一种负载干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵及其制备方法

摘要

本发明公开了一种负载干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵及其制备方法，其中，制备方法包括以下步骤：制备鱼胶原蛋白创面修复海绵‑使鱼胶原蛋白创面修复海绵吸取细胞完全培养基‑配制干细胞悬浮液‑将干细胞注入鱼胶原蛋白创面修复海绵中并持续为鱼胶原蛋白创面修复海绵提供细胞完全培养基‑将干细胞和鱼胶原蛋白创面修复海绵共培养‑轻度的脱水处理。本发明通过将干细胞负载到鱼胶原蛋白创面修复海绵中，使得干细胞遍布整个鱼胶原蛋白创面修复海绵的内部，并在其中生长、爬行和分裂，最终使得整个鱼胶原蛋白创面修复海绵的内部充满干细胞，便于后期修复材料植入后干细胞在创面处被诱导分化、靶向发挥作用。

权利要求

1.一种负载干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：制备鱼胶原蛋白创面修复海绵，具体的，(1)取鱼胶原蛋白水溶液，将鱼胶原蛋白的浓度浓缩至0.4g/mL；(2)将浓缩后的鱼胶原蛋白水溶液倒入冷冻干燥机的冻干盘中，在冻干盘中放入制作好的方格状模具；(3)将冻干盘放入冷冻干燥机中，先‑70℃预冻8h，然后按照程序‑70℃冻干48h，之后逐级升温至室温，取出冻干盘；(4)将制备得到的鱼胶原蛋白创面修复海绵从方格中取出，包装，灭菌；

步骤2：使鱼胶原蛋白创面修复海绵吸取细胞完全培养基；

步骤3：配制干细胞悬浮液；

步骤4：将干细胞注入鱼胶原蛋白创面修复海绵中，并持续为鱼胶原蛋白创面修复海绵

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提供细胞完全培养基，具体的，将配制好的干细胞悬浮液用无菌注射器按1*10 个/cm的密度均匀的注射入已经充分吸取细胞完全培养基的鱼胶原蛋白创面修复海绵中，向盛装鱼胶原蛋白创面修复海绵的培养瓶中缓慢加入细胞完全培养基，使细胞完全培养基的液面达到鱼胶原蛋白创面修复海绵的高度的1/4～1/3的位置；

步骤5：将干细胞和鱼胶原蛋白创面修复海绵共培养；

步骤6：将培养好的修复材料在37℃进行轻度的鼓风干燥脱水处理，当修复材料的重量减至脱水前重量的1/2～2/3时，将修复材料取出。

2.根据权利要求1所述的负载干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵的制备方法，其特征在于，在步骤2中，待鱼胶原蛋白创面修复海绵的重量达到其初始重量的15～21倍时，将鱼胶原蛋白创面修复海绵转入新的培养瓶中。

3.根据权利要求1所述的负载干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵的制备方法，其特征在于，在步骤5中，共培养的方法具体如下：将注入了干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵置于二氧化碳培养箱中，37℃共培养2天，然后更换培养瓶中的细胞完全培养基，再37℃继续

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培养1～3天，待鱼胶原蛋白创面修复海绵内部的干细胞浓度达到1*10个/cm 时，共培养结束。

4.一种负载干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵，其特征在于，由权利要求1至3任意一项所述的方法制备得到。

说明书

一种负载干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种胶原蛋白创面修复海绵及其制备方法，具体涉及一种负载干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵及其制备方法，属于创面修复材料技术领域。

背景技术

[0002] 近年来，随着社会的进步以及生活节奏的加快，因为过度劳累、饮食不规律等导致的糖尿病，其患病人数逐年增加，且患病年龄趋向于低龄化，由糖尿病导致的糖尿病足、慢性愈合创面等并发症的发病率也呈逐年上升趋势，糖尿病足、慢性愈合创面等并发症的治疗是目前临床上亟待解决的问题。另外，由各种物理、化学原因造成的烧伤、创伤等大面积皮肤损伤，其修复也是目前临床上亟待解决的问题。

[0003] 目前，临床上针对糖尿病足、慢性愈合创面等的治疗，主要采用各种各样的敷料辅助治疗，这种治疗方式治疗周期长，治疗费用相对偏高，同时，患者也有诸多不便，给病患本人和家庭都带来不小的经济负担和其他负担，如何能用一种简单的、易操作的方式加快慢性愈合创面的愈合，一直以来都是广大医护工作者和科研工作者努力的方向。针对大面积皮肤损伤，自体皮肤移植仍是临床治疗的金标准，但自体移植后皮肤的存活率、对机体的二次损伤等问题大大限制了此方法的应用，如何能寻找到一种可有效存活并能诱导创面修复的替代材料，是目前广大医护工作者和科研工作者研究和努力的方向。

