一株不动杆菌及其在提高植物抗逆性中的应用

摘要

本发明公开了一株不动杆菌及其在提高植物抗逆性中的应用。本发明提供了不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.23604。本发明提供的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2可以提高水稻、玉米和拟南芥的对盐碱胁迫抗性，具体表现为干重、鲜重和总根长显著增加，地上部分高度增加(即株高增加)，叶片长度增加，叶片总表面积增加，叶片枯萎减少。通过检测YJ‑AD2作为促生菌的生化实验，YJ‑AD2具备溶磷、固氮、分泌生长素和分泌ACC脱氨酶的能力，这些指标是YJ‑AD2具备促生菌潜力的重要佐证。本发明具有重要的应用价值。

权利要求

1.不动杆菌（Acinetobacter sp.）YJ‑AD2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 23604。

2.一种菌剂，其活性成为权利要求1所述的不动杆菌（Acinetobacter sp.）YJ‑AD2和/或其代谢物。

3.权利要求1所述的不动杆菌（Acinetobacter sp.）YJ‑AD2的培养物，是将权利要求1所述的不动杆菌（Acinetobacter sp.）YJ‑AD2在细菌培养基中培养得到的物质。

4.权利要求1所述的不动杆菌（Acinetobacter sp.）YJ‑AD2或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的培养物在如下至少一种中的应用：（a1）增强植物的抗盐碱性；

（a2）制备增强植物的抗盐碱性的产品。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述促进植物生长体现为如下中的全部或部分：（b1）在盐碱胁迫条件下促进植物根伸长；

（b2）在盐碱胁迫条件下促进植物干重增加；

（b3）在盐碱胁迫条件下促进植物鲜重增加；

（b4）在盐碱胁迫条件下促进植物株高增高；

（b5）在盐碱胁迫条件下促进植物叶片长度增加；

（b6）在盐碱胁迫条件下促进植物叶片总表面积增加。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述产品为微生物肥料。

7.一种促进植物生长的方法，包括如下步骤：在盐碱胁迫条件下，对受试植物施用权利要求1所述的不动杆菌（Acinetobacter sp.）YJ‑AD2或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的培养物，从而促进植物生长。

8.根据权利要求4‑6中任一所述的应用或权利要求7所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.根据权利要求8所述的应用或方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物；所述双子叶植物为十字花科植物。

10.根据权利要求9所述的应用或方法，其特征在于：所述禾本科植物为玉米或水稻；所述十字花科植物为拟南芥。

说明书

一株不动杆菌及其在提高植物抗逆性中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物农业领域，具体涉及一株不动杆菌及其在提高植物抗逆性中的应用。

背景技术

[0002] 植物在自然环境中生长经常遭受各种生物胁迫和非生物胁迫的严重威胁。其中盐胁迫是威胁全球可持续作物生产的主要非生物性胁迫之一。盐碱地影响植物正常生长，使植物的产量和生物量降低。对农业而言，土地的盐碱化对粮食安全造成威胁。土地盐碱化是目前制约我国农业发展和生态治理的重要瓶颈，人为活动加上迅速的气候变化是导致农业土地退化的土壤盐碱化的主要驱动因素。过高的盐浓度会导致土壤退化，改变土壤渗透和+基质潜力，这是由于过量的可交换Na 和土壤高pH值会导致粘土膨胀和分散，以及由于土壤渗透性、可用水容量和渗透率的下降而导致土壤团聚体减少，从而使土壤不适宜作物生长。
盐胁迫应激会对植物的生理、生化和分子特征产生各种有害影响，并降低农作物生产率。植物在盐胁迫下的生长不良是由于营养动员减少、激素不平衡、活性氧种类(ROS)的形成、离子毒性和渗透应力所致。此外，盐度导致的土壤物理化学性质将影响土壤微生物的活性，导致土壤微生物多样性被破坏，从而降低土壤的健康状况。

[0003] 植物根际促生细菌是指自由生活在土壤或附生于植物根际的一类可促进植物生长、防治病害、增加作物产量的有益菌类。接种植物根际促生菌，可使土壤中无效营养有效化，预防和控制农作物病害，减少农药和化肥的使用，是解决土壤、水源和食品污染的根本途经，被普遍认为是一种环境友好、经济有效的提高作物产量的方法。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一株不动杆菌及其在提高植物抗逆性中的应用。

