一株高产香气物质的扣囊复膜酵母cx-3菌株及其应用

摘要

本发明公开了一株高产香气物质的扣囊复膜酵母cx‑3菌株及其应用，所述菌株于2021年9月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：61938。本发明研究的cx‑3菌株，能够产出32种挥发性香气化合物，主要以醇类和酯类为主，能高产43.43％具有玫瑰花香气的β‑苯乙醇，产量为72.10mg/L，将该菌株用于米酒酿造工艺中，能使米酒具备更好的香味以及品质；并在不同的培养条件下能高产具有益生功效的吲哚，含量能达到54％左右，同时提高了吲哚的生物合成率。因此可以通过控制菌株cx‑3不同培养条件，来有目的性地选择菌株不同生产作用，可实现菌株多功能应用，为食品工业提供了优良的菌种。

权利要求

1.扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）cx‑3菌株在生产香气物质中的应用，其特征在于，所述cx‑3菌株于2021年9月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC NO：61938；

所述生产香气物质为高产苯乙醇组香气物质或产吲哚组香气物质；

所述高产苯乙醇组香气物质的培养条件为：30℃，pH 7.2，采用MRS培养基：酪蛋白胨

10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20.0g、琼脂

20.0g；

所述产吲哚组香气物质的培养条件为：30℃，pH 7.2，采用酵母提取物缺陷型MRS培养基：酪蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 

1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20.0g、琼脂20.0g。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述高产苯乙醇组香气物质为：β‑苯乙醇、乙酸癸酯、辛酸乙酯、乙酸‑2‑苯乙酯、庚酸乙酯、乙酸异戊酯、反式‑4‑癸烯酸乙酯、苯乙醛、癸酸乙酯、5‑丁基二氢‑2(3H)呋喃酮、壬酸乙酯、己酸乙酯、乙酸辛酯、3‑苯丙酸乙酯、2,5‑二甲基吡嗪或2‑甲基吡嗪中的一种或多种；

所述产吲哚组香气物质为：β‑苯乙醇、吲哚、5‑丁基二氢‑2(3H)呋喃酮或2,5‑二甲基吡嗪的一种或多种。

3.采用权利要求1所述扣囊复膜酵母cx‑3菌株酿造米酒的方法，其特征在于，所述方法以大米作为底物，采用安琪酵母和权利要求1所述cx‑3菌株进行复配添加，发酵酿造。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述安琪酵母和权利要求1所述cx‑3菌株的复配比例为0.5～1.5:1～2，cx‑3菌株在底物中添加量为0.2％～0.6％。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述安琪酵母和权利要求1所述cx‑3菌株的复配比例为1:1，cx‑3菌株在底物中添加量为0.3％。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵条件为25～45℃，1～20d。

说明书

一株高产香气物质的扣囊复膜酵母cx‑3菌株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一株高产香气物质的扣囊复膜酵母cx‑3菌株及其应用。

背景技术

[0002] 扣囊复膜酵母是一种能产生菌丝和子囊孢子的酵母，又称扣囊复膜孢酵母，扣囊拟内孢霉，其是通过出芽生殖形成酵母状细胞，具有典型的二相性。因其具有强大淀粉分解能力，所以广泛分布于含有大量淀粉的基质中，同时也是清香型白酒酒曲中的主要呈香菌和功能菌株。

[0003] 大量研究发现扣囊复膜酵母广泛存在于各种酒曲中，能产淀粉酶，酸性蛋白酶，葡萄糖苷酶，且其所产的酶都具有较高的活性；除此之外，不少研究发现扣囊复膜酵母还具有一定的产香产酯。在酿酒工业中，其产香产酯能力又在不同程度条件下增加酒的香气，丰富了酒的风味。这些决定了扣囊复膜酵母在酿酒工业中有极大的研究价值和发展潜力，因而备受关注。

[0004] 目前对于其的研究大多集中于研究其产酶能力上，并在发酵和制药上都得到广泛应用，如现有技术公开了一株扣囊复膜孢酵母Y‑1菌，该菌株产α‑淀粉酶活是目前已知最高酶活(7425.4U/g)的2.56倍，同时还具有产生其他不同的7种酶的能力，产酶种类多且酶活性高。虽然也有研究扣囊复膜酵母菌株JM‑3的固态发酵挥发性风味物质主要有苯乙醇、4‑乙基愈创木酚、乙酸、异戊酸等(刘茗铭.高温大曲中产香功能微生物的筛选及其应用研究[D].四川轻化工大学,2019.)，但仅是分析了其产香的物质，其中多为酯类物质，并没有对该特性进一步的研究，而对其挥发性香气成分或代谢产物的研究还较少。而且除了菌株不同外，培养基成分、培养条件和酶活力等的不同也会使扣囊复膜酵母产生不同的代谢产物组份。虽然扣囊复膜酵母是属于产香酵母，但鲜有报道该菌株用于产香物质的合成和利用上，也从未报道过可产具有益生功效的吲哚类物质的扣囊复膜酵母功能菌株。

