一株坚强芽孢杆菌及其在制备植物病原菌抑菌剂中的应用

摘要

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株坚强芽孢杆菌及其在制备植物病原菌抑菌剂中的应用，本发明涉及到的坚强芽孢杆菌FJW3，保藏编号为CCTCC NO：M 2020405，对多种植物病原菌抑制效果较好，其中对腐皮镰刀菌及尖孢镰刀菌抑菌率高达95%左右，对香蕉枯萎病菌，茄病镰刀菌的抑制率均在90%左右，对厚垣镰刀菌、毛霉的抑制率都在88%以上，对青霉、漆斑、黑曲霉的抑制作用不强，抑菌率在20%至30%之间，可在一定程度上抑制其孢子的生长，坚强芽孢杆菌对米根霉没有明显抑制作用。坚强芽孢杆菌对多种植物致病菌均有较好的抑制作用，并且环境适应能力强，具备制备成生防菌的潜在应用价值。

权利要求

1. 一株分离的芽孢杆菌为坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus），保藏编号为：CCTCCM 

2020405。

2. 权利要求1所述的坚强芽孢杆菌在制备抑菌剂中的应用，所述的抑菌剂的抑菌对象为Fusarium oxysporumF.sp. Cubense、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）、厚垣镰刀菌（Fusarium chlamydosporum）、Penicillium glaucum、Rhizomucor variabilis、漆斑（Myrothecium）或黑曲霉（Aspergillus niger）。

3. 权利要求1所述的坚强芽孢杆菌在制备同时抑制Fusarium oxysporumF.sp. Cubense、尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）、厚垣镰刀菌（Fusariumchlamydosporum）、Penicillium glaucum、Rhizomucor variabilis、漆斑（Myrothecium）、黑曲霉（Aspergillus niger）抑菌剂中的应用。

说明书

一株坚强芽孢杆菌及其在制备植物病原菌抑菌剂中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株坚强芽孢杆菌及其在制备植物病原菌抑菌剂中的应用。

背景技术

[0002] 病害生物防治，具有无污染、不诱导抗药性、防效持久等特点，是今后植物病害控制的主要方向。人们对芽孢杆菌生防潜能的研究至少已有40年的历史，田间应用研究己经证实芽孢杆菌生防菌剂在产品中的稳定性与化学农药的相容性，芽孢杆菌一致性方面明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是生物防治中报道较多的一种拮抗细菌，在植物病害的生物防治中发挥着尤为重要的作用，它能够产生广谱的抗菌代谢物质，是土壤和植物微生态的优势微生物种群，具有很强的抗逆能力和抗菌防病[1]作用 ，许多性状优良的天然分离株已成功地应用于植物病害生物防治。

[0003] 研究表明坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)对小麦根腐病菌、核桃炭疽病菌、烟草赤星病菌、玉米小斑病菌、棉花红腐病菌、黄瓜灰霉病菌、冬枣黑斑病菌等等抑制作用强，对[2]核桃炭疽病菌、玉米小斑病菌、小麦根腐病菌、苹果轮纹病菌菌丝生长抑制作用最强 。另外，坚强芽孢杆菌菌丝对无花果炭疽病菌以及石榴炭疽病菌的额抑菌率都达到80％以[3]
上 。坚强芽孢杆菌对大蒜菌核病菌的抑菌率只有50％，对花生白绢病菌并没有抑制作[4]
用 。研究显示坚强芽孢杆菌能适应的温度范围为15℃‑45℃，pH范围为：0‑9，盐浓度范围[5]
为：0％‑12％ 。

[0004] 研究表明坚强芽孢杆菌在生长过程中产生于体外的代谢产物抑制了种病原真菌的生长，其非挥发性抗菌物质可使病原菌菌丝畸形，细胞崩溃，菌丝断裂，内含物外泄，菌丝[6]变得皱缩干瘪，从而使病菌丧失对植物的侵染能力 ，但由于不同株坚强芽孢杆菌其代谢产物不同，因此最终呈现的抑菌效果是不同的。本发明提供的坚强芽孢杆菌菌丝对温度，PH，盐浓度的适应范围更广，同时首次报道坚强芽孢杆菌对多种病原菌都具有抑制作用，本发明提供的菌株，对于深入研究坚强芽孢杆菌的生防作用具有很大价值，挖掘其作为生防菌的潜力。

[0005] 参考文献

[0006] [1]袁海峰,周舒扬,甄涛,等.新型芽孢杆菌在农业领域应用研究进展[J].国土与自然资源研究,2020,(2):92‑94.

[0007] [2]山东省林业科学研究院.一株坚强芽孢杆菌及其应用:CN200910256465.2[P].2010‑09‑29.

[0008] [3]山东省林业科学研究院.一株坚强芽孢杆菌及其在防治无花果、石榴炭疽病方面的应用:CN201610890367.4[P].2016‑12‑21.

