一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂及方法

摘要

本发明涉及一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂及方法，包括分别由核苷酸衍生出的四种均具有碱基互补配对能力的核苷酸衍生物，四种化合物的核苷酸3′位置处的羟基均被保护基团保护，其中化合物1携带有荧光基团，化合物2不能发岀荧光信号但携带有可反应性基团，与可反应性荧光基团发生连接反应并发岀荧光信号，或化合物2能够发岀荧光信号，但携带有与化合物1不同的能断裂移除的可断裂链荧光基团，化合物3是携带有pH值敏感荧光基团的在不同pH值下能发出和化合物1相同的或不同的荧光信号或不能发出荧光信号，化合物4不带有荧光基团；同时还公开了该利用该试剂进行基因测序的方法。

权利要求

1.一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂，其特征在于：包括化合物1、化合物2、化合物3和化合物4；所述化合物1、化合物2、化合物3和化合物4是分别由核苷酸A、(T/U)、C和G衍生出的四种不同的均具有碱基互补配对能力的核苷酸衍生物，四种化合物的核苷酸3′位置处的羟基均被保护基团保护，且保护基团能够断裂重新将3′位置处的羟基裸露出来，其中：

化合物1是能发出荧光信号的携带有荧光基团的核苷酸衍生物；

化合物2是不能发岀荧光信号的但携带有能发生连接反应的可反应性基团的核苷酸衍生物，所述可反应性基团能与可反应性荧光基团发生连接反应后能够发岀与化合物1相同的荧光信号；或者化合物2是能够发岀与化合物1相同的荧光信号，但携带有与化合物1不同的能断裂移除的可断裂链荧光基团的核苷酸衍生物，所述可断裂链荧光基团的断裂移除对化合物1没有影响；

化合物3是携带有pH值敏感荧光基团的核苷酸衍生物，其在pH值大于7.5时不能发岀荧光信号或发出的荧光信号与化合物1发出的荧光信号不同，而在pH值小于6.8时能发出和化合物1和化合物2相同的荧光信号，所述pH值敏感荧光基团的结构与化合物1中的荧光基团的结构不同；

化合物4是不能发岀荧光信号不带有荧光基团的核苷酸衍生物；

所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4是各自独立地具有式(I)或式(II)的化合物，其中；B代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C、G中任意一种；

R1各自独立地选自氢、单磷酸基团、二磷酸基团、三磷酸基团、四磷酸基团；

R2各自独立地为能够进行正交切割反应的可反应性基团；

R3各自独立地选自‑H或‑OH；

R4各自独立地为能够进行正交切割反应的可反应性基团；

L1,L2各自独立地为连接基团或不存在；

R5各自独立地为能够发岀荧光信号的pH值敏感荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应性基团；

所述pH值敏感荧光基团是包括如下任意一种结构式的化合物：

其中：X为卤素，各自独立地选自氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)；

R6各自独立地选自氢、C1‑C10饱和烷基、C1‑C10饱和烷基链羧基、C1‑C10饱和烷基链炔基、C1‑C10烷基链氨基、C1‑C10烷基链叠氮基、C1‑C10烷基链巯基、C1‑C10烷基链马来酰亚胺、C1‑C10烷基链磺酸基、聚乙二醇羧基、聚乙二醇链炔基、聚乙二醇链氨基、聚乙二醇叠氮、聚乙二醇巯基、聚乙二醇马来酰亚胺；

R7各自独立地选自氢，C1‑C6饱和烷基；

环A和环B各自独立地选自具有式(Ⅵ)，(Ⅶ)，(Ⅷ)，(Ⅸ)的杂环基团，

其中；R8，R9和R12各自独立地选自氢、C1‑C10饱和烷基、C1‑C10饱和烷基链羧基、C1‑C10饱和烷基链炔基、C1‑C10烷基链氨基、C1‑C10烷基链叠氮基、C1‑C10烷基链巯基、C1‑C10烷基链马来酰亚胺、C1‑C10烷基链磺酸基、聚乙二醇羧基、聚乙二醇链炔基、聚乙二醇链氨基、聚乙二醇叠氮、聚乙二醇巯基、聚乙二醇马来酰亚胺；

