一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法

摘要

本发明公开一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，包括精子基础稀释液、营养物质、抗氧化剂和抗冻保护剂；所述精子基础稀释液由cortland溶液和Hank’s溶液混合而成；所述营养物质包括蔗糖和海藻糖；所述抗氧化剂包括牛血清白蛋白、褪黑素和维生素E；所述抗冻保护剂为二甲亚砜。上述冷冻保存溶液应用于黄鳍鲷精子冷冻保存具有显著的优势，使冷冻保存后的黄鳍鲷精子的存活率和活力高。本发明还公开了一种黄鳍鲷精子的冷冻保存方法。

权利要求

1.一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，其特征是：包括精子基础稀释液、营养物质、抗氧化剂和抗冻保护剂；所述精子基础稀释液由Cortland溶液和Hank’s溶液按体积比2:1 1:3~混合而成；所述营养物质包括蔗糖和海藻糖；所述抗氧化剂包括牛血清白蛋白、褪黑素和维生素E；所述抗冻保护剂为二甲亚砜；

其中，以精子基础稀释液为基准，牛血清白蛋白的质量百分比添加量为1 3%，褪黑素的~添加量为1 100μmol/L，维生素E的添加量为1 10μmol/L；海藻糖的添加量为35.0 45.0g/L，~ ~ ~蔗糖的添加量为6 7g/L，二甲亚砜的质量百分比添加量为5% 15%。

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2.根据权利要求1所述的黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，其特征是：Cortland溶液和Hank’s溶液的体积比为1:2。

3.根据权利要求1或2所述的黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，其特征是：牛血清白蛋白的质量百分比添加量为2%，褪黑素的添加量为10μmol/L，维生素E的添加量为5μmol/L。

4.根据权利要求3所述的黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，其特征是：海藻糖和蔗糖的添加量分别为38.7g/L、6.85g/L；二甲亚砜的质量百分比添加量为10%。

5.一种利用权利要求1 4任一项所述冷冻保存溶液的黄鳍鲷精子冷冻保存方法，包括~以下步骤：

S1、精液采集：在黄鳍鲷繁殖季节，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，用干净毛巾擦拭鱼体泄殖孔周围的水分，轻轻按压腹部至泄殖孔流出乳白色精液，用离心管收集精液；

S2、配制所述的黄鳍鲷精子冷冻保存溶液；

S3、精子冻存：将黄鳍鲷精子冷冻保存溶液与精液在冻存管中混匀，将精液稀释；先将冻存管置于冰上孵育避光平衡10 30分钟，然后置于液氮表面上方冷冻停留10 30分钟，紧~ ~接着没入液氮中进行快速冻存处理，最后转移到‑150℃低温保存；

S4、精子复苏：精子冷冻一段时间后，将装有精子的冻存管从液氮中取出，然后立即于

37℃水浴中迅速解冻，将解冻后的精子置于0 4℃保存；

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S5、精子存活率检测：①将解冻后的精子用精子基础稀释液稀释，再用台盼蓝染色液对精子进行染色，放于显微镜下观察，评估精子的存活率；②将解冻后的精子用精子基础稀释溶液稀释，分别用碘化丙啶和4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚，在荧光显微镜下观察，统计精子的存活率；

S6、精子活力检测：取解冻后的精液，将精子激活后，取少量精子溶液在400倍倒置显微镜下观察，根据其运动状态评定精子活力。

6.权利要求1 4任一项所述的冷冻保存溶液在黄鳍鲷精子冷冻保存中的应用。

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说明书

一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液及冷冻保存方法。

背景技术

[0002] 黄鳍鲷隶属于鲷科，棘鲷属，是一种具有广盐度适应能力的海水鱼类，主要分布于东南亚近岸海鱼及河口湾；在繁殖季节，黄鳍鲷从生活的低盐度浅海区域向高盐度海域迁移进行产卵。黄鳍鲷是天然雌雄同体鱼类：1龄黄鳍鲷的性别为全雄，1龄雄性在繁殖期过后，其精巢逐渐退化，卵巢开始发育，发育至2龄的黄鳍鲷为雌雄同体，可以产生精子，但是卵子发育不成熟；部分3龄黄鳍鲷性完全反转为雌性，可以产生成熟的卵子。

[0003] 黄鳍鲷因肉质鲜美、营养价值较高、口感佳，颇受市场欢迎，并在我国东南沿海等地区被广泛养殖。近年来，黄鳍鲷养殖规模逐渐增大，养殖户对优质黄鳍鲷种苗需求增多，海捕黄鳍鲷种苗的数量难以满足需求，且其质量参差不齐，因此，培育优质黄鳍鲷新品种对提高养殖效率和社会经济效益具有重要意义。然而，如前文所述，黄鳍鲷亲本成熟时间长、亲本成熟时间不一致，造成黄鳍鲷优良品种培育较为困难。因此，冷冻保存黄鳍鲷优良种质资源，应用于人工繁殖，对于培育优良黄鳍鲷新品种具有重要意义。