[0004] 现阶段，临床上使用的创面修复材料主要有海绵、敷料、凝胶、喷雾、因子等几种，这些创面修复材料在很多类型的创面修复中都发挥了巨大的作用，但是在糖尿病足和慢性愈合创面辅助治疗以及大面积皮肤损伤修复中的表现却一般。皮肤损伤修复最关键的是恢复血供，在这个过程中血管长入、细胞分化等发挥了重要的作用，如果能局部为创面提供稳定的干细胞，向着促进皮肤生长的细胞方向分化，有利于促进创面的快速愈合。但如果只是将干细胞注射到创面位置，干细胞很快会随着组织液进入循环系统，无法进行定位，因此，如何将干细胞靶向固定在创面位置具有重要的临床价值和临床意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于：提供一种能够将异体干细胞或自体干细胞靶向固定在创面位置从而促进创面快速愈合的胶原蛋白创面修复海绵及其制备方法。

[0006] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

[0007] 一种负载干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0008] 步骤1：制备鱼胶原蛋白创面修复海绵；

[0009] 步骤2：使鱼胶原蛋白创面修复海绵吸取细胞完全培养基；

[0010] 步骤3：配制干细胞悬浮液；

[0011] 步骤4：将干细胞注入鱼胶原蛋白创面修复海绵中，并持续为鱼胶原蛋白创面修复海绵提供细胞完全培养基；

[0012] 步骤5：将干细胞和鱼胶原蛋白创面修复海绵共培养；

[0013] 步骤6：轻度的脱水处理。

[0014] 优选的，在步骤1中，制备鱼胶原蛋白创面修复海绵的方法具体如下：

[0015] (1)取鱼胶原蛋白水溶液，将鱼胶原蛋白的浓度浓缩至0.4g/mL；

[0016] (2)将浓缩后的鱼胶原蛋白水溶液倒入冷冻干燥机的冻干盘中，在冻干盘中放入制作好的方格状模具；

[0017] (3)将冻干盘放入冷冻干燥机中，先‑70℃预冻8h，然后按照程序‑70℃冻干48h，之后逐级升温至室温，取出冻干盘；

[0018] (4)将制备得到的鱼胶原蛋白创面修复海绵从方格中取出，包装，灭菌。

[0019] 优选的，在步骤2中，待鱼胶原蛋白创面修复海绵的重量达到其初始重量的15～21倍时，将鱼胶原蛋白创面修复海绵转入新的培养瓶中。

[0020] 优选的，在步骤4中，将干细胞注入鱼胶原蛋白创面修复海绵中的方法具体如下：5 3
将配制好的干细胞悬浮液用无菌注射器按1*10个/cm的密度均匀的注射入已经充分吸取细胞完全培养基的鱼胶原蛋白创面修复海绵中。

[0021] 优选的，在步骤4中，持续为鱼胶原蛋白创面修复海绵提供细胞完全培养基的方法具体如下：向盛装鱼胶原蛋白创面修复海绵的培养瓶中缓慢加入细胞完全培养基，使细胞完全培养基的液面达到鱼胶原蛋白创面修复海绵的高度的1/4～1/3的位置。

[0022] 优选的，在步骤5中，共培养的方法具体如下：将注入了干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵置于二氧化碳培养箱中，37℃共培养2天，然后更换培养瓶中的细胞完全培养基，6 3
再37℃继续培养1～3天，待鱼胶原蛋白创面修复海绵内部的干细胞浓度达到1*10个/cm时，共培养结束。

[0023] 优选的，在步骤6中，脱水处理的方法具体如下：将培养好的修复材料在37℃进行轻度的脱水处理，当修复材料的重量减至脱水前重量的1/2～2/3时，将修复材料取出。

[0024] 一种负载干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵，其特征在于，由前述的方法制备得到。

[0025] 本发明的有益之处在于：

[0026] 1、本发明所使用的鱼胶原蛋白创面修复海绵其肽链上具有大量的羟基和羧基，使得该鱼胶原蛋白创面修复海绵具有良好的亲水性和黏附细胞的能力，进而便于干细胞在其中生长、爬行和分裂。

[0027] 2、本发明通过注射的方式将干细胞注入鱼胶原蛋白创面修复海绵中，使得干细胞遍布整个鱼胶原蛋白创面修复海绵的内部，并在其中生长、爬行和分裂，最终使得整个鱼胶原蛋白创面修复海绵的内部充满干细胞，便于后期修复材料植入后干细胞在创面处被诱导分化。