R10和R11各自独立地选自氢，磺酸基；

所述可反应性基团是如下结构中的任意一种：

叠氮基团、

地高辛；

所述可反应性荧光基团是携带有荧光基团的与可反应性基团形成互补的互补基团，其与可反应性基团能进行正交连接反应，是如下结构中的任意一种：叠氮基团、

水杨基异羟脂酸基、链霉亲和素、地高辛抗体；

所述荧光基团是CY3、CY5、CY5.5、AF488、ATTO 495、ATTO532、AF532、AF568、ROX、R6G、ATTO700、AF700、AF680、AF660、ATTO680、ATTO655、AF647、ATTO647N、AF633、ATTO594、ATTO Rho101、ATTO 590、Quasar670、AF 594、ATTO Thio12、AF 555、FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、TAMRA、CAL Fluor Red 610、TEXASRED、CAL Fluor Red635、CY7、IF700、Quasar705中的任意一种荧光标记物；

所述可断裂链荧光基团是指响应于外部刺激而可切割的，并且通过切割将碱基和荧光基团或可反应性基团分离为不同实体的二价部分或一价部分的链基团，所述可断裂链荧光基团是如下结构中的任意一种：所述保护基团是能终止聚合酶的聚合作用并可被切割去除的基团，所述保护基团使得在聚合反应中有且只有一个碱基被并入生长的核酸链，且保护基团被去除后使得核苷酸衍生物3′位置处的羟基转变为游离的羟基，并能进行再次的引入一个碱基的聚合反应。

2.一种基于pH值敏感染料的基因测序方法，其特征在于：步骤如下：

S1，将待测序的核酸、核酸聚合酶、引物、权利要求1中所述的试剂混合形成的含有液相和固相反应体系的连接于支持物上的核酸双链体；

S2，在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将四种所述化合物中的一种并入生长的核酸链的3′端；

S3，检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物；

S4，1)，在pH值大于7.5时，化合物1和化合物2能够发出荧光信号，此时移除前一步骤反应体系中的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；然后进行处理，所述处理对化合物1、化合物4没有影响，但能使化合物2可断裂链荧光基团断裂移除荧光基团，同时调整pH值小于6.8，使化合物3发出与化合物1相同的荧光信号，并再次检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；

2)在pH值小于6.8时，化合物1和化合物3能够发出荧光信号，化合物2不能发出荧光信号，此时移除前一步骤的反应体系中的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；然后通过处理，同时调整pH值大于

7.5，所述处理对化合物1、化合物4没有影响，但能使化合物3不再发出荧光信号或发出的荧光信号与化合物1不同，同时使化合物2发生连接反应发岀与化合物1相同的荧光信号；并再次检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号。

3.根据权利要求2所述基于pH值敏感染料的基因测序方法，其特征在于：在S2步骤之前，还包括如下步骤：S1a，将步骤S1中形成的核酸双链体进行处理，所述处理能够去除并入生长的核酸链3′端的化合物中的保护基团，以及所述核酸双链体或生长的核酸链上的荧光基团。

说明书

一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂及方法

技术领域

[0001] 本发明涉及涉及核酸测序领域，尤其是一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂及方法。

背景技术

[0002] 基因测序技术是基因组学乃至生命科学研究的关键和基本技术之一，也是基本生物信息数据主要获取手段，是推动生物计算和生物信息学发展的原动力。自Sangger测序方法诞生以来，测序技术极大推动生命科学和医学的发展。最近十几年来，高通量的第二代DNA测序技术的成功应用再次推动了医学生命科学领域的飞速发展，并催生了“精准医疗”的产生。精准医疗是个系统工程，大数据是基础，基因测序是工具，只有软硬件有机结合，才可能实现技术上的精准医疗。但现有的基因测序中，测试成本高，测试装置复杂，需要多种激发光源，而且测试的质量和准确性不高。