发明内容

[0005] 本发明提供一株新的具有高产的香气物质和吲哚的扣囊复膜酵母功能菌株，能用于产香物质的合成，实现菌株的多功能应用。

[0006] 本发明的第二个目的在于提供所述扣囊复膜酵母cx‑3菌株的应用。

[0007] 本发明的第三个目的在于提供一种米酒酿造方法。

[0008] 本发明的第四个目的在于提供一种利用酵母生产吲哚的方法。

[0009] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：

[0010] 一株高产香气物质的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)cx‑3菌株，其特征在于，所述菌株于2021年9月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC NO：61938。

[0011] 本发明从青稞酒酒曲中分离获得扣囊复膜酵母cx‑3菌株，菌落为乳白色，孢子量中等，菌丝蓬松稀疏，呈放射状，在显微镜下该菌株呈丝状，适宜生长温度范围20～40℃，适宜生长pH范围5～8。菌株cx‑3的5.8S rDNA和28S rDNA基因间隔片段基因序列，通过NCBI的BLAST进行对比，结果表明该菌株与Saccharomycopsis fibuligera相似性最高，相似度超过99％以上。

[0012] 本发明研究发现，该菌株经香气物质成分鉴定测得其能够产出32种挥发性香气化合物，其中主要以醇类和酯类为主，含有6种醇类，16种酯类、3种醛类、2种吡嗪类、3种酮类和3种其他类(1种呋喃类、1种吡啶类、1种胺类)。且能够高产43.43％具有玫瑰花香气的β‑苯乙醇、有5.25％带有白兰地酒香气的辛酸乙酯、3.00％带有玫瑰花香和苹果样果香的乙酸‑2‑苯乙酯、2.07％带有香蕉和梨香气的乙酸异戊酯、2.01％带有曲香和菠萝香型的香气的己酸乙酯、1.71％带有甜香的反式‑4‑癸烯酸乙酯、0.49％带有花果香气的3‑苯丙酸乙酯、0.44％带有水果香气的乙酸乙酯、0.29％带有梨香和白兰地酒香气的癸酸乙酯等酯类物质。

[0013] 因此，本发明提供所述扣囊复膜酵母cx‑3菌株在生产香气物质中的应用。

[0014] 本发明还提供所述扣囊复膜酵母cx‑3菌株在酿酒中的应用。

[0015] 优选地，所述香气物质为β‑苯乙醇、吲哚、乙酸癸酯、辛酸乙酯、乙酸‑2‑苯乙酯、庚酸乙酯、乙酸异戊酯、反式‑4‑癸烯酸乙酯、苯乙醛、癸酸乙酯、5‑丁基二氢‑2(3H)呋喃酮、壬酸乙酯、己酸乙酯、乙酸辛酯、3‑苯丙酸乙酯、2,5‑二甲基吡嗪或2‑甲基吡嗪中的一种或多种。

[0016] 本发明提供一种米酒酿造方法，以大米作为底物，采用安琪酵母和cx‑3菌株进行复配添加，发酵酿造。

[0017] 优选地，所述安琪酵母和cx‑3菌株的复配比例为0.5～1.5:1～2，cx‑3菌株在底物中添加量为0.2％～0.6％。

[0018] 更优选地，所述安琪酵母和cx‑3菌株的复配比例为1:1，cx‑3菌株在底物中添加量为0.3％。

[0019] 优选地，发酵条件为25～45℃，1～20d。

[0020] 本发明还一种利用酵母生产吲哚的方法，以酵母提取物缺陷型MRS培养基作为底物，采用cx‑3菌株进行培养生产。

[0021] 优选地，培养条件为20～35℃，12～72h。

[0022] 本发明具有以下有益效果：

[0023] 本发明提供了一株新型的高产香气物质的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)cx‑3菌株，该菌株能够产出32种挥发性香气化合物，其中主要以醇类和酯类为主，含有6种醇类，16种酯类、3种醛类、2种吡嗪类、3种酮类，其能够高产43.43％具有玫瑰花香气的β‑苯乙醇，产量为72.10mg/L，并在不同的培养条件下还能够高产具有益生功效的吲哚，吲哚含量能达到54％左右，提高了生物合成的效率。