[0028] 3、本发明通过对培养好的修复材料进行轻度的脱水处理，有效的缩小了鱼胶原蛋白创面修复海绵的孔径，使得干细胞能够更好的被固定在鱼胶原蛋白创面修复海绵的内部，便于后期修复材料植入后干细胞在创面位置靶向发挥作用。

附图说明

[0029] 图1是本发明制备得到的鱼胶原蛋白创面修复海绵的红外吸收光谱图；

[0030] 图2是脱水后的修复材料的扫描电镜图；

[0031] 图3是脱水前的修复材料的活死细胞染色结果图；

[0032] 图4是背部创面位置植入负载有干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵7天后大鼠背部的荧光图；

[0033] 图5是背部创面位置直接注射干细胞7天后大鼠背部的荧光图；

[0034] 图6是由糖尿病诱发的慢性创面(直径1.5cm)位置植入负载有干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵21天后大鼠的创面愈合情况图；

[0035] 图7是对大鼠的由糖尿病诱发的慢性创面(直径1.5cm)不做任何处理21天后大鼠的创面愈合情况图。

具体实施方式

[0036] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

[0037] 第一部分、制备鱼胶原蛋白创面修复海绵

[0038] 本发明所使用的鱼胶原蛋白创面修复海绵，其制备过程具体如下：

[0039] (1)取鱼胶原蛋白水溶液，使用膜过滤系统将鱼胶原蛋白的浓度浓缩至0.4g/mL；

[0040] (2)将浓缩后的鱼胶原蛋白水溶液倒入冷冻干燥机的冻干盘中，液体深度1cm(可根据实际需要在0.1～2cm这个范围内调整)，然后在冻干盘中放入制作好的方格状模具，每个方格边长1cm(可根据实际需要在0.5～30cm这个范围内调整)；

[0041] (3)将冻干盘放入冷冻干燥机中，先‑70℃预冻8h，然后按照程序‑70℃冻干48h，之后逐级升温至室温，取出冻干盘；

[0042] (4)将制备得到的鱼胶原蛋白创面修复海绵从方格中取出，包装，灭菌。

[0043] 对制备得到的鱼胶原蛋白创面修复海绵的结构进行鉴定，鉴定的内容和过程具体如下：

[0044] 天然I型胶原蛋白具有特异的红外吸收带，反映N‑H和O‑H中氢键伸缩振动吸收的‑1酰胺A带吸收峰在3400～3440cm 波长范围内。将制备得到的鱼胶原蛋白创面修复海绵制成粉末，使用傅里叶红外光谱仪对粉末进行红外扫描，观察判断粉末的吸收带情况。

[0045] 经检测，该鱼胶原蛋白创面修复海绵的红外吸收光谱如图1所示。

[0046] 从图1所示的红外吸收光谱图中可以发现，本发明制备得到的鱼胶原蛋白创面修‑1复海绵在3398cm 位置有强烈的吸收峰，说明该鱼胶原蛋白创面修复海绵含有大量的N‑H键和O‑H键，间接证明该鱼胶原蛋白创面修复海绵的肽链上有大量的羟基和羧基。

[0047] 由于制备得到的鱼胶原蛋白创面修复海绵其肽链上具有大量的羟基和羧基，所以使得鱼胶原蛋白创面修复海绵具有良好的亲水性和黏附细胞的能力，当该鱼胶原蛋白创面修复海绵上负载干细胞后，更便于干细胞在创面处的长入、爬行和分裂。

[0048] 第二部分、在鱼胶原蛋白创面修复海绵上负载干细胞

[0049] 在鱼胶原蛋白创面修复海绵上负载干细胞的过程具体如下：

[0050] 1、鱼胶原蛋白创面修复海绵吸取细胞完全培养基

[0051] 在无菌环境下，将鱼胶原蛋白创面修复海绵置于盛有细胞完全培养基的培养瓶A中，使鱼胶原蛋白创面修复海绵充分吸取细胞完全培养基，待鱼胶原蛋白创面修复海绵的重量达到其初始重量的15～21倍时，将鱼胶原蛋白创面修复海绵转入培养瓶B中，备用。

[0052] 2、配制干细胞悬浮液

[0053] 将异体干细胞(或自体干细胞)在培养瓶C中培养至铺满瓶底80％以上，然后使用胰蛋白酶将异体干细胞(或自体干细胞)消化后离心，取细胞沉淀，最后使用细胞完全培养基配制成干细胞悬浮液，备用。