发明内容

[0003] 针对现有的不足，本发明提供一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂及方法。

[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于pH值敏感染料的基因测序试剂：包括化合1、化合物2、化合物3和化合物4；所述化合1、化合物2、化合物3和化合物4是分别由核苷酸A、(T/U)、C和G衍生出的四种不同的均具有碱基互补配对能力的核苷酸衍生物，四种化合物的核苷酸3′位置处的羟基均被保护基团保护，且保护基团能够断裂重新将3′位置处的羟基裸露出来，其中：

[0005] 化合物1是能发出荧光信号的携带有荧光基团的核苷酸衍生物；

[0006] 化合物2是不能发岀荧光信号的但携带有能发生连接反应的可反应性基团的核苷酸衍生物，所述可反应性基团能与可反应性荧光基团发生连接反应后能够发岀与化合物1相同的荧光信号；或者化合物2是能够发岀与化合物1相同的荧光信号，但携带有与化合物1不同的能断裂移除的可断裂链荧光基团的核苷酸衍生物，所述可断裂链荧光基团的断裂移除对化合物1没有影响；

[0007] 化合物3是携带有pH值敏感荧光基团的核苷酸衍生物，其在pH值大于7.5时不能发岀荧光信号或发出的荧光信号与化合物1发出的荧光信号不同，而在pH值小于6.8时能发出和化合物1和化合物2相同的荧光信号，所述pH值敏感荧光基团的结构与化合物1中的荧光基团的结构不同；

[0008] 化合物4是不能发岀荧光信号不带有荧光基团的核苷酸衍生物。

[0009] 作为优选，所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4是各自独立地具有式(I)或式(II)的化合物，

[0010]

[0011] 其中；B代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C、G中任意一种；

[0012] R1各自独立地选自氢、单磷酸基团、二磷酸基团、三磷酸基团、四磷酸基团；

[0013] R2各自独立地为能够进行正交切割反应的可反应性基团；

[0014] R3各自独立地选自‑H或‑OH；

[0015] R4各自独立地为能够进行正交切割反应的可反应性基团；

[0016] L1,L2各自独立地为连接基团或不存在；

[0017] R5各自独立地为能够发岀荧光信号的pH值敏感荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应性基团。

[0018] 作为优选，所述pH值敏感荧光基团是包括如下任意一种结构式的化合物：

[0019]

[0020] 其中：X为卤素，各自独立地选自氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)；

[0021] R6各自独立地选自氢、C1‑C10饱和烷基、C1‑C10饱和烷基链羧基、C1‑C10饱和烷基链炔基、C1‑C10烷基链氨基、C1‑C10烷基链叠氮基、C1‑C10烷基链巯基、C1‑C10烷基链马来酰亚胺、C1‑C10烷基链磺酸基、聚乙二醇羧基、聚乙二醇链炔基、聚乙二醇链氨基、聚乙二醇叠氮、聚乙二醇巯基、聚乙二醇马来酰亚胺；

[0022] R7各自独立地选自氢，C1‑C6饱和烷基；

[0023] 环A和环B各自独立地选自具有式(Ⅵ)，(Ⅶ)，(Ⅷ)，(Ⅸ)的杂环基团，

[0024]

[0025] 其中；R8，R9和R12各自独立地选自氢、C1‑C10饱和烷基、C1‑C10饱和烷基链羧基、C1‑C10饱和烷基链炔基、C1‑C10烷基链氨基、C1‑C10烷基链叠氮基、C1‑C10烷基链巯基、C1‑C10烷基链马来酰亚胺、C1‑C10烷基链磺酸基、聚乙二醇羧基、聚乙二醇链炔基、聚乙二醇链氨基、聚乙二醇叠氮、聚乙二醇巯基、聚乙二醇马来酰亚胺；