[0005] 第一方面，本发明要求保护一株不动杆菌。

[0006] 本发明要求保护的不动杆菌具体为不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.23604。

[0007] 第二方面，本发明要求保护一种菌剂。

[0008] 本发明要求保护的菌剂，其活性成分可为前文第一方面所述的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2和/或其代谢物(如分泌物)。

[0009] 上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。

[0010] 上述菌剂中，所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2可以孢子、菌丝或含有孢子和/或菌丝的培养物的形式存在。

[0011] 上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

[0012] 根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

[0013] 在本发明的具体实施方式中，所述菌剂为2×108CFU/mL的所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2的发酵菌液。进一步地，具体按照包括如下步骤的方法制备得到：将所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2接种至细菌培养基并进行培养，获得8
OD600nm值为0.5‑1.0(如1.0)的菌液(2×10CFU/mL)，即为所述菌剂。

[0014] 进一步地，所述细菌培养基为LB液体培养基。

[0015] 在所述菌剂的制备方法中，所述培养的条件可为：25～35℃(如25～30℃、30～35℃、25℃、30℃或35℃)、100‑150r/min(如100‑130r/min、130‑150r/min、100r/min、130r/min或150r/min)培养30～60h(如30～48h、48～60h、30h、48h或60h)。

[0016] 所述菌剂为具有如下功能中全部或部分的菌剂：增强植物的抗盐碱性、促进植物生长、产IAA、产ACC脱氨酶、溶磷、固氮。

[0017] 其中，所述抗盐碱性可为抗盐性和/或抗碱性。

[0018] 所述促进植物生长可体现为如下中的全部或部分：

[0019] (b1)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物根伸长；

[0020] (b2)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物干重增加；

[0021] (b3)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物鲜重增加；

[0022] (b4)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物株高增高；

[0023] (b5)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物叶片长度增加；

[0024] (b6)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物叶片总表面积增加；

[0025] (b7)在盐碱胁迫条件下减少植物叶片枯萎。

[0026] 所述增强植物的抗盐碱性可体现为如下中的全部或部分：

[0027] (b1)在盐碱胁迫条件下促进植物根伸长；

[0028] (b2)在盐碱胁迫条件下促进植物干重增加；

[0029] (b3)在盐碱胁迫条件下促进植物鲜重增加；

[0030] (b4)在盐碱胁迫条件下促进植物株高增高；

[0031] (b5)在盐碱胁迫条件下促进植物叶片长度增加；

[0032] (b6)在盐碱胁迫条件下促进植物叶片总表面积增加；

[0033] (b7)在盐碱胁迫条件下减少植物叶片枯萎。

[0034] 第三方面，本发明要求保护前文第一方面所述的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2的培养物。

[0035] 本发明要求保护的前文第一方面所述的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2的培养物是将所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2在细菌培养基中培养得到的物质(培养容器内的所有物质)。

[0036] 上述培养物中，所述物质包括所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2(菌体自身)和所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2的代谢物。

[0037] 术语“代谢物”是指微生物新陈代谢过程中产生的初级代谢产物和/或次级代谢产物。初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。初级代谢的产物即为初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等。次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。次级代谢的产物即为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型。

[0038] 上述培养物中，所述细菌培养基可为固体培养基或液体培养基。

[0039] 在本发明的具体实施方式中，所述细菌培养基具体为LB培养基。

[0040] 术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。

[0041] 第四方面，本发明要求保护前文第一方面所述的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2或前文第二方面所述的菌剂或前文第三方面所述的培养物在如下至少一种中的应用：