[0004] 种质资源通常指胚胎、胚胎干细胞和种质细胞即生殖细胞，是物种或者种群繁衍的基础。在大多数有性生殖动物中，生殖细胞经过减数分裂产生精子和卵子，精卵结合后形成受精卵进而产生新的个体。大多数鱼类胚胎为离体发育，早期发育所需的能量来自于成熟卵子携带的大量卵黄和蛋白等营养物质物质。对于种质资源的保存，由于鱼类成熟的卵子较大不利于渗透和平衡，且其含有的大量卵黄和蛋白质等物质在冷冻和其他脂类物质难以被渗透和平衡，在冻融过程中容易失活，因此，鱼类卵子的冷冻保存较为困难。而精子在成熟过程中，会逐渐将大部分的细胞质内含物清除，成熟的精子具有体积小、数量多和内含物质相对简单等特点，因此精子是保存鱼类种质资源的优良选择。

[0005] 目前，低温冻存技术已初步应用于冻存一些海水鱼类的精子，如虹鳟、红鼓鱼和俄罗斯鲟鱼等。对于精子的低温冻存技术，精子冷冻保存液是冷冻保存精子的关键。现有技术中，上述鱼类的精子冷冻保存液会通过各种盐离子形成一个近似于生理状态的溶液环境，来短暂维持精子正常生理状态；并且上述的精子冷冻保存液中通过加入抗冻剂(甘油、DMSO和甲醇等)和非渗透性防冻剂或者营养物质(脱脂奶粉、卵黄、蛋白质和糖类等)来保护精子在温度剧烈变化过程中保持其内部结构的完整性和活力。

[0006] 关于黄鳍鲷精子，超微结构显示，其头部呈圆形或卵圆形，头部无明显的顶体结构，植入窝位于细胞核底端的中间，中心粒复合体位于植入窝内，其中近端中心粒位于植入窝的上段，基体位于植入窝的下段；袖套位于核后端，两侧分布有线粒体和囊泡；尾部细长，其主要结构是轴丝，轴丝为典型的“9+2”微管结构。

[0007] 作为一种天然由雄性向雌性性反转的海水鱼类，黄鳍鲷与哺乳动物以及一些其他海水鱼类在精子的生理结构上存在显著差异。首先，与哺乳动物相比，黄鳍鲷没有典型的顶体结构；与天然由雌性向雄性性反转的海水鱼类斜带石斑鱼相比，黄鳍鲷精子的质膜和核膜之间没有较大的空隙和少量的囊泡，也不像金鱼精子核膜和质膜之间存在着许多液泡；与鲤鱼精子的植入窝位于细胞核的一侧以及大黄鱼精子的植入窝位于细胞核背面不同，黄鳍鲷与日本鳗鲡、平鲷和黄颡鱼的精子植入窝类似，都是从核的后端向前端陷入核中形成“井”状；黄鳍鲷精子的细胞质膜与袖套膜不相连，不同于日本鳗鲡精子；黄鳍鲷精子尾部除轴丝外，未发现其他明显结构，不存在如平鲷、红鳍东方鲀等精子尾部的侧鳍结构，也没有大黄鱼精子尾部的篓状结构。如前文所述，黄鳍鲷与哺乳动物和许多鱼类的精子的生理结构存在明显差异，因此，现有的鱼类精子冷冻保存液对于黄鳍鲷精子不是最适宜的，不能保证其在冷冻保存后有较高存活率和活力。因此，需要针对黄鳍鲷精子的特性开发其精子冷冻保存液。

发明内容

[0008] 本发明的第一目的在于提供一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，在现有鱼类精子冷冻保存溶液的基础上进行优化和改良，保证黄鳍鲷精子在冷冻保存后的具有较高存活率和活力。

[0009] 本发明的第二目的在于提供一种利用所述冷冻保存溶液的黄鳍鲷精子冷冻保存方法。

[0010] 为实现上述的第一目的，本发明所采取的技术方案是：

[0011] 一种黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液，包括精子基础稀释液、营养物质、抗氧化剂和抗冻保护剂；所述精子基础稀释液由cortland溶液和Hank’s溶液混合而成，以确保黄鳍鲷精子获得较高的活力；所述营养物质包括蔗糖和海藻糖；所述抗氧化剂包括牛血清白蛋白(BSA)、褪黑素和维生素E；所述抗冻保护剂为二甲亚砜(DMSO)。

[0012] 具体地，上述的cortland溶液包括以下组分：氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、氯化钾、二水氯化钙、D‑葡萄糖和七水硫酸镁；Hank’s溶液包括以下组分：氯化钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、氯化钾、二水氯化钙、六水氯化镁、D‑葡萄糖和七水硫酸镁。