[0026] R10和R11各自独立地选自氢，磺酸基。

[0027] 作为优选，所述荧光基团是CY3、CY5、CY5.5、AF488、ATTO 495、ATTO532、AF532、AF568、ROX、R6G、ATTO700、AF700、AF680、AF660、ATTO680、ATTO655、AF647、ATTO647N、AF633、ATTO594、ATTO Rho101、ATTO 590、Quasar670、AF 594、ATTO Thio12、AF 555、FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、TAMRA、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Fluor Red635、CY7、IF700、Quasar705中的任意一种荧光标记物。

[0028] 作为优选，所述可反应性基团是如下结构中的任意一种：

[0029] 叠氮基团、地
高辛；

[0030] 所述可反应性荧光基团是携带有荧光基团的与可反应性基团形成互补的互补基团，其与可反应性基团能进行正交连接反应，是如下结构中的任意一种：

[0031] 叠氮基团、水杨基
异羟脂酸基、链霉亲和素、地高辛抗体。

[0032] 作为优选，所述可断裂链荧光基团是指响应于外部刺激而可切割的，并且通过切割将碱基和荧光基团或可反应性基团分离为不同实体的二价部分或一价部分的链基团。

[0033] 作为优选，所述可断裂链荧光基团是如下结构中的任意一种：

[0034]

[0035] 作为优选，所述保护基团是能终止聚合酶的聚合作用并可被切割去除的基团，所述保护基团使得在聚合反应中有且只有一个碱基被并入生长的核酸链，且保护基团被去除后使得核苷酸衍生物3′位置处的羟基转变为游离的羟基，并能进行再次的引入一个碱基的聚合反应。

[0036] 一种基于pH值敏感染料的基因测序方法，步骤如下：

[0037] S1，将待测序的核酸、核酸聚合酶、引物、权力要求1‑7中任一项所述的试剂混合形成的含有液相和固相反应体系的连接于支持物上的核酸双链体；

[0038] S2，在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将四种所述化合物中的一种并入生长的核酸链的3′端；

[0039] S3，检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物；

[0040] S4，1)，在pH值大于7.5时，化合物1和化合物2能够发出荧光信号，此时移除前一步骤反应体系中的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；然后进行处理，所述处理对化合物1、化合物4没有影响，但能使化合物2可断裂链荧光基团断裂移除荧光基团，同时调整pH值小于6.8，使化合物3发出与化合物1相同的荧光信号，并再次检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；

[0041] 2)在pH值小于6.8时，化合物1和化合物3能够发出荧光信号，化合物2不能发出荧光信号，此时移除前一步骤的反应体系中的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号；然后通过处理，同时调整pH值大于7.5，所述处理对化合物1、化合物4没有影响，但能使化合物3不再发出荧光信号或发出的荧光信号与化合物1不同，同时使化合物2发生连接反应发岀与化合物1相同的荧光信号；并再次检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发岀所述荧光信号。

[0042] 作为优选，在S2步骤之前，还包括如下步骤：

[0043] S1a，将步骤S1中形成的核酸双链体进行处理，所述处理能够去除并入生长的核酸链3′端的化合物中的保护基团，以及所述核酸双链体或生长的核酸链上的荧光基团。

[0044] 本发明的有益效果在于：该发明使用一种pH值敏感荧光染料，或者在同一激发条件下能够发出同样荧光信号的两种荧光染料，且其中一种为pH值敏感荧光染料，采用单色荧光测序来区分4种碱基，测序装置仅需配备一个激发光源和一个相机就能完后基因测序，从而大大降低了测序装置的制造成本和体积，测试的质量和准确性都得以提高。而且在本发明的方法中，

[0045] 如果在步骤S2中，化合物1被并入生长的核酸链的3′端，那么，由于化合物1携带荧光基团，并且不受步骤S4中的1)和2)所述处理的影响，因此，在步骤S3和S4中将都能检测到荧光信号；