[0042] (a1)增强植物的抗盐碱性；

[0043] (a2)制备增强植物的抗盐碱性的产品；

[0044] (a3)促进植物生长；

[0045] (a4)制备促进植物生长的产品；

[0046] (a5)产IAA；

[0047] (a6)制备产IAA的产品；

[0048] (a7)产ACC脱氨酶；

[0049] (a8)制备产ACC脱氨酶的产品；

[0050] (a9)溶磷；

[0051] (a10)制备溶磷的产品；

[0052] (a11)固氮；

[0053] (a12)制备固氮的产品。

[0054] 在所述应用中，所述抗盐碱性可为抗盐性和/或抗碱性。

[0055] 在所述应用中，所述促进植物生长可体现为如下中的全部或部分：

[0056] (b1)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物根伸长；

[0057] (b2)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物干重增加；

[0058] (b3)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物鲜重增加；

[0059] (b4)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物株高增高；

[0060] (b5)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物叶片长度增加；

[0061] (b6)在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下促进植物叶片总表面积增加；

[0062] (b7)在盐碱胁迫条件下减少植物叶片枯萎。

[0063] 在所述应用中，所述增强植物的抗盐碱性可体现为如下中的全部或部分：

[0064] (b1)在盐碱胁迫条件下促进植物根伸长；

[0065] (b2)在盐碱胁迫条件下促进植物干重增加；

[0066] (b3)在盐碱胁迫条件下促进植物鲜重增加；

[0067] (b4)在盐碱胁迫条件下促进植物株高增高；

[0068] (b5)在盐碱胁迫条件下促进植物叶片长度增加；

[0069] (b6)在盐碱胁迫条件下促进植物叶片总表面积增加；

[0070] (b7)在盐碱胁迫条件下减少植物叶片枯萎。

[0071] 在所述应用中，所述产品可为微生物肥料。

[0072] 所述微生物肥料可为复合微生物肥料和/或生物有机肥。所述复合微生物肥可为菌剂、营养物质和有机质复合而成的肥料。所述复合微生物肥既有微生物的作用，又有化肥的作用。所述生物有机肥可为菌剂和腐熟的有机肥复合而成的一类肥料。复合微生物肥料和/或生物有机肥的剂型可为颗粒剂。

[0073] 第五方面，本发明要求保护一种促进植物生长的方法。

[0074] 本发明要求保护的促进植物生长的方法，可包括如下步骤：在盐碱胁迫条件或非盐碱胁迫条件下，对受试植物施用前文第一方面所述的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2或前文第二方面所述的菌剂或前文第三方面所述的培养物，从而促进植物生长。

[0075] 其中，所述施用可为浇灌。

[0076] 在上述各方面中，所述非盐碱胁迫条件可如正常生长条件(无任何胁迫)下。在本发明的具体实施方式中，以水处理作为非盐碱胁迫条件。

[0077] 在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

[0078] 进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物；所述双子叶植物可为十字花科植物。

[0079] 更进一步地，所述禾本科植物可为玉米或水稻；所述十字花科植物可为拟南芥。

[0080] 在本发明的一个具体实施方式中，所述植物具体为野生型拟南芥Columbia‑0亚型。在本发明的另一个具体实施方式中，所述植物具体为玉米自交系B73。在本发明的再一个具体实施方式中，所述植物具体为水稻品种日本晴。

[0081] 实验证明，本发明提供的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2可以提高水稻、玉米和拟南芥的对盐碱胁迫抗性，具体表现为干重、鲜重和总根长显著增加，地上部分高度增加(即株高增加)，叶片长度增加，叶片总表面积增加，叶片枯萎减少。通过检测YJ‑AD2作为促生菌的生化实验，YJ‑AD2具备溶磷、固氮、分泌生长素和分泌ACC脱氨酶的能力，这些指标是YJ‑AD2具备促生菌潜力的重要佐证。本发明不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2可用于制作生物肥料，具有重要应用价值。