[0013] 发明人在研究现有的鱼类精子冷冻保存液对黄鳍鲷精子进行冷冻保存时发现，冷冻保存后黄鳍鲷精子的存活率不高，而且活力低；其中发现，在精液冷冻保存前的降温平衡阶段，因呼吸作用，精子会产生大量的活性氧而导致精子质膜损伤，影响黄鳍鲷精子冷冻保存效果。

[0014] 因此，本发明将抗氧化剂组分引入到黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液中；然后经过大量的实验，发明人获得牛血清白蛋白、褪黑素和维生素E的抗氧化剂组合，其用于黄鳍鲷精子的冷冻保存，显著提高了冷冻保存后黄鳍鲷精子的存活率和活性。

[0015] 其中，褪黑素是首次应用于鱼类的精子冷冻保存溶液中；此前，有研究表明，在公牛中，添加褪黑素可以显著提高直线运动精子的比例，提升精子活力，增加精浆总蛋白、白蛋白浓度和胆固醇，且降低天冬氨酸转氨酶活性；在仓鼠中，褪黑素能显著促进精子超活化，进而增强精子的体外受精能力；因此，在现有技术中褪黑素可以作为一种抗氧化剂用于冷冻保存液，保护哺乳动物精子。然而，与哺乳动物不同，大多数鱼类精子(包括黄鳍鲷精子)没有顶体结构，而且其精子头部内含物等生理结构也与哺乳动物精子有明显的差别，因此，哺乳动物精子的冷冻保存液不适用于鱼类精子的冻存。

[0016] 但是，发明人经过大量研究，将褪黑素添加到黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液中进行实验，证实了褪黑素能够应用于黄鳍鲷精子冷冻保存液中，并有效提高冷冻保存后黄鳍鲷精子的存活率和活性。

[0017] 而且，发明人也创新地将维生素E用于黄鳍鲷精子冷冻保存液中，其和褪黑素配合，显著提高冷冻保存后黄鳍鲷精子的存活率和活性。

[0018] 此外，发明人在研究黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液过程中，考虑到不同鱼类的精子最佳活力的pH值存在差异，如虹鳟的精子活力和受精率在pH值为9.0时最高，大比目鱼和花鲈的精子分别在pH值为7.5‑8.5和pH值为9.0时活力最高，斜带石斑鱼在pH为8.4时活力最好，而黄鳍鲷在pH值为7.8‑8.0时其精子的活力最好，因此发明人将冷冻保存溶液的pH值纳入为影响冻存的黄鳍鲷精子活力重要的因素之一。所以，基于黄鳍鲷精子活力在pH值为7.8‑8.0时最好，发明人在现有的鱼类精子冷冻保存溶液的基础上进行优化，选用了与黄鳍鲷精子活力最好的pH值范围较接近的cortland溶液和Hank’s溶液，并在实验中发现上述两种溶液混合作为精子基础稀释液用于黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液时，除了保证存活率以外，能够确保黄鳍鲷精子获得较高的活力。

[0019] 本发明优选方案为：

[0020] 所述精子基础稀释液中，Cortland溶液和Hank’s溶液的体积比为2:1～1:3；优选地，Cortland溶液和Hank’s溶液按照1:2的体积比混合。

[0021] 本发明的黄鳍鲷精子冷冻保存溶液中，以精子基础稀释液为基准，海藻糖的添加量为35.0～45.0g/L，蔗糖的添加量为6～7g/L；优选地，海藻糖和蔗糖的添加量分别为38.7g/L、6.85g/L。

[0022] 本发明的黄鳍鲷精子冷冻保存溶液中，以精子基础稀释液为基准，牛血清白蛋白(BSA)的质量百分比添加量为1～3％，褪黑素的添加量为1～100μmol/L，维生素E的添加量为1～10μmol/L；优选地，BSA的质量百分比添加量为2％，褪黑素的的添加量为10μmol/L，维生素E的的添加量为5μmol/L。

[0023] 本发明的黄鳍鲷精子冷冻保存溶液中，以精子基础稀释液为基准，二甲亚砜(DMSO)的质量百分比添加量为5％～15％；优选地，DMSO的质量百分比添加量为10％。

[0024] 本发明的黄鳍鲷精子冷冻保存溶液能够在黄鳍鲷精子冷冻保存技术中应用。

[0025] 为实现上述的第二目的，本发明所采取的技术方案是：

[0026] 一种利用所述冷冻保存溶液的黄鳍鲷精子冷冻保存方法，包括以下步骤：

[0027] S1、精液采集：在黄鳍鲷繁殖季节(10月份左右)，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，用干净毛巾擦拭鱼体泄殖孔周围的水分，轻轻按压腹部至泄殖孔流出乳白色精液，用1ml离心管收集精液；