[0046] 如果在步骤S2中，化合物2被并入生长的核酸链的3′端，那么，(1)在化合物2本身携带与化合物1相同荧光基团但链基团不同时，在步骤S4中的1)的所述处理时，其可断裂链荧光基团被移除，因此，在步骤S3能检测到荧光信号，而在步骤S4检测不到荧光信号；(2)在化合物2本身不携带荧光基团，但携带可反应性基团时，在步骤S4中的2)的所述处理时，能够连接上荧光基团而发出与化合物1相同的荧光，因此，在步骤S3检测不到荧光信号，而在步骤S4能检测到荧光信号；

[0047] 如果在步骤S2中，化合物3被并入生长的核酸链的3′端，由于化合物3本身携带pH值敏感荧光基团，因此，(1)在步骤S4中pH值小于6.8的所述情况下，S3中能检测到荧光信号，经过调整pH值处理后，不在发出荧光信号，或发出的荧光信号与化合物1不同，因此特定滤光片下在步骤S4检测不到荧光信号；(2)在步骤S4中pH值大于7.5的所述情况时，S3中将不能检测到荧光信号，经过调整pH值处理后，能够发出荧光信号，在步骤S4就能检测到荧光信号；

[0048] 如果在步骤S2中，化合物4被并入生长的核酸链的3′端，那么，由于化合物4本身不携带荧光基团或者其他可反应性基团，也不受步骤S4中所述处理影响，因此，在步骤S3和S4中都将检测不到荧光信号，

[0049] 由此，根据步骤S3和S4的检测结果就能确定在步骤S2中并入生长的核酸链的3′端的化合物的类型，测序装置中仅需配备一个激发光源和一个相机就能完后基因测序，从而大大降低了测序装置的制造成本和体积，测试的质量和准确性都得以提高。

附图说明

[0050] 图1是本发明实施1的测试结果示意图；

[0051] 图2是本发明实施例2的测试结果示意图。

具体实施方式

[0052] 为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

[0053] 在本发明中，使用聚合酶来进行核苷酸聚合反应，"聚合酶"是指能够催化聚合反应(例如核苷酸单体的聚合以形成核酸聚合物)的任何天然或非天然存在的酶或其他催化剂，包括各种已知的核酸聚合酶，例如DNA聚合酶、DNA或RNA依赖性RNA聚合酶，以及逆转录酶，所述聚合酶能够以RNA或单链DNA为模板合成新的DNA链，可根据实际需要，选择合适的聚合酶来进行核苷酸聚合反应，也可以选择多种聚合酶的混合来使用。

[0054] 在本发明的方法中，步骤S2中所使用的四种化合物分别为核苷酸A、(T/U)、C和G的衍生物，意即A、T、C、G或者是A、U、C和G；"核苷酸"是指核苷‑5′‑多磷酸化合物或其结构类似物，具有碱基互补配对能力，其可以通过核酸聚合酶掺入以延伸生长的核酸链(例如引物)，可以在一个或多个碱基、糖或磷酸基团上对核苷酸进行修饰，核苷酸可以携带荧光基团，或可反应性基团。

[0055] 在本发明中，这四种核苷酸衍生物的3′位置处的羟基(‑0H)有保护基团，包括但不限于以下几种，如叠氮甲基 二硫基 烯丙基 甲氧基烷基、偶氮烷基、邻硝基苯 等。

[0056] 在本发明中，这四种核苷酸衍生物的碱基和荧光基团或可反应性基团之间由单个或多个相同或不同的可正交切割的链基团连接。所述可断裂链基团是指响应于外部刺激(例如，酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光照射、亲电/酸性试剂、有机金属和金属试剂或氧化剂)而可正交切割的(例如，可特异性切割)的链基团，通过切割将碱基和荧光基团或可反应性基团分离(例如解离、分解、断开、水解、该部分内的稳定键被断裂)为不同实体的二价部分或一价部分，在可断裂链基团被正交切割后，两个分离的实体(例如荧光染料、生物可反应性基团)不进一步反应并也不会形成新的正交的可断裂链基团。在正交切割中，使用的切割剂包括但不限于连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、三(3‑羟丙基)膦(THP)、三(2‑羧乙基)膦盐酸盐(TECP)二硫苏糖醇(DTT)，弱酸、Pd(0)或光照射(例如紫外线照射)等。