[0082] 保藏说明

[0083] 分类命名：不动杆菌(Acinetobacter sp.)；

[0084] 参椐的生物材料：YJ‑AD2；

[0085] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

[0086] 保藏机构简称：CGMCC；

[0087] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

[0088] 保藏日期：2021年10月14日；

[0089] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No.23604。

附图说明

[0090] 图1为盐碱胁迫条件下YJ‑AD2菌剂对拟南芥幼苗根系生长的影响。

[0091] 图2为碱胁迫条件下YJ‑AD2菌剂对玉米幼苗全苗和地上部分的影响。

[0092] 图3为碱胁迫条件下YJ‑AD2菌剂对玉米幼苗的根部形态的影响。

[0093] 图4为碱胁迫条件下YJ‑AD2菌剂处理后玉米幼苗的干重、鲜重和平均总根长的统计结果。A为干重、鲜重，B为总根长。

[0094] 图5为碱胁迫条件下YJ‑AD2菌剂对水稻幼苗全苗和地上部分的影响。

[0095] 图6为碱胁迫条件下YJ‑AD2菌剂对水稻幼苗的根部形态的影响。

[0096] 图7为碱胁迫条件下YJ‑AD2菌剂处理后水稻幼苗的干重、鲜重和平均总根长的统计结果。

[0097] 图8为碱胁迫条件下YJ‑AD2菌剂分泌IAA能力检测。A为定性结果；B为定量结果。

[0098] 图9为碱胁迫条件下YJ‑AD2菌剂ACC脱氨酶分泌能力检测。A为定性结果；B为定量结果。

[0099] 图10为碱胁迫条件下YJ‑AD2菌剂溶磷能力检测。A为定性结果；B为定量结果。

[0100] 图11为碱胁迫条件下YJ‑AD2菌剂固氮能力检测(定性结果)。

具体实施方式

[0101] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

[0102] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0103] LB液体培养基：向胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠30g中加入蒸馏水，调节pH至8.0，调节体积至1L，然后121℃灭菌15min，冷却使用。

[0104] LB固体培养基：向LB液体培养基中加入琼脂并使其浓度为15g/L；然后121℃灭菌15min。将冷却到约55℃的LB液体培养基倒入培养皿，自然冷却。

[0105] 野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia‑0亚型记载于如下文献中：Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.A genetic link between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsis thaliana.Nature Genetics.2004，36:167‑171。野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia‑0亚型在下文中简称拟南芥。

[0106] 实施例1、不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2的分离、鉴定与保藏[0107] 一、细菌YJ‑AD2的分离

[0108] 1、在45mL无菌蒸馏水中加入5g土壤样品(采自黑龙江省绥化市安达市经济技术开发区安发大道6号附近，盐碱地植物根际土壤)，搅拌15min，静止放置10min，然后取上清液‑11mL，加入盛有9mL无菌水中的无菌试管中充分混匀(此时稀释度记为10 )，然后从此试管中‑2 ‑3 ‑4
吸取1mL加入到另一盛有9mL无菌水的无菌试管中混合均匀，以此类推制成10 、10 、10 、‑5 ‑6 ‑7
10 、10 、10 不同稀释度的菌悬液。将各稀释度取0.1mL均匀涂布在LB固体培养基上，30℃恒温静置培养2‑3d。

[0109] 2、完成步骤1后，挑取LB固体培养基上的单菌落，反复纯化3次以上。将筛选到的一株细菌命名为细菌YJ‑AD2。

[0110] 二、细菌YJ‑AD2的鉴定

[0111] 1、形态学鉴定

[0112] (1)将细菌YJ‑AD2接种至LB固体培养基上，3天后观察单菌落的形态。结果表明，细菌YJ‑AD2的菌落圆形，边缘整齐，颜色为淡橘黄色，菌落不透明。

[0113] (2)细菌YJ‑AD2经染色后，鉴定为革兰氏阴性菌。

[0114] (3)采用高分辨率透射电镜观察细菌YJ‑AD2的形态。

[0115] 2、生理生化特性鉴定

[0116] (1)分泌H+能力检测

[0117] LB液体培养基中添加菌，摇床130r/min 12h,用分光光度计检测OD600值，取OD600值为1测量pH。每隔2h(0、2、4、6)测一下pH值。每组三个重复。鉴定结果为细菌YJ‑AD2产氢离子。

[0118] (2)耐NaCl、NaHCO3能力检测

[0119] LB液体培养基中添加NaHCO3模拟碱胁迫，NaHCO3浓度设置为0mM、3mM、6mM、9mM和12mM。添加NaCl模拟盐胁迫，NaCl浓度设置为0M、1.0M、1.4M、1.8M和2.2M。用分光光度计检测12h和24h时OD600值。鉴定结果为细菌YJ‑AD2耐NaCl、NaHCO3。