[0028] S2、配制所述的黄鳍鲷精子冷冻保存溶液；

[0029] S3、精子冻存：将黄鳍鲷精子冷冻保存溶液与精液在冻存管中混匀，将精液稀释；先将冻存管置于冰上孵育避光平衡10～30分钟，然后置于液氮表面上方冷冻停留10～30分钟，紧接着没入液氮中进行快速冻存处理，最后转移到‑150℃低温保存；

[0030] S4、精子复苏：精子冷冻一段时间后，将装有精子的冻存管从液氮中取出，然后立即于37℃水浴中迅速解冻，将解冻后的精子置于0～4℃保存；

[0031] S5、精子存活率检测：①将解冻后的精子用精子基础稀释液稀释，再用台盼蓝染色液对精子进行染色，放于显微镜下观察，评估精子的存活率；②将解冻后的精子用精子基础稀释溶液稀释，分别用碘化丙啶(PI)和4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚(DAPI)，在荧光显微镜下观察，统计精子的存活率；

[0032] S6、精子活力检测：取解冻后的精液，将精子激活后，取少量精子溶液在400倍倒置显微镜下观察，根据其运动状态评定精子活力。

[0033] 在所述S1中，在采集精液后，为确定收集的新鲜精液的浓度和存活率，先将收集的精液用精子基础稀释溶液稀释10倍，进行细胞活力检测和细胞计数板计数；经过细胞计数8
和存活率检测后，选择精子存活率在98％以上和精子浓度在6×10个/ml以上的精液进行后续的操作。

[0034] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0035] 本发明提供的黄鳍鲷精子冷冻保存溶液应用于黄鳍鲷精子冷冻保存具有显著的优势，确保冷冻保存后的黄鳍鲷精子的存活率和活力在较高水平，即解冻后的精子存活率达到90％以上，活力达到49％以上；

[0036] 本发明通过改良精子基础稀释液，以及优化冷冻保存溶液中的抗氧化剂成分，尤其是添加褪黑素和维生素E，显著提高冷冻保存黄鳍鲷精子的存活率和活性；本发明的黄鳍鲷精子冷冻保存溶液可用于黄鳍鲷种质资源的保护以及大规模人工繁殖和生产，对黄鳍鲷种质资源保护和遗传改良具有重要意义。

具体实施方式

[0037] 以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。

[0038] 本发明具体实施例中黄鳍鲷精子的冷冻保存溶液的制备方法为：

[0039] S1、配制精子基础稀释液：分别按照比例配制cortland和Hank’s溶液，并调配好pH值，然后将cortland溶液和Hank’s溶液按照比例混合获得精子基础稀释液；

[0040] S2、依次将营养物质、抗氧化剂和抗冻剂按照质量浓度或者摩尔浓度加入到精子基础稀释液中，混匀，经0.22微米滤膜过滤便可得到无菌的冻存液，可以长期保存于4℃储备。

[0041] 其中cortland溶液和Hank’s溶液的组分配比分别为：

[0042] Cortland溶液：7.66g/L氯化钠、0.51g/L磷酸二氢钠、1.16g/L碳酸氢钠、0.38g/L氯化钾、0.31g/L二水氯化钙、1.00g/L D‑葡萄糖、0.26g/L七水硫酸镁，pH 7.0。

[0043] Hank’s溶液：8.07g/L氯化钠、0.048g/L磷酸氢二钠、0.35g/L碳酸氢钠、0.060g/L磷酸二氢钾、0.40g/L氯化钾、0.19g/L二水氯化钙、0.10g/L六水氯化镁、1.00g/L D‑葡萄糖和0.11g/L七水硫酸镁，pH 7.5。

[0044] 本发明在进行黄鳍鲷精子冷冻保存前进行的精液采集，具体操作为：

[0045] 在黄鳍鲷繁殖季节，即10月份，选择不同个体的精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，用干净毛巾擦拭鱼体泄殖孔周围的水分，轻轻按压腹部至泄殖孔流出乳白色精液，用1ml离心管收集10组精液。

[0046] 对于上述收集的精液，先确认其精子存活率和精子浓度，具体为：用精子基础稀释溶液(Cortland溶液：Hank’s溶液＝2:3)分别将10组精液稀释10倍，经过细胞活力检测和细8
胞计数板计数，确认每组精液的精子存活率在98％以上和精子浓度在6×10个/ml以上，再进行后续冷冻保存操作。

[0047] 实施例1

[0048] (1)黄鳍鲷精子冷冻保存溶液1的配制：将Cortland溶液和Hank’s溶液按照1:2体积比混合，配制成精子基础稀释溶液1；在精子基础稀释溶液1中，以其为基准，添加海藻糖38.7g/L，蔗糖6.85g/L，2％(wt％)BSA，10μmol/L褪黑素，5μmol/L维生素E，10％(wt％)DMSO，最终获得黄鳍鲷精子冷冻保存溶液1。

[0049] (2)精子冻存：将黄鳍鲷精子冷冻保存溶液1与10组精液分别以2:1的体积在冻存管中混匀，冰上孵育20分钟，转移到液氮上方4厘米处停留15分钟，然后将冻存管没入液氮中保存。