[0057] 在本发明中，所述可反应性基团是能够与另一可反应性基团(即与可反应性基团形成互补基团的携带有荧光基团的可反应性荧光基团)进行正交连接反应，(例如，共价地或非共价方式)的生物缀合物反应性基团，并在两个可反应性基团之间形成共价键，在这两个可反应性基团的不同化合物之间或同一化合物的不同部分之间产生共价连接。所述的正交连接反应的化学反应包括但不限于∶铜离子催化的叠氮与炔基的环加成反应，环张力驱动的叠氮与炔基的环加成反应，施陶丁格连接反应，狄尔斯—阿尔德反应，Suzuki交叉偶联反应，疏基基和疏基衍生物的二硫键形成反应，马来酰亚胺与巯基形成硫醚的反应，生物素与链霉亲和素之间的结合反应，地高辛与地高辛抗体间的结合反应等。

[0058] 在本发明中，荧光基团及其检测方法是公知的，可根据实际需要进行选择。也可以选择合适的激发光条件和光学滤波片使不同的化合物发出相同或实质相同的荧光信号。

[0059] 在本发明的方法中，使用荧光基团和pH值敏感荧光基团配合使用来实现单色荧光测序，所述的pH值敏感荧光基团与相应选择的非pH值敏感荧光基团结构不同，在酸性条件下(例如，pH值小于6.8)能发出相同的荧光信号或在合适的激发光条件和光学滤波片下发出的荧光信号实质上相同，在碱性条件下(例如，pH值大于7.5)，pH值敏感荧光基团丧失荧光性能，不能发出荧光信号或相同的激发光条件和光学滤波片下发出的荧光信号在实质上与选择的非pH值敏感荧光基团所发出的荧光信号不同而不被检测到，这样通过单色荧光测序就区分了4种碱基，测序装置仅需配备一个激发光源和一个相机就能完后基因测序，从而大大降低了测序装置的制造成本和体积，测试的质量和准确性都得以提高。

[0060] 实施例1：

[0061] 制备例1.dGTP的衍生物的制备由本公司实验人员参考文献(Guo et al.10.1073/pnas.0804023105)合成获得。该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，并通过ESI和MALDI‑TOF验证，其合成路线以及化合物结构如下所示：

[0062]

[0063] 制备例2.dCTP的衍生物的制备由本公司实验人员参考文献(Guo et al.10.1073/pnas.0804023105和US20130189743)合成获得。该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，并通过MALDI‑TOF验证，其合成路线以及化合物结构如下所示：

[0064] 阶段1∶

[0065]

[0066] 阶段2∶

[0067]

[0068] 制备例3.dTTP的衍生物的制备由本公司实验人员参考文献(Guo et al.10.1073/pnas.0804023105,US20130189743，EP0975595)合成获得。该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，并通过MALDI‑TOF验证，其合成路线以及化合物结构如下所示：

[0069] 阶段1∶

[0070]

[0071] 阶段2∶

[0072]

[0073] 制备例4.dATP的衍生物的制备由本公司实验人员参考文献(Guo et al.10.1073/pnas.0804023105,US20130189743)合成获得。该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，并通过MALDI‑TOF验证，其合成路线以及化合物结构如下所示：

[0074] 阶段1∶

[0075]

[0076] 阶段2∶

[0077]

[0078] 其所使用的测序方法涉及下述步骤∶

[0079] a)将待测核酸固定至芯片上，通过桥式扩增构建核酸分子，之后添加引物，引物为常规测序用的引物，并退火形成连接于芯片上的核酸双链体；

[0080] b)在允许聚合酶进行核昔酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核昔酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3′端；