[0120] 3、16S rDNA序列同源性分析

[0121] 方法：

[0122] (1)细菌基因组提取

[0123] (2)特异引物扩增16SrDNA序列

[0124] (3)纯化PCR产物

[0125] (4)DNA测序获得16SrDNA序列

[0126] (5)与数据库中已知细菌比较获得样品种属信息

[0127] (6)选取近似菌种序列，构建系统发育树

[0128] 细菌YJ‑AD2的16S rDNA如SEQ ID No.1所示。

[0129] 利用Clustal X软件将SEQ ID No.1所示的双链DNA分子和GenBank中的序列进行比对。结果表明，细菌YJ‑AD2与Acinetobacter halotolerans strain R160的同源性最高，达到99.28％。

[0130] 三、保藏

[0131] 根据上述形态学、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化得到的细菌YJ‑AD2鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)。该菌株已于2021年10月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.23604。

[0132] 菌种保存：将不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2的单菌落接种至LB液体培养基，30℃培养16h，得到培养菌液。将1体积份培养菌液和1体积份80％(v/v)甘油水溶液混匀，‑80℃保存。

[0133] 实施例2、YJ‑AD2菌剂的制备

[0134] 1、将实施例1中‑80℃保存的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2菌种在LB固体培养基上活化。

[0135] 2、挑取LB固体培养基单菌落接种于装有100mL LB液体培养基的锥形瓶(规格为8
500mL)中，30℃、130r/min培养48h，得到OD600nm值约为1.0的菌液(2×10·CFU/mL)。该菌液即为制备的YJ‑AD2菌剂。

[0136] 实施例3、不动杆菌YJ‑AD2在提高拟南芥抗盐碱性中的应用

[0137] 培养皿的规格为10cm×10cm。

[0138] 一、培养基的制备

[0139] 碱固体培养基：向MS固体培养基加入NaHCO3至终浓度为1.5mM，调节pH值至8.0；然后121℃灭菌15min，将约55℃的培养基倒入培养皿(每个培养皿25mL)，自然冷却。

[0140] 碱+菌剂固体培养基：取装有碱固体培养基的培养皿，在其下部四分之一以下的培养基表面涂布0.1mL实施例2制备的YJ‑AD2菌剂，自然风干。

[0141] 二、YJ‑AD2菌剂对拟南芥盐碱胁迫抗性的影响

[0142] 培养条件为：22℃；12h光照/12h黑暗；光照强度为5000Lx。

[0143] 1、取拟南芥(野生型拟南芥Columbia‑0亚型)种子，用2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液灭菌10min，然后用灭菌水清洗三次。

[0144] 2、完成步骤1后，将拟南芥种子播种于固体培养基(碱固体培养基、碱+菌剂固体培养基)，4℃春化三天。需要注意的是，种子播种时不与菌剂直接接触，即播种于装有固体培养基的培养皿的四分之一以上部分，后续竖直培养后，拟南芥根部生长至已涂布菌剂的培养基处(本实验研究菌剂的分泌物对拟南芥根部生长的影响)0。

[0145] 3、将完成步骤2的固体培养基竖直培养7天，观察拟南芥的生长状态。

[0146] 拟南芥的生长状态见图1(左侧为碱固体培养基，右侧为碱+菌剂固体培养基)。

[0147] 4、将完成步骤2的固体培养基竖直培养12天，统计拟南芥幼苗的主根长(实验重复三次取平均值，每次使用拟南芥种子为80粒)。

[0148] 统计结果见表1。

[0149] 表1、拟南芥主根长统计结果

[0150]固体培养基的类型 平均主根长(cm)
碱固体培养基 0.81
碱+菌剂固体培养基 7.49

[0151] 结果表明，盐碱胁迫条件下，涂布YJ‑AD2菌剂的固体培养基上拟南芥幼苗的平均主根长显著高于对应的未涂布YJ‑AD2菌剂的固体培养基(P<0.05)。由此可见，不动杆菌YJ‑AD2可以提高拟南芥的抗盐碱性。