[0050] (3)精子解冻复苏：在冻存11个月之后，将装有精子的冻存管从‑150摄氏度冰箱中取出，然后立即于37℃水浴中迅速轻轻摇晃解冻，解冻后立刻置于冰上(0～4℃)避光保存。

[0051] (4)精子存活率检测：①将解冻后的精液用精子基础稀释溶液1稀释，用10微克/ml的碘化丙啶(PI)和10微克/ml的4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚(DAPI)，在荧光显微镜下观察，分别统计被PI着色发红色荧光的死亡精子和被DAPI着色发蓝色荧光的所有精子数量，从而计算活的精子比例。②将解冻后的精子用精子基础稀释溶液1稀释，在用1％的台盼蓝染色液与激活后的精子进行染色，放于显微镜下观察，再次评估精子的存活率。经过台盼蓝染色以及荧光观察，新鲜精子的存活率为99.2％，在黄鳍鲷精子冷冻保存溶液1中冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的存活率为(4010/4164，96.3％)，具体结果见表1。

[0052] (5)精子活力检测：取解冻后的精液，用等体积25‰的灭菌海水将精子激活，取少量精子溶液在400倍倒置显微镜下观察精子，根据其运动状态评定精子活力。活力评定：直线快速运动的精子占总精子的百分比。在黄鳍鲷精子冷冻保存溶液2中冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的活力为(431/745，57.8％)，具体结果见表1。

[0053] 实施例2

[0054] (1)黄鳍鲷精子冷冻保存溶液2的配制：将Cortland溶液和Hank’s溶液按照1:1体积比混合，配制成精子基础稀释溶液2。在精子基础稀释溶液1中，以其为基准，添加海藻糖35g/L，蔗糖6g/L，1％(wt％)BSA，1μmol/L褪黑素，1μmol/L维生素E，5％(wt％)DMSO，最终获得黄鳍鲷精子冷冻保存溶液2。

[0055] (2)精子冻存：将黄鳍鲷精子冷冻保存溶液2与采集的10组精子分别以2:1的体积在冻存管中混匀，冰上孵育20分钟，转移到液氮上方5厘米处停留15分钟，然后将冻存管没入液氮中保存。

[0056] (3)精子解冻复苏：在冻存11个月之后，将装有精子的冻存管从‑150摄氏度冰箱中取出，然后立即于37℃水浴中迅速轻轻摇晃解冻，解冻后立刻置于冰上(0～4℃)避光保存。

[0057] (4)精子存活率检测：①将解冻后的精液用精子基础稀释溶液2稀释，用10微克/ml的碘化丙啶(PI)和10微克/ml的4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚(DAPI)，在荧光显微镜下观察，分别统计被PI着色发红色荧光的死亡精子和被DAPI着色发蓝色荧光的所有精子数量，从而计算活的精子比例。②将解冻后的精子用精子基础稀释溶液2稀释，在用1％的台盼蓝染色液与激活后的精子进行染色，放于显微镜下观察，评估精子的存活率。经过台盼蓝染色以及荧光观察，新鲜精子的存活率为99.2％，在黄鳍鲷精子冷冻保存溶液2中冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的存活率为(3575/3924，91.2％)，具体结果见表1。

[0058] (5)精子活力检测：取解冻后的精液，用等体积25‰的灭菌海水将精子激活，取少量精子溶液在400倍倒置显微镜下观察精子，根据其运动状态评定精子活力。活力评定：直线快速运动的精子占总精子的百分比。在黄鳍鲷精子冷冻保存溶液2中冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的活力为(340/693，49.1％)，具体结果见表1。

[0059] 实施例3

[0060] (1)黄鳍鲷精子冷冻保存溶液3的配制：将Cortland溶液和Hank’s溶液按照1:3体积比混合，配制成精子基础稀释溶液3。在精子基础稀释溶液3中，以其为基准，添加海藻糖38.7g/L，蔗糖7g/L，2％(wt％)BSA，8μmol/L褪黑素，7μmol/L维生素E，8％(wt％)DMSO，最终获得黄鳍鲷精子冷冻保存溶液3。

[0061] (2)精子冻存：将黄鳍鲷精子冷冻保存溶液3与10组精子分别以2:1的体积在冻存管中混匀，冰上孵育20分钟，转移到液氮上方5厘米处停留15分钟，然后将冻存管没入液氮中保存。

[0062] (3)精子解冻复苏：在冻存11个月之后，将装有精子的冻存管从‑150摄氏度冰箱中取出，然后立即于37℃水浴中迅速轻轻摇晃解冻，解冻后立刻置于冰上(0～4℃)避光保存。