[0009] [4]王清海,牛赡光,刘幸红,等.拮抗菌Bf‑02菌株鉴定及对几种植物病原真菌抑制活性测定[J].山东农业大学学报(自然科学版),2010,41(4):513‑516.DOI:10.3969/j.issn.1000‑2324.2010.04.009.

[0010] [5]赵先锋.利用农业副产品发酵坚强芽孢杆菌及其用于加强生物絮团培养的研究[D].山东:中国海洋大学,2011.DOI:10.7666/d.y1926657.

[0011] [6]刘富平,朱天辉.坚强芽孢杆菌B‑305对3种病原真菌抗生现象的研究[J].海南大学学报(自然科学版),2006(04):374‑377.

发明内容

[0012] 本发明的目的在于提供一株坚强芽孢杆菌，该细菌保藏在中国典型培养物保藏中心，分类命名为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)FJW3，保藏编号为CCTCC NO：M 2020405。

[0013] 本发明的另一个目的在于提供一株坚强芽孢杆菌FJW3的在制备抑菌剂中的应用。

[0014] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

[0015] 申请人自陕西渭南市蒲城县土样中，分离出一株对多种病原菌具有抑菌作用，且抑菌率高的细菌，经鉴定为坚强芽孢杆菌，该细菌已于2020年08月07日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，分类命名：坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)FJW3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020405

[0016] 分离得到的坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，在LB固体培养基上的菌落形态如图1所示，菌落形态为乳白色表面光滑的圆形，菌落饱满不透明。生理生化表现为革兰氏阳性，不可水解淀粉，不可水解纤维素，甲基红试验为阴性，乙酰甲基甲醇实验为阴性，过氧化氢酶阳性。

[0017] 一株坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)在制备成植物病原菌抑菌剂中的应用，所述的植物病原菌为香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporumF.sp.Cubense)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、茄病镰刀菌(Fusariumsolani)、厚垣镰刀菌(Fusariumchlamydosporum)、青霉菌(Penicillium glaucum)、毛霉菌(Rhizomucorvariabilis)、漆斑(Myrothecium)或黑曲霉(Aspergillus niger)。

[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下特点：

[0019] 本发明中的坚强芽孢杆菌生长迅速，有极强的耐盐碱能力，环境适应能力强。

[0020] 本发明中的坚强芽孢杆菌对导致植物枯萎病的多种致病菌均有较好的抑菌效果，首次报道了一株对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporumF.sp.Cubense)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、茄病镰刀菌(Fusariumsolani)、厚垣镰刀菌(Fusariumchlamydosporum)、青霉菌(Penicillium glaucum)、毛霉菌(Rhizomucorvariabilis)、漆斑(Myrothecium)和黑曲霉(Aspergillus niger)都有抑制效果的的坚强芽孢杆菌。

附图说明

[0021] 图1为坚强芽孢杆菌的培养性状图。

[0022] 图2为腐皮镰刀菌的抑制作用示意图。

[0023] 图3为尖孢镰刀菌的抑制作用示意图。

[0024] 图4为茄病镰刀菌的抑制作用示意图。

[0025] 图5为对青霉的抑制作用示意图。

[0026] 图6为对香蕉枯萎病病原菌的抑制作用示意图。

[0027] 图7为对厚垣镰刀菌的抑制作用示意图。

[0028] 图8为对毛霉的抑制作用示意图。

[0029] 图9为对米根霉的抑制作用示意图

[0030] 图10为对漆斑的抑制作用示意图。

[0031] 图11为对黑曲霉的抑制作用示意图。

具体实施方式

[0032] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

[0033] 实施例1：

[0034] 坚强芽胞杆菌的分离及鉴定：

[0035] 来自于陕西渭南市蒲城县土样2.5g置于50ml的无菌水中，30℃250rpm摇1h，之后‑1 ‑2 ‑3 ‑4 ‑5取500μl土壤悬液在装有4.5ml无菌水的PA瓶中进行梯度稀释。取10 、10 、10 、10 、10这几个稀释度的土壤悬液分别加在培养基中进行涂布，培养24h、48h、72h、96h后观察平板菌落生长情况，将所有长出来的菌落分别挑出来，进行抑菌活性实验；选择抑菌率高且抑菌谱广的细菌，再进一步进行耐盐碱的筛选；最终筛选出了坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)。

[0036] (1)形态特征

[0037] 分离得到的坚强芽孢杆菌，在LB固体培养基上的菌落形态如图1所示，菌落呈乳白色表面光滑的圆形，菌落饱满不透明。

[0038] (2)生理生化实验

[0039] 生理生化表现为革兰氏阳性，不可水解淀粉，不可水解纤维素，甲基红试验为阴性，乙酰甲基甲醇实验为阴性，过氧化氢酶阳性。

[0040] (3)坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)的基因鉴定

[0041] 用细菌DNA抽提试剂盒提取待测菌株的基因组DNA，具体操作步骤参照说明书。以提取的细菌基组DNA作为模板，对细菌进行扩增，扩增16S rRNA的引物：