[0152] 实施例4、不动杆菌YJ‑AD2在提高玉米抗盐碱胁迫中的应用

[0153] 琼脂固体培养基：将5g琼脂粉溶于500mL蒸馏水，121℃灭菌15min。将约55℃琼脂培养基倒入培养皿，自然冷却。

[0154] 碱液(100mM)：将5.2995g Na2CO3和4.2g NaHCO3溶于500mL去离子水，调节pH值为10.0，备用。

[0155] 培养条件：28℃；12h光照/12h黑暗；光照强度为5000Lx。

[0156] 1、取120粒玉米自交系B73种子，先用70％(v/v)乙醇水溶液灭菌5min，灭菌水清洗1次；再用2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液灭菌15min，灭菌水清洗5次。

[0157] 2、将玉米种子播种于琼脂固体培养基，竖直培养7天，得到幼苗。

[0158] 3、将幼苗移栽至装有营养土的盆中(每盆3棵)，得到40盆玉米幼苗共120棵。

[0159] 4、取20盆玉米幼苗，每周浇灌一次碱液，每次浇灌300mL。取另外20盆玉米幼苗，每周浇灌一次去离子水，每次浇灌300mL。共浇灌6周。

[0160] 5、将浇灌碱液的20盆玉米幼苗随机分为碱液对照组和碱液菌剂组两组，每组10盆。将浇灌去离子水的20盆玉米幼苗随机分为水对照组和水菌剂组两组，每组10盆。实验如下：

[0161] 对碱液菌剂组每隔3天向每株玉米幼苗根部滴加50μL实施例2制备的YJ‑AD2菌剂，培养42天；对碱液对照组不施加菌剂，同等条件培养42天。

[0162] 对水菌剂组每隔3天向每株玉米幼苗根部滴加50μL实施例2制备的YJ‑AD2菌剂，培养42天；对水对照组不施加菌剂，同等条件培养42天。

[0163] 6、观察分析各组玉米生长发育的表型，并使用WinRHIZO根系扫描分析仪记录各组玉米幼苗根系形态。

[0164] 玉米幼苗地上部分和全苗的表型见图2(1为水处理组水菌剂组；2为水处理组全苗水对照组；3为碱液处理组全苗碱液对照组；4为碱液处理组全苗碱液菌剂组)。玉米根部形态见图3(1为水菌剂组，2为水对照组，3为碱液对照组，4为碱液菌剂组)。

[0165] 从图2可以看出，在碱液(100mM)和水处理条件下，均为YJ‑AD2菌剂组玉米幼苗株高更高、叶片长度更长、叶片总表面积更大。从图3可以看出，在碱液(100mM)和水处理条件下，均为YJ‑AD2菌剂组玉米幼苗总根长更长。

[0166] 7、碱胁迫条件下YJ‑AD2菌剂处理42天对各株玉米幼苗的干重、鲜重和总根长进行统计。

[0167] 结果见表2和图4。水处理条件下，施加YJ‑AD2菌剂和不滴加YJ‑AD2菌剂的玉米幼苗的干重、鲜重和总根长有较小差异(P<0.05)；碱胁迫条件下，施加YJ‑AD2菌剂的玉米幼苗的干重、鲜重和总根长均显著高于未施加YJ‑AD2菌剂的玉米幼苗(P<0.05)。由此可见，不动杆菌YJ‑AD2能够提高玉米的抗碱胁迫能力。

[0168] 表2、玉米幼苗的干重、鲜重和总根长统计结果

[0169]   平均干重(g) 平均鲜重(g) 平均总根长(cm)碱液对照组 4.80 18.37 122.23
碱液菌剂组 6.50 23.53 139.44
水对照组 5.06 20.38 130.81
水菌剂组 5.56 21.62 133.48

[0170] 实施例5、不动杆菌YJ‑AD2在提高水稻抗碱胁迫中的应用

[0171] 培养条件：28℃；12h光照/12h黑暗；光照强度为5000Lx。

[0172] 碱液(50mM)：将5.3g Na2CO3和4.2g NaHCO3溶于1000mL去离子水，调节pH值为10.0，备用。

[0173] 1、将120粒水稻品种日本晴种子放入培养皿，加入少量水，然后置于37℃恒温培养箱培养至种子发出芽及短根。

[0174] 2、将发芽的水稻幼苗移栽至装有营养土的盆中(每盆3棵)，得到40盆水稻幼苗共120棵。

[0175] 3、取20盆水稻幼苗，每周浇灌一次碱液，每次浇灌300mL。另外20盆水稻幼苗，每周浇灌一次去离子水，每次浇灌300mL。共浇灌6周。

[0176] 4、将浇灌碱液的20盆水稻幼苗随机分为碱液对照组和碱液菌剂组两组，每组10盆。将浇灌去离子水的20盆水稻幼苗随机分为水对照组和水菌剂组两组，每组10盆。实验如下：