[0063] (4)精子存活率检测：①将解冻后的精液用精子基础稀释溶液3稀释，用10微克/ml的碘化丙啶(PI)和10微克/ml的4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚(DAPI)，在荧光显微镜下观察，分别统计被PI着色发红色荧光的死亡精子和被DAPI着色发蓝色荧光的所有精子数量，从而计算活的精子比例。②将解冻后的精子用基础稀释溶液稀释，在用1％的台盼蓝染色液与激活后的精子进行染色，放于显微镜下观察，评估精子的存活率。经过台盼蓝染色以及荧光观察，新鲜精子的存活率为99.2％，在黄鳍鲷精子冷冻保存溶液3中冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的存活率为(3924/4117，95.4％)，具体结果见表1。

[0064] (5)精子活力检测：取解冻后的精液，用等体积25‰的灭菌海水将精子激活，取少量精子溶液在400倍倒置显微镜下观察精子，根据其运动状态评定精子活力。活力评定：直线快速运动的精子占总精子的百分比。在黄鳍鲷精子冷冻保存溶液3中冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的活力为(398/721，55.2％)，具体结果见表1。

[0065] 实施例4

[0066] (1)黄鳍鲷精子冷冻保存溶液4的配制：将Cortland溶液和Hank’s溶液按照1:2混合配制成精子基础稀释溶液4。在精子基础稀释溶液4中，以其为基准，添加海藻糖45g/L，蔗糖6.85g/L，3％(wt％)BSA，100μmol/L褪黑素，10μmol/L维生素E，10％(wt％)DMSO，最终获得黄鳍鲷精子冷冻保存溶液4。

[0067] (2)精子冻存：将黄鳍鲷精子冷冻保存溶液4与10组精子分别以2:1的体积在冻存管中混匀，冰上孵育20分钟，转移到液氮上方4厘米处停留15分钟，然后将冻存管没入液氮中保存。

[0068] (3)精子解冻复苏：在冻存11个月之后，将装有精子的冻存管从‑150摄氏度冰箱中取出，然后立即于37℃水浴中迅速轻轻摇晃解冻，解冻后立刻置于冰上(0～4℃)避光保存。

[0069] (4)精子存活率检测：①将解冻后的精液用精子基础稀释溶液4稀释，用10微克/ml的碘化丙啶(PI)和10微克/ml的4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚(DAPI)，在荧光显微镜下观察，分别统计被PI着色发红色荧光的死亡精子和被DAPI着色发蓝色荧光的所有精子数量，从而计算活的精子比例。②将解冻后的精子用精子基础稀释溶液4稀释，在用1％的台盼蓝染色液与激活后的精子进行染色，放于显微镜下观察，评估精子的存活率。经过台盼蓝染色以及荧光观察，新鲜精子的存活率为99.2％，在黄鳍鲷精子冷冻保存溶液4中冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的存活率为(3703/3965，93.4％)，具体结果见表1。

[0070] (5)精子活力检测：取解冻后的精液，用等体积25‰的灭菌海水将精子激活，取少量精子溶液在400倍倒置显微镜下观察精子，根据其运动状态评定精子活力。活力评定：直线快速运动的精子占总精子的百分比。在黄鳍鲷精子冷冻保存溶液4中冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的活力为(364/685，53.2％)，具体结果见表1。

[0071] 对比例1

[0072] (1)对照冷冻保存溶液1的配制：将Cortland溶液和Hank’s溶液按照1:2体积比混合配制成对照精子基础稀释溶液1。在对照精子基础稀释溶液1中，以其为基准，中添加海藻糖38.7g/L，蔗糖6.85g/L，2％(wt％)BSA，10％(wt％)DMSO，最终获得对照冷冻保存溶液1。

[0073] (2)精子冻存：将对照冷冻保存溶液1与10组精子分别以2:1的体积在冻存管中混匀，冰上孵育20分钟，转移到液氮上方4厘米处停留15分钟，然后将冻存管没入液氮中保存。

[0074] (3)精子解冻复苏：在冻存11个月之后，将装有精子的冻存管从‑150摄氏度冰箱中取出，然后立即于37℃水浴中迅速轻轻摇晃解冻，解冻后立刻置于冰上(0～4℃)避光保存。

[0075] (4)精子存活率检测：①将解冻后的精液用对照精子基础稀释溶液1稀释，用10微克/ml的碘化丙啶(PI)和10微克/ml的4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚(DAPI)，在荧光显微镜下观察，分别统计被PI着色发红色荧光的死亡精子和被DAPI着色发蓝色荧光的所有精子数量，从而计算活的精子比例。②将解冻后的精子用对照精子基础稀释溶液1稀释，在用1％的台盼蓝染色液与激活后的精子进行染色，放于显微镜下观察，评估精子的存活率。经过台盼蓝染色以及荧光观察，新鲜精子的存活率为99.2％，在对照冷冻保存溶液1冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的存活率为(3577/4189，85.4％)，具体结果见表1。