[0024] 本申请不同于现有技术中的扣囊复膜酵母是产酶或者产酒精，产乙酸等有机酸和乙酸苯乙酯类物质或产乙酸乙酯，本发明的菌株所产香气化合物，不仅能用于米酒的酿造中，可以增加其香气和品质，还能用于吲哚的生产中，提供一种能产吲哚的微生物菌株同时用于酒的酿造工艺中，具有很好的应用价值；其产出的香气物质β‑苯乙醇或吲哚，都比一般产此类物质的菌株产量高，合成的效率高。

[0025] 菌株cx‑3产出的特殊香气成分为其应用在各个领域奠定了可行性，除了能够产生大量的β‑苯乙醇外，还能够产生多种醇类、酯类、醛类、吡嗪类等为其运用在其它增香食品中提供可能性，如其中具有坚果香的吡嗪类物质可以运用于烟草添加剂中。而在酵母提取物缺陷型MRS培养基中发酵时，其主要的挥发性化合物为吲哚，吲哚对是具有保健功效的，所以可以通过控制菌株cx‑3的不同培养条件，来有目的性地选择菌株的不同生产作用，可实现菌株多功能应用。

附图说明

[0026] 图1为菌株的菌落图；

[0027] 图2为菌株在显微镜成像图；

[0028] 图3为酿造米酒的方法流程。

具体实施方式

[0029] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0030] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0031] 实施例1菌株的筛选和鉴定

[0032] 采集西藏林芝地区的青稞酒酒曲，称取稞酒酒曲1g，放置在含有99mL的无菌三级水中，其中加入适量的玻璃珠的三角瓶中，置于室温200rpm/min的摇床中30min，使得酒曲‑2得到充分研磨，微生物得到充分分散，此三角瓶中的菌悬液的菌浓度即为原始样品的10倍。

[0033] 采用梯度稀释的方法，将适宜稀释度的菌悬液涂布在MRS固体培养基上，平板倒置放在30℃培养箱培养2d，依据菌落形态，在MRS固体培养基上多次划线纯化，获得纯化菌株。

[0034] 形态学鉴定：

[0035] 将菌株接种于培养基平板上30℃倒置培养2d，观察其菌落形态，分析菌株的生物学特性以及显微镜下的形态。

[0036] 菌株在培养基培养2d的菌落形态如图1所示，呈现乳白色，孢子量中等，菌丝蓬松稀疏，呈放射状，如图2所示在显微镜下该菌株呈丝状。

[0037] ITS序列测序及鉴定：

[0038] 纯化后的菌株于MRS培养基活化24h后。取1ml菌液制备DNA模板，以引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和引物ITS4(TCCTCCGCTTATrGATATGC)，进行PCR扩增，通过ITS测序分析，测序获得5.8S rDNA和28S rDNA基因间隔片段基因序列，通过NCBI的BLAST比对，获得同源性较高的已知标准菌株信息，鉴定为Saccharomycopsis fibuligera菌株，并对相似度超过99％以上的菌株做种属鉴定，最终获得菌株种属信息。

[0039] 本实例中一共获得92株Saccharomycopsis fibuligera菌株。分别将这些Saccharomycopsis fibuligera菌株进行发酵，测定其香气含量，最终获得一株产香效果最好的Saccharomycopsis fibuligera菌株命名为cx‑3，并于2021年9月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：61938，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

[0040] 且经过研究分析表明菌株cx‑3的适宜生长温度范围20～40℃，适宜生长pH范围5～8。

[0041] 实施例2菌株cx‑3产香气物质的测定

[0042] 香气物质的检测方法：采用顶空‑固相微萃取法‑气相质谱法(HS‑SPME‑GC/MS)。

[0043] 准确量取5g含菌株cx‑3的发酵液样品于15ml样品瓶中，加盖密封，将各个进样瓶放置取样位置运行软件Thermo ScientificI Xcalibur程序。其中，采用的色谱柱型号：VF‑5ms(30m×0.25mm×0.25μm)；萃取头：PDMS‑CAR‑DVB；进样口温度：250℃；载气：He，
99.999％；初始温度40℃，保持3min，以4℃/min，升至150℃，保持1min，再以8℃/min升至
250℃，保持6min。

[0044] 质谱条件：质量分离器：离子阱；离子源：EI；电离能量：70eV；离子阱温度：220℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟时间1min。扫描方式：全扫描；扫描范围：50‑500m/z；检索谱库：NISTO5。采用峰面积比值法进行化合物相对定量分析。

[0045] 以同一批次青稞酒曲分离出来的菌株，在不同培养条件下，进行香气成分代谢分析，其中，高产苯乙醇组的培养条件是通过研究出菌株cx‑3的最佳培养条件为：30℃，pH 7.2，采用MRS培养基：酪蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰
0.05g、碳酸钙20.0g、琼脂20.0g；