[0177] 对碱液菌剂组每隔3天向每株水稻幼苗根部滴加50μL实施例2制备的YJ‑AD2菌剂，培养42天；对碱液对照组不施加菌剂，同等条件培养42天。

[0178] 对水菌剂组每隔3天向每株水稻幼苗根部滴加50μL实施例2制备的YJ‑AD2菌剂，培养42天；对水对照组不施加菌剂，同等条件培养42天。

[0179] 5、观察分析各组水稻生长发育的表型，并使用WinRHIZO根系扫描分析仪记录各组水稻幼苗根系形态。

[0180] 水稻幼苗地上部分和全苗的表型见图5(1为水处理组全苗水对照组；2为水处理组水菌剂组；3为碱液处理组全苗碱液对照组；4为碱液处理组全苗碱液菌剂组)。水稻根部形态见图6(1为水对照组，2为水菌剂组，3为碱液对照组，4为碱液菌剂组)。

[0181] 从图5可以看出，在碱液(50mM)和水处理条件下，均为YJ‑AD2菌剂组水稻幼苗株高更高、叶片长度更长、叶片总表面积更大；在碱液(50mM)条件下，YJ‑AD2菌剂组水稻幼苗的枯萎程度大大降低。从图6可以看出，在碱液(50mM)和水处理条件下，均为YJ‑AD2菌剂组水稻幼苗总根长更长。

[0182] 7、碱胁迫条件下YJ‑AD2菌剂处理42天对各株水稻幼苗的干重、鲜重和总根长进行统计。

[0183] 结果见表3和图7(A为干重、鲜重，B为总根长)。

[0184] 水处理条件下，施加YJ‑AD2菌剂和未施加YJ‑AD2菌剂的水稻幼苗的干重、鲜重和总根长均有显著差异(P<0.05)；碱胁迫条件下，施加YJ‑AD2菌剂的水稻幼苗的干重、鲜重和总根长均显著高于未施加YJ‑AD2菌剂的水稻幼苗(P<0.05)。由此可见，不动杆菌YJ‑AD2能够提高水稻的抗盐碱性碱胁迫能力。

[0185] 表3、水稻幼苗的干重、鲜重和总根长统计结果

[0186]   平均干重(g) 平均鲜重(g) 平均总根长(cm)碱液对照组 0.69 1.80 2.31
碱液菌剂组 3.19 7.89 31.72
水对照组 7.07 13.72 120.35
水菌剂组 13.11 27.96 201.58

[0187] 实施例6、不动杆菌YJ‑AD2在促生特性，分泌IAA能力的分析

[0188] Salkowski溶液(250mL)：H2SO4 150mL，0.5M FeCl3 37.5mL。

[0189] 本实验，将分离纯化出的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2菌株接种于1mL含200mg/L的L‑色氨酸(L‑tryptophan)的LB液体培养基中，设置3个重复。在30℃，180r/min培养2d后取200μl菌悬液到48孔板上，加入800μl的Salkowski显色液，并以加入200μl未接菌的LB液体培养基与800μl显色液为对照。室温避光放置20min后，颜色变粉红为阳性，表明能分泌IAA，颜色越深分泌强度越大。

[0190] 结果见图8中A(左侧为对照组，右侧为YJ‑AD2)。

[0191] 通过Salkowski比色反应法检测，YJ‑AD2具有分泌生长素的能力，进一步以IAA(吲2
哚‑3‑乙酸)为标准样，测得IAA标准曲线方程为：y＝0.0213x+0.002(R＝0.9987)。最终侧的YJ‑AD2产生生长素的能力为11.33μg/mL，见图8中B。