[0076] (5)精子活力检测：取解冻后的精液，用等体积25‰的灭菌海水将精子激活，取少量精子溶液在400倍倒置显微镜下观察精子，根据其运动状态评定精子活力。活力评定：直线快速运动的精子占总精子的百分比。在对照冷冻保存溶液1冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的活力为(369/895，41.2％)，具体结果见表1。

[0077] 对比例2

[0078] (1)对照冷冻保存溶液2的配制：将Cortland溶液和Hank’s溶液按照1:2体积比混合配制成对照精子基础稀释溶液2。在对照精子基础稀释溶液2中，以其为基准，添加海藻糖38.7g/L，蔗糖6.85g/L，2％(wt％)BSA，5μmol/L维生素E，10％(wt％)DMSO，最终获得对照冷冻保存溶液2。

[0079] (2)精子冻存：将对照冷冻保存溶液2与10组精子分别以2:1的体积在冻存管中混匀，冰上孵育20分钟，转移到液氮上方4厘米处停留15分钟，然后将冻存管没入液氮中保存。

[0080] (3)精子解冻复苏：在冻存11个月之后，将装有精子的冻存管从‑150摄氏度冰箱中取出，然后立即于37℃水浴中迅速轻轻摇晃解冻，解冻后立刻置于冰上(0～4℃)避光保存。

[0081] (4)精子存活率检测：①将解冻后的精液用对照精子基础稀释溶液2稀释，用10微克/ml的碘化丙啶(PI)和10微克/ml的4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚(DAPI)，在荧光显微镜下观察，分别统计被PI着色发红色荧光的死亡精子和被DAPI着色发蓝色荧光的所有精子数量，从而计算活的精子比例。②将解冻后的精子用对照精子基础稀释溶液2稀释，在用1％的台盼蓝染色液与激活后的精子进行染色，放于显微镜下观察，评估精子的存活率。经过台盼蓝染色以及荧光观察，新鲜精子的存活率为99.2％，在对照冷冻保存溶液2冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的存活率为(3823/4325，88.4％)，具体结果见表1。

[0082] (5)精子活力检测：取解冻后的精液，用等体积25‰的灭菌海水将精子激活，取少量精子溶液在400倍倒置显微镜下观察精子，根据其运动状态评定精子活力。活力评定：直线快速运动的精子占总精子的百分比。在对照冷冻保存溶液2冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的活力为(342/724，47.2％)，具体结果见表1。

[0083] 对比例3

[0084] (1)对照冷冻保存溶液3的配制：将Cortland溶液和Hank’s溶液按照1:2体积比混合配制成对照精子基础稀释溶液3。在对照精子基础稀释溶液3中，以其为基准，添加海藻糖38.7g/L，蔗糖6.85g/L，5％(wt％)BSA，10％(wt％)DMSO，最终获得对照冷冻保存溶液3。

[0085] (2)精子冻存：将对照冷冻保存溶液3与10组精子分别以2:1的体积在冻存管中混匀，冰上孵育20分钟，转移到液氮上方4厘米处停留15分钟，然后将冻存管没入液氮中保存。

[0086] (3)精子解冻复苏：在冻存11个月之后，将装有精子的冻存管从‑150摄氏度冰箱中取出，然后立即于37℃水浴中迅速轻轻摇晃解冻，解冻后立刻置于冰上(0～4℃)避光保存。

[0087] (4)精子存活率检测：①将解冻后的精液用对照精子基础稀释溶液3稀释，用10微克/ml的碘化丙啶(PI)和10微克/ml的4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚(DAPI)，在荧光显微镜下观察，分别统计被PI着色发红色荧光的死亡精子和被DAPI着色发蓝色荧光的所有精子数量，从而计算活的精子比例。②将解冻后的精子用对照精子基础稀释溶液3稀释，在用1％的台盼蓝染色液与激活后的精子进行染色，放于显微镜下观察，评估精子的存活率。经过台盼蓝染色以及荧光观察，新鲜精子的存活率为99.2％，在对照冷冻保存溶液2冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的存活率为(4115/4769，86.3％)，具体结果见表1。

[0088] (5)精子活力检测：取解冻后的精液，用等体积25‰的灭菌海水将精子激活，取少量精子溶液在400倍倒置显微镜下观察精子，根据其运动状态评定精子活力。活力评定：直线快速运动的精子占总精子的百分比。在对照冷冻保存溶液3冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的活力为(334/758，44.1％)，具体结果见表1。

[0089] 对比例4

[0090] (1)对照冷冻保存溶液4的配制：将Cortland溶液和Hank’s溶液按照1:2体积比混合配制成对照精子基础稀释溶液4。在对照精子基础稀释溶液4中，以其为基准，添加海藻糖38.7g/L，蔗糖6.85g/L，4％(wt％)BSA，8μmol/L维生素E，10％(wt％)DMSO，最终获得对照冷冻保存溶液4。