[0081] c)使用冲洗缓冲液清理反应体系，加入扫描缓冲液，并保持pH值小于6.8，检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号，拍照，存储照片如图1中的扫描照片A所示；

[0082] d)清除扫描缓冲液，使用冲洗缓冲液清理反应体系，加入正交性携带荧光基团的互补基团试剂反应液，在本实施例中使用水溶性Cy5‑链霉亲和素,所述处理对G和C和T碱基衍生物没有影响，同时与Cy5‑链霉亲和素能够特异性的与A碱基衍生物上Biotin结合，从而将荧光基团Cy5引入A碱基衍生物，使其发出荧光信号；

[0083] e)使用冲洗缓冲液清理反应体系，加入扫描缓冲液，调整pH值大于7.5，弱碱性环境对G和C和A碱基衍生物没有影响，但是能够使T碱基衍生物上的pH敏感荧光基团(该荧光基团结构与Cy5相似，且在pH值小于6.8时发出的荧光信号与Cy5相同)丧失荧光信号，所述丧失荧光信号是指调整pH值后在相同的激发光源条件下检测不到荧光信号，激发波长为640nm；

[0084] f)检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号，拍照，存储照片，如图1中的扫描照片B所示；

[0085] g)清除扫描缓冲液，使用冲洗缓冲液清理反应体系，加入切割试剂(如THP，TECP)对芯片进行处理，所述处理能够去除并入生长的核酸链3′端的化合物中脱氧核糖的3’位置处的保护基团，以及所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团。在本实施例中，所使用的的切割试剂为THP，可以同时切除3′端和碱基上叠氮亚甲基；

[0086] h)清除切割缓冲液，使用冲洗缓冲液清理反应体系，然后重复进行步骤(c)‑(h)；

[0087] i)在每个循环测试步骤(c)‑(h)过程中两次拍照获得的照片之后，对同一个位置的信号进行比较，其中∶正方形区域表示该位置在图1的扫描照片A和扫描照片B中均有荧光信号，可根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定该位置的核酸分子簇引物链上引入的核苷酸衍生物的碱基为C，相应的，可确定该核酸分子簇的对应位置上的碱基为G，三角形区域表示该位置在图1的扫描照片A和扫描照片B中均无荧光信号，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定该位置的核酸分子簇引物链上引入的核苷酸衍生物的碱基为G，相应的，可确定该核酸分子簇的对应位置上的碱基为C；菱形区域表示该位置在图1的扫描照片A中有荧光信号，扫描照片B中无荧光信号，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定该位置的核酸分子簇引物链上引入的核苷酸衍生物的碱基为T，相应的，可确定该核酸分子簇的对应位置上的碱基为A；圆形区域表示该位置在图1的扫描照片A中无荧光信号，在扫描照片B中有荧光信号，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定该位置的核酸分子簇引物链上引入的核苷酸衍生物的碱基为A，相应的，可确定该核酸分子簇的对应位置上的碱基为T。

[0088] 实施例2：

[0089] 制备例1.dGTP的衍生物的制备由本公司实验人员参考文献(Guo et al.10.1073/pnas.0804023105)合成获得。该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，并通过ESI和MALDI‑TOF验证，其合成路线以及化合物结构如下所示：

[0090]

[0091] 制备例2.dCTP的衍生物的制备由本公司实验人员参考文献(Guo et al.10.1073/pnas.0804023105和US20130189743)合成获得。该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，并通过MALDI‑TOF验证，其合成路线以及化合物结构如下所示：

[0092] 阶段1∶

[0093]

[0094] 阶段2∶

[0095]

[0096] 其中Dye代表荧光基团；

[0097] 制备例3.dTTP的衍生物的制备由本公司实验人员参考文献(Guo et al.10.1073/pnas.0804023105,US20130189743，EP0975595)合成获得。该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，并通过MALDI‑TOF验证，其合成路线以及化合物结构如下所示：