[0042] 27F:5＇‑GTTTGATCCTGGCTCAG‑3＇

[0043] 1492R:5＇‑TACGGCTACCTTGTTACGACTT‑3＇；

[0044] 序列经Blast16SrDNA序列进行同源性比对分析，结果分析表明其与菌株发现其与菌株Bacillus firmus的16SrDNA基因序列相似性最高，属于一株坚强芽孢杆菌，该菌株已于2020年8月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉武汉大学，分类命名：坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)FJW3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020405。

[0045] 实施例2：

[0046] 坚强芽孢杆菌的耐受性测试：

[0047] (1)耐pH范围实验：

[0048] 将坚强芽孢杆菌种子液按照2％的接种量分别接种于初始pH不同的LB培养基中，在30℃、200r/min条件下培养，培养16h后取样测OD600(初始OD为0)。培养基的初始pH梯度设置为3、4、5、6、7、8、9、10。

[0049] LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

[0050] PH 3 4 5 6 7 8 9 10OD600 0 0 1.912 2.376 2.122 1.481 1.339 0

[0051] (2)耐盐浓度试验：

[0052] 将坚强芽孢杆菌种子液按照2％的量分别接种于盐浓度不同的LB培养基中，在30℃、200r/min条件下培养，培养16h后取样测OD600(初始OD为0)。培养基的盐浓度梯度设置为0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％。(1％盐浓度：1gNaCl/100g水，以此类推)。

[0053] LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

[0054]

[0055]

[0056] (3)生长温度实验：

[0057] 将坚强芽孢杆菌种子液按照2％的量接种于LB培养基中，在不同温度条件下摇床培养，培养200r/min摇床培养，培养16h后取样测OD600(初始OD为0)。培养基的温度梯度设置为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃。

[0058]温度(℃) 20℃ 25℃ 30℃ 35℃ 40℃ 45℃ 50℃ 55℃
OD600 2.876 3.456 3.392 4.184 4.168 3.928 1.916 0

[0059] 综合(1)‑(3)的结果，本发明提供的坚强芽孢杆菌对温度，PH，盐浓度的适应范围较为广泛，能适应的最高温度达到50℃，适应的PH范围为5‑9，能在0％‑15％的盐浓度下生长，并且在15％的盐浓度下也能持续缓慢生长。坚强芽孢杆菌在35℃，PH6，盐浓度1％的条9
件下生长最快，在此最适条件下培养16h，坚强芽孢杆菌有效菌浓度达到10^CFU/ml。

[0060] 实施例3：

[0061] 坚强芽孢杆菌对植物病原菌的抑制作用：

[0062] 采用抑菌圈法测定坚强芽孢杆菌对病原菌的抑制能力。用LB活化坚强芽孢杆菌，将种子液适当稀释后涂布到PDA平板上，以涂布无菌水作为对照试验组。在长满病原真菌的PDA平板上用枪头进行打孔，挑取真菌菌块倒置接种在涂有坚强芽孢杆菌的PDA平板上，将平板置于37℃培养4d，测量真菌菌落直径，计算抑菌率，从而分析抑菌的效果。

[0063] 本实验选取的植物病原菌有香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporumF.sp.Cubense)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、厚垣镰刀菌(Fusarium chlamydosporum)、青霉菌(Penicillium glaucum)、毛霉菌(Rhizomucorvariabilis)、米根霉(Rhizopus  oryzae)，漆斑(Myrothecium)，黑曲霉(Aspergillus niger)。

[0064] PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1 000mL，pH为自然pH，115℃高压蒸汽灭菌30min。

[0065]

[0066] 注：D，对照平板菌落直径(mm)；d，实验平板菌落直径(mm)。

[0067] 坚强芽孢杆菌对常见的香蕉枯萎病菌、腐皮镰刀菌、茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌有非常好的防治效果，对引起这三种植物病害的致病菌的抑制率均能达到90％以上；对厚垣镰刀菌、毛霉的抑制率都在88％以上，对青霉、漆斑、黑曲霉的抑制作用不强，抑菌率在20％至30％之间，可在一定程度上抑制其孢子的生长，坚强芽孢杆菌对米根霉没有明显抑制作用。
对各菌的抑菌率如下表所示。

[0068]序号 病原菌 D d 抑菌率(％)
1 香蕉枯萎病菌 85.00 22.20 93.18
2 茄病镰刀菌 81.70 25.00 90.63
3 尖孢镰刀菌 87.00 20.80 94.28
4 厚垣镰刀菌 74.12 25.00 88.62
5 腐皮镰刀菌 73.44 14.72 95.98
6 毛霉 71.72 24.14 88.67
7 青霉 81.74 72.51 21.31
8 米根霉 81.10 79.96 2.79
9 漆斑 83 74 20.51
10 黑曲霉 71 59 30.95

[0069] 由以上实施例可知，本发明提供了一株坚强芽孢杆菌，对于防治腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、香蕉枯萎病菌、茄病镰刀菌、毛霉、厚垣镰刀菌引起的植物枯萎病均具有良好的防治效果，具有制备成生物防治剂的巨大潜力。

[0070] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术邻域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。