[0046] 而产吲哚组则是采用不同的培养条件进行培养，其培养条件为：30℃，pH 7.2，采用的是酵母提取物缺陷型MRS培养基，即在MRS培养基中不含有酵母提取物，而其余成分用量不变；进行香气成分代谢分析，再经过顶空‑固相微萃取法‑气相质谱法检测各香气物质的相对含量，得到如下表1所示物质。

[0047] 表1 HS‑SPME‑GC/MS检测香气物质

[0048]

[0049]

[0050] 注：其中香气成分占比为不同培养条件下单次发酵产物占总产物的比值。

[0051] 从上述数据中可以看出在最适宜菌株cx‑3的培养条件下能高产香气物质β‑苯乙醇49.98％和其他多种香气物质，通过外标法测定β‑苯乙醇标准曲线，计算得出β‑苯乙醇的产量为72.10mg/L，本菌株cx‑3的产量远高于现阶段其他的酵母。在不同的培养条件下，菌株cx‑3能够产生大量的吲哚，而不再产生各种香型的酯类物质，其生产吲哚的产量高达54.08％，比一般的生物合成吲哚的效率要高。

[0052] 具体经香气物质成分鉴定实验测得其高产苯乙醇组产出的32种挥发性香气化合物，其中主要以醇类和酯类为主，含有6种醇类，16种酯类、3种醛类、2种吡嗪类、3种酮类和3种其他类(1种呋喃类、1种吡啶类、1种胺类)。

[0053] 实施例3菌株cx‑3的米酒酿造方法

[0054] 本实施例提供一种米酒酿造方法，以大米作为底物，采用安琪酵母和菌株cx‑3复配添加进行发酵酿造，其中，安琪酵母和菌株cx‑3的复配比例为1:1，其菌株cx‑3在底物中添加量为0.2％～0.6％，优选添加量为0.3％。在30℃发酵3d，待有酒香味时适当搅拌，再按照米：水＝1：1.2(400g：600mL)的比例加入35℃的水，续发酵至15d左右待来酿满窝，味甜蜜时即发酵结束。

[0055] 其酿造的方法流程如图3所示，采用菌株cx‑3发酵酿造的米酒与安琪酵母复配发酵后会使酒酿附带令人愉悦的花果香香气风味，比一般的米酒香味更加浓郁丰富。

[0056] 本发明还在酿造米酒时只添加安琪酵母或菌株cx‑3进行发酵比较，结果表明，只添加安琪酵母发酵后的米酒在香味和口感上没有复配添加发酵的米酒好；而只添加菌株cx‑3进行发酵的米酒，虽然带有花果香香气风味，但其米酒的酒精含量较低，没有复配的米酒的酒精含量没高；因此，采用安琪酵母或菌株cx‑3进行复配发酵后，其米酒的香气和品质口感都会比单独发酵的米酒要好。

[0057] 实施例4菌株cx‑3产吲哚方法

[0058] 本实施例提供一种酵母产吲哚的方法，采用cx‑3菌株以酵母缺陷型MRS培养基作为底物进行发酵，其酵母缺陷型MRS培养基的成分为：酪蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20.0g、琼脂20.0g。

[0059] 在30℃的条件下培养48h，通过顶空‑固相微萃取法‑气相质谱法检测吲哚物质的相对含量，其方法条件同实施例2。

[0060] 结果表明，采用菌株cx‑3进行培养生产，经过气相质谱检测所产吲哚物质的含量在54％左右。

[0061] 综上所述，本发明研究的扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)cx‑3在不同的培养条件下可以生产不同的物质，其中，在菌株cx‑3的最适培养条件下，能高产43.43％具有玫瑰花香气的β‑苯乙醇，其产量能达到72.10mg/L，相比于现有研究中的酵母产β‑苯乙醇的产量在13.1mg/L～28.6mg/L之间，是比现有技术中产β‑苯乙醇的产量更高(数据来自：卢延想,梁慧珍,陈鹏,刘正,钟成.高温大曲中产香酵母的筛选及特征香气分析[J].食品研究与开发,2021,42(11):167‑174.)，以及还能产出其他30多种挥发性香气化合物，应用于米酒的酿造中可以提高米酒的香气品质和气味特性；而采用酵母提取物缺陷型MRS培养基进行培养时，菌株cx‑3会高产54.08％吲哚，而香气物质的产量会很低，同时提高了吲哚的生物合成率。因此可以通过控制菌株cx‑3的不同培养条件，来有目的性地选择菌株的不同生产作用，可实现菌株多功能应用，为食品工业提供了优良的菌种，在酒的酿造中具有很好的应用价值。

[0062] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。