mL肠道菌群gut flora)置于37℃培养箱中共孵育2h，以孵育前的PT/CH‑P‑NLP作为空白对照，使用透射电子显微镜观察不同条件下PT/CH‑P‑NLP孵育后的状态。

[0067] TEM结果由附图3显示，PT/CH‑P‑NLP孵育前形态完整，脂质双层不发生崩解(如图3中的a1、a2)，在模拟胃及小肠环境中孵育2h后，PT/CH‑P‑NLP脂质体仍保持结构完整性(如图3中的b1、b2、c1、c2)；这是因为在胃及小肠的酸性环境下，壳聚糖及果胶间的静电相互作用有效保护了脂质体不被破坏的结果；然而，在pH7.4的含肠道菌群的体外模拟结肠液中，PT/CH‑P‑NLP脂质体结构发生了明显的崩解(如图3中的d1、d2)，证实了PT/CH‑P‑NLP的pH及肠道菌群敏感性。

[0068] 实施例8 PT/CH‑P‑NLP对溃疡性结肠炎的影响

[0069] 将60只7‑8周龄的C57BL/6小鼠随机分成6组：Normal组(n＝10，灭菌水+0.5％CMC‑Na)、Control组(n＝10，2.5％DSS+0.5％CMC‑Na)、P组(n＝10，2.5％DSS+10mg/kg P)、P‑LNP组(n＝10，2.5％DSS+10mg/kg P‑LNP)、PT/CH‑P‑LNP组(n＝10，2.5％DSS+10mg/kg PT/CH‑P‑LNP)、阳性药物组SASP(柳氮磺胺吡啶)(n＝10，2.5％DSS+300mg/kg SASP)，实验采用2.5％DSS(100mL灭菌水溶解2.5g的硫酸葡聚糖钠盐粉末)溶液进行溃疡性结肠液造模，现配现用，共造模7天，造模期间Normal组小鼠全程自由饮用灭菌水，造模第2天的同时开始灌胃给药治疗，治疗组给药剂量为300μl，同时Normal组及Control组灌胃同等剂量的0.5％CMC‑Na溶液，共给药治疗10天，实验期间每天记录小鼠体重、粪便性状及精神状态，给药第
10天后取材，记录各组结肠长度，动物实验进程如图4～5所示，具体分组及给药方案见表2，小鼠疾病活动指数DAI评分标准依照表3所述标准进行评估；

[0070] 表2：动物实验分组及给药方案

[0071]

[0072] 表3：DAI评分标准

[0073]

[0074] 注：表中阴性是指采用便血试纸测定后试纸3min内不显蓝色；弱阳性(+)为1～3min内显蓝色；弱阳性(++)指30～60s内显蓝色；阳性(+++)指立即显蓝色；强阳性指立即显示深蓝色。

[0075] 实验结果显示，2.5％DSS造模给药的7天里，小鼠体重下降明显，DAI评分在第7天是达到最高，说明造模成功(如图4)。治疗组P、P‑NLP、PT/CH‑P‑NLP及阳性药物组SASP都能一定程度上改善UC小鼠的体重下降和DAI评分增加。同时，小鼠结肠长度表明(如图5)，各治疗组均能在一定程度上改善DSS诱导的小鼠结肠长度缩短的情况，且PT/CH‑P‑NLP组效果最明显，而P组与模型组相比没有显著性差异。

[0076] 实施例9 PT/CH‑P‑NLP对溃疡性结肠炎小鼠结肠炎症因子影响情况[0077] 采用ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，中国)评估了补骨脂素(P)、初级脂质体(P‑NLP)、PT/CH‑P‑NLP、阳性药物柳氮磺胺吡啶(SASP)对溃疡性结肠炎小鼠结肠中炎症因子的表达情况，结肠组织样本来源为实施例8，评价方法的具体操作步骤如下：

[0078] S1：首先制备10％的结肠组织匀浆液，准确称取一定重量的结肠组织，按重量体积比为1:9加入高温灭菌的生理盐后用匀浆器将其匀浆充分，4℃、3800g离心20min后收集上清，分装后置于‑80℃冰箱备用；

[0079] S2：分别设置标准孔0pg/mL、15.6pg/mL、31.2pg/mL、62.5pg/mL、125pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL及待测样品孔，每孔分别加入标准品/样本100μL，加样时应将样品加于酶标板孔底部，加样后轻轻晃动均匀并覆盖上板贴，37℃温育2h；

[0080] S3：每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆盖上新的板贴后37℃温育1h；

[0081] S4：小心揭去铁板，弃去液体，每孔加入200μL洗涤工作液，静置3min后弃去，轻轻拍干，重复3次；

[0082] S5：每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，随后覆盖上新的板贴，37℃温育1h；

[0083] S6：小心揭去铁板，弃去液体，每孔加入200μL洗涤工作液，静置3min后弃去，轻轻拍干，重复5次；

[0084] S7：每孔加入底物溶液90μL，37℃避光显色15‑30min；

[0085] S8：每孔依次加入终止液50μL，并在终止后5min内用酶标仪在450nm波长测定各孔吸光度(OD值)最后，根据标准曲线计算出相应待测样品的浓度。

[0086] ELISA结果如图6所示，P、P‑NLP、PT/CH‑P‑NLP、SASP可显著降低DSS诱导的UC小鼠促炎因子TNF‑α、IFN‑γ、IL‑1β及IL‑6的表达，同时升高抑炎因子IL‑10的表达。

[0087] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。