[0091] (2)精子冻存：将对照冷冻保存溶液4与10组精子分别以2:1的体积在冻存管中混匀，冰上孵育20分钟，转移到液氮上方4厘米处停留15分钟，然后将冻存管没入液氮中保存。

[0092] (3)精子解冻复苏：在冻存11个月之后，将装有精子的冻存管从‑150摄氏度冰箱中取出，然后立即于37℃水浴中迅速轻轻摇晃解冻，解冻后立刻置于冰上(0～4℃)避光保存。

[0093] (4)精子存活率检测：①将解冻后的精液用对照精子基础稀释溶液4稀释，用10微克/ml的碘化丙啶(PI)和10微克/ml的4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚(DAPI)，在荧光显微镜下观察，分别统计被PI着色发红色荧光的死亡精子和被DAPI着色发蓝色荧光的所有精子数量，从而计算活的精子比例。②将解冻后的精子用对照精子基础稀释溶液4稀释，在用1％的台盼蓝染色液与激活后的精子进行染色，放于显微镜下观察，评估精子的存活率。经过台盼蓝染色以及荧光观察，新鲜精子的存活率为99.2％，在对照冷冻保存溶液4冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的存活率为(4557/5127，88.9％)，具体结果见表1。

[0094] (5)精子活力检测：取解冻后的精液，用等体积25‰的灭菌海水将精子激活，取少量精子溶液在400倍倒置显微镜下观察精子，根据其运动状态评定精子活力。活力评定：直线快速运动的精子占总精子的百分比。在对照冷冻保存溶液2冻存11个月后，10组黄鳍鲷精子的活力为(392/816，48.1％)，具体结果见表1。

[0095] 表1不同实施例和对比例中复苏后精子的存活率(％)和活力(％)的统计结果[0096]

[0097]

[0098] 由表1可知，实施例1～4中，黄鳍鲷精子在冷冻保存11个月后，其平均存活率均高于90％，平均活力均不低于49％，说明了本发明的黄鳍鲷精子冷冻保存溶液确保黄鳍鲷精子在冷冻保存后的存活率和活力；而且褪黑素的添加量为8～10μmol/L时，冻存后黄鳍鲷精子的存活率和活力最好，而褪黑素比例过低或过高，均不能达到最合适的效果。

[0099] 将实施例1和对比例1对比可知，本发明在黄鳍鲷精子冷冻保存液中加入了褪黑素和维生素E，使冷冻保存后的黄鳍鲷精子的平均存活率和平均活力提高了10％以上；将实施例1和对比例2对比可知，本发明在黄鳍鲷精子冷冻保存液中加入了褪黑素，使冷冻保存后的黄鳍鲷精子的平均存活率和平均活力显著提高，其中平均活力提高了10％以上。

[0100] 从对比例3可知，当冷冻保存液中不加入褪黑素和维生素E，即使将BSA的添加量成倍增大，黄鳍鲷精子的平均存活率和平均活力仍远低于实施例1；从对比例4可知，当冷冻保存液中不加入褪黑素，但添加大量的BSA和维生素E时，黄鳍鲷精子的平均存活率和平均活力仍低于实施例1～4。上述结果说明了本发明的牛血清白蛋白、褪黑素和维生素E的抗氧化剂组合，用于黄鳍鲷精子冷冻保存溶液，提高了黄鳍鲷精子在冷冻保存后的存活率和活力。

[0101] 实施例5

[0102] 不同比例cortland溶液和Hank’s溶液混合实验

[0103] 分别设置了不同cortland溶液和Hank’s溶液混合比例(按体积比混合)的精子基础稀释液：

[0104] 对照溶液1：100％cortland溶液，

[0105] 对照溶液2：100％Hank’s溶液，

[0106] 实验溶液1：cortland溶液和Hank’s溶液按照3:1混合，

[0107] 实验溶液2：cortland溶液和Hank’s溶液按照2:1混合，

[0108] 实验溶液3：cortland溶液和Hank’s溶液按照1:1混合，

[0109] 实验溶液4：cortland溶液和Hank’s溶液按照1:2混合，

[0110] 实验溶液5：cortland溶液和Hank’s溶液按照1:3混合，

[0111] 实验溶液6：cortland溶液和Hank’s溶液按照1:4混合。

[0112] 将新鲜收集的精子分别用上述不同精子基础稀释液稀释10倍，并分成3组，每组用等体积25‰的灭菌海水将其激活，然后在400倍倒置显微镜下观察，统计直线运动的精子比例，即其活力，结果见表2。

[0113] 从表2可知，与单一的cortland溶液或者Hank’s溶液相比，即对比溶液1和2，实验溶液2～5稀释后黄鳍鲷精子活力显著提升。即，将cortland溶液和Hank’s溶液按照混合体积比为2:1～1:3进行混合作为精子基础稀释液，能够使黄鳍鲷精子活力显著提升。

[0114] 表2不同精子基础稀释液稀释精子并激活后的精子活力(％)的统计结果[0115]

[0116] 本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。