[0054] 3、将干细胞注入鱼胶原蛋白创面修复海绵中

[0055] 将配制好的干细胞悬浮液用无菌注射器按1*105个/cm3的密度均匀的注射入已经充分吸取细胞完全培养基的鱼胶原蛋白创面修复海绵中，然后向盛装鱼胶原蛋白创面修复海绵的培养瓶B中缓慢加入细胞完全培养基，使细胞完全培养基的液面达到鱼胶原蛋白创面修复海绵的高度的1/4～1/3的位置。

[0056] 持续为鱼胶原蛋白创面修复海绵提供细胞完全培养基的同时，要避免干细胞从鱼胶原蛋白创面修复海绵进入瓶中的培养基。

[0057] 4、将干细胞和鱼胶原蛋白创面修复海绵共培养

[0058] 将注入了干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵置于二氧化碳培养箱中，37℃共培养2天，然后更换培养瓶B中的细胞完全培养基，再37℃继续培养1～3天，待鱼胶原蛋白创面修
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复海绵内部的干细胞浓度达到1*10个/cm时，即得到负载干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵(以下简称修复材料)，将修复材料取出备用。

[0059] 5、脱水

[0060] 将培养好的修复材料在37℃进行轻度的鼓风干燥脱水处理，当修复材料的重量减至脱水前重量的1/2～2/3时，将修复材料取出备用。

[0061] 对脱水后的修复材料进行电镜扫描。扫描结果见图2。图2的扫描结果显示：鱼胶原蛋白创面修复海绵的表面和内部均有大量的干细胞在爬行(伸出伪足)、黏附和分裂，干细胞生长状态良好。说明第一部分制备得到的鱼胶原蛋白创面修复海绵可以为细胞的爬行和黏附提供良好的支架，细胞可以很好的负载到该鱼胶原蛋白创面修复海绵上。

[0062] 在对脱水后的修复材料进行电镜扫描时，还对脱水前的修复材料进行了电镜扫描，扫描结果显示：与脱水前相比，轻度的脱水处理，有效的缩小了鱼胶原蛋白创面修复海绵的孔径。孔径缩小后，可以使干细胞更好的被固定在鱼胶原蛋白创面修复海绵的内部，便于后期修复材料植入后干细胞在创面位置靶向发挥作用。

[0063] 为进一步验证干细胞与鱼胶原蛋白创面修复海绵共培养后的状态，对脱水前的修复材料进行活死细胞染色。染色结果见图3。

[0064] 图3的染色结果显示：在同一视野范围内，脱水前的修复材料表面和内部均布满绿色荧光，仅有极少数的红色荧光。说明负载在鱼胶原蛋白创面修复海绵上的干细胞大部分是活细胞，极少数出现了细胞凋亡，这也再次说明第一部分制备得到的鱼胶原蛋白创面修复海绵具有良好的细胞相容性，可以诱导细胞在其表面和内部进行爬行、黏附和分裂等行为。

[0065] 第三部分、验证修复材料的创面修复效果

[0066] 实验1

[0067] 实验组：将干细胞的细胞核用绿色荧光进行标记，然后按照第二部分记载的方法将干细胞负载到鱼胶原蛋白创面修复海绵上，之后植入大鼠背部创面位置，7天后观察荧光的发光情况。

[0068] 对照组：将干细胞的细胞核用绿色荧光进行标记，然后将干细胞直接注射在大鼠背部创面位置，7天后观察荧光的发光情况。

[0069] 观察结果：7天后，实验组大鼠背部的荧光发光情况如图4所示，大鼠的创面位置仍有大量绿色荧光；对照组大鼠背部的荧光发光情况如图5所示，大鼠的创面位置已无绿色荧光。

[0070] 由图4和图5可知，干细胞负载到鱼胶原蛋白创面修复海绵上之后，可以被固定到创面位置发挥作用。

[0071] 实验2

[0072] 实验组：将负载干细胞的鱼胶原蛋白创面修复海绵植入到大鼠的由糖尿病诱发的慢性创面(直径1.5cm)处，记录大鼠的创面全部愈合所需时间。

[0073] 对照组：对大鼠的由糖尿病诱发的慢性创面(直径1.5cm)不做任何处理，观察实验组大鼠的创面全部愈合时对照组大鼠的创面愈合情况。

[0074] 观察结果：在第21天，如图6所示，实验组所有大鼠的创面均全部愈合，而此时，如图7所示，对照组所有大鼠都有直径1cm左右的创面尚未愈合。

[0075] 由此可见，本发明提供的修复材料能够将干细胞靶向固定在创面位置，局部为创面提供稳定的干细胞，从而促进创面的快速愈合。

[0076] 需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。