[0098] 阶段1∶

[0099]

[0100] 阶段2∶

[0101]

[0102] 制备例4.dATP的衍生物的制备由本公司实验人员参考文献(Guo et al.10.1073/pnas.0804023105，US20130189743，US20160040225)合成获得。该化合物通过半制备HPLC纯化，得到纯度大于97％产物，并通过MALDI‑TOF验证，其合成路线以及化合物结构如下所示：

[0103] 阶段1∶

[0104]

[0105] 阶段2∶

[0106]

[0107] 其中，Dye代表荧光基团；

[0108] 其所使用的测序方法涉及下述步骤∶

[0109] j)将待测核酸固定至芯片上，通过桥式扩增构建核酸分子簇；

[0110] k)添加测序引物，引物为常规测序引物，并退火形成连接于芯片上的核酸双链体；

[0111] l)在允许聚合酶进行核昔酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核昔酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3′端；

[0112] m)使用冲洗缓冲液清理反应体系，加入扫描缓冲液，并保持PH值大于7.5，检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号，拍照，存储照片如图2的扫描照片A中所示；

[0113] n)清除扫描缓冲液，使用冲洗缓冲液清理反应体系，加入正交切割试剂使双硫键断裂去掉A碱基衍生物上的荧光基团,使其丧失荧光信号；所述处理对G和C和T碱基衍生物没有影响(或影响很小，不影响图像识别和信号区分)。

[0114] o)使用冲洗缓冲液清理反应体系，加入扫描缓冲液，调整pH值小于6.8，弱酸性环境对对G和C和A碱基衍生物没有影响，但是能够使T碱基上的PH敏感荧光基团发出荧光信号(该荧光基团结构与Cy5.5相似，在pH值大于7.5弱碱性环境下不发出荧光信号，而在pH值小于6.8和激发光源波长为660nm时发出的荧光信号与IF 700的荧光信号相近，在同一滤光片下能检测到实质相同的信号)；

[0115] p)检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号，拍照，存储照片，如图2的扫描照片B中所示；

[0116] q)清除扫描缓冲液，使用冲洗缓冲液清理反应体系，加入切割试剂(如THP，TECP)对芯片进行处理，所述处理能够去除并入生长的核酸链3′端的化合物中脱氧核糖的3’位置处的保护基团，以及所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团。在本实施例中，所使用的的切割试剂为THP，可以同时切除3′端和碱基上叠氮亚甲基；

[0117] r)清除切割缓冲液，使用冲洗缓冲液清理反应体系，然后重复进行步骤(c)‑(h)；

[0118] s)在每个循环测试步骤(c)‑(h)过程中两次拍照获得的图2的扫描照片A和扫描照片B之后，对同一个位置的信号进行比较，其中∶正方形区域表示该位置在图2的扫描照片A和扫描照片B中均有荧光信号，可根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定该位置的核酸分子簇引物链上引入的核苷酸衍生物的碱基为C，相应的，可确定该核酸分子簇的对应位置上的碱基为G；三角形区域表示该位置在图2的扫描照片A和扫描照片B中均无荧光信号，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定该位置的核酸分子簇引物链上引入的核苷酸衍生物的碱基为G，相应的，可确定该核酸分子簇的对应位置上的碱基为C；菱形区域表示该位置在图2的扫描照片A中有荧光信号，在扫描照片B中无荧光信号，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定该位置的核酸分子簇引物链上引入的核苷酸衍生物的碱基为A，相应的，可确定该核酸分子簇的对应位置上的碱基为T；圆形区域表示该位置在图2的扫描照片A中无荧光信号，在扫描照片B中有荧光信号，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定该位置的核酸分子簇引物链上引入的核苷酸衍生物的碱基为T，相应的，可确定该核酸分子簇的对应位置上的碱基为A。

[0119] 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。