[0192] 实施例7、不动杆菌YJ‑AD2在促生特性，分泌ACC脱氨酶能力的分析[0193] DF培养基(1L)：组分a 0.1mL，组分b 0.1mL，KH2PO4 4.0g，Na2HPO4 6.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖2.0g，50％D‑葡糖酸溶液(上海源叶公司，货号是s11155)4mL，柠檬酸
2.0g，(NH4)2SO4 2.0g，余量为水，pH7.0‑7.2。

[0194] 其中，组分a(100mL)：H3BO3 10mg，MnSO4·H2O 11.19mg，ZnSO4·7H2O 124.6mg，CuSO4·5H2O 78.22mg，MoO3 10mg，余量为水。

[0195] 组分b(10mL)：FeSO4·7H2O 100mg，余量为水。

[0196] ADF培养基(1L)：将DF培养基中的(NH4)2SO4替换成0.5M 1‑氨基环丙烷基‑1‑羧酸(ACC)。

[0197] 将筛选出的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2菌株活化后，接种在DF固体培养基(在上述DF液体培养基基础上增加了10％琼脂)上，培养3‑4d后将菌株转接到ADF固体培养基(在上述ADF液体培养基基础上增加了10％琼脂)上，将平板放置28℃培养箱中倒置培养，观察菌株是否生长。

[0198] 高浓度的乙烯会抑制植物生长。而有微生物含有ACC脱氨酶，可以抑制乙烯前体物质α‑丁酮酸的产生，从而降低乙烯的生成，减少了其对植物生长的抑制作用。为检测不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2是否具有ACC脱氨酶活性，将不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2接种在只有ACC作为氮素唯一来源的ADF培养基上。如果不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2能在ADF培养基上生长说明细菌能产生ACC酶。如果不能生长，证明不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2不具有产生ACC脱氨酶的能力。

[0199] 实验结果见图9中A。结果说明YJ‑AD2能产生ACC脱氨酶。进一步检测了YJ‑AD2的2
ACC脱氨酶活性，以α‑丁酮酸为标准样品，测得标准曲线方程为：y＝3.4612x+0.0124(R ＝
0.9988)，YJ‑AD2的ACC脱氨酶活性为0.208U/mg，见图9中B。

[0200] 实施例8、不动杆菌YJ‑AD2在促生特性，溶磷能力的分析

[0201] PKO培养基(1L)：葡萄糖10.0g，磷酸三钙5.0g，氯化镁5g，硫酸铵0.1g，氯化钾0.2g，硫酸镁0.25g，琼脂17g，余量为水，pH7.0。

[0202] 土壤中的有机磷和无机磷对植物生长有关键作用。在碱性土壤中的无机磷主要为Ca3(PO4)2，其不能直接被植物吸收和利用，限制了植物的生长发育。具有解磷作用的细菌可以分泌有机酸来溶解细菌外部环境难溶性的含磷物质，通过不同的机制转化为植物可利用的含磷物质。如果细菌具有解磷能力，细菌培养在PKO培养基(含有难溶性磷酸钙)上一段时间后细菌周围会出现一圈透明圈。

[0203] 在此实验中，将不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2接种在PKO培养基上，发现不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2具有溶磷的特性，见图10中A。用溶磷圈直径/菌落直径来评价细菌的解磷能力。YJ‑AD2在PKO培养基上培养72h后，测量溶磷圈直径细菌生长直径后，得到其解磷能力为1.843。为进一步检测YJ‑AD2的解磷能力，用钼锑抗比色法进行了2
定量检测。以磷标准液为标准样，得到标准曲线，其方程为：y＝0.7081x+0.0081(R ＝
0.9988)。YJ‑AD2的解磷能力为209.81mg/L，见图10中B。

[0204] 实施例9、不动杆菌YJ‑AD2在促生特性，固氮能力的分析

[0205] Ashby培养基(1L)：KH2PO4 0.2g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2SO4·2H2O 0.2g，CaCO3 5g，葡萄糖5g，甘露醇5g，余量为水，pH7.0。

[0206] 将筛选出的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2菌株点种在Ashby固体培养基(在上述Ashby液体培养基基础上增加了10％琼脂)上，设置重复3次，放置在28℃培养箱中倒置培养，观察菌株是否生长，并产生透明圈。

[0207] 在此实验中，不动杆菌(Acinetobacter sp.)YJ‑AD2具有固氮的特性，见图11。

[0208] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。