HSP90抑制剂阻碍STAT3线粒体转运和治疗哮喘的新应用

摘要

本发明提供了HSP90抑制剂阻碍STAT3线粒体转运和治疗哮喘的新应用。具体而言，本发明提供了HSP90抑制剂在制备用于阻碍STAT3线粒体转运的制剂中的应用。本发明还提供了HSP90抑制剂在制备用于抑制2型天然淋巴样细胞的功能的制剂中的应用。本发明还提供了HSP90抑制剂在制备用于治疗哮喘或其相关疾病的药物中的应用。本发明还提供了以STAT3的线粒体转运为靶点在筛选和/或制备用于治疗哮喘或其相关疾病的药物中的应用。

权利要求

1.以STAT3的线粒体转运为靶点在筛选和/或制备用于治疗哮喘的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述哮喘包括急性哮喘、慢性哮喘中的一种或多种。

说明书

HSP90抑制剂阻碍STAT3线粒体转运和治疗哮喘的新应用

技术领域

[0001] 本发明是关于HSP90抑制剂的新应用，具体而言，本发明是关于HSP90抑制剂阻碍STAT3线粒体转运和治疗哮喘的新应用，属于医药技术领域。

背景技术

[0002] 哮喘是一种以支气管高反应性、可逆性气流阻塞和气道炎症为主要特征的异质性疾病，表现为反复发作的气喘、胸闷和咳嗽。它是全世界最常见的呼吸道疾病之一，尤其在许多发达国家，有5‑10％的人受到哮喘的影响，同时伴随着巨大的社会经济负担。在世界范围内，哮喘病例以约每十年50％的速度增长，根据世界卫生组织的调查数据，目前全世界估计有3亿人患有哮喘，到2025年，可能还会增加约1亿哮喘患者。因此，对于治疗哮喘的靶点和药物的寻找具有重要意义。

[0003] 通常来说，2型辅助性T(T helper 2，Th2)细胞及其相关的2型细胞因子在哮喘发病过程中发挥重要作用，越来越多的研究表明，2型天然淋巴样细胞(group 2innate lymphoid cells，ILC2s)也是哮喘发病机理中的关键因素。与慢性鼻窦炎相关的鼻息肉是最早发现ILC2s的人体组织之一。在这之后，越来越多的证据表明，哮喘患者的外周血和痰液中ILC2s比例升高，尤其是在具有嗜酸性粒细胞浸润的Th2型哮喘中，并且ILC2s表达IL‑5和IL‑13的水平与哮喘的严重程度呈正相关。接下来，通过采用各种动物实验，包括构建哮喘模型、基因靶向和过继回输等，ILC2s已经被证实在哮喘进程中发挥至关重要的作用。因此，靶向ILC2s将是治疗哮喘的有效手段之一。

[0004] 信号传导与转录激活因子(signal  transducer and  activator  of transcription，STAT)是具有信号转导和基因调控的功能的一类蛋白家族，并且是细胞发育、分化、增殖和凋亡等的关键调节因子。STAT蛋白家族共有7各成员，分别是STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6。STAT蛋白在很长一段时间都被认为是由经典的细胞因子和生长因子及其受体偶联的JAK蛋白家族所激活。在这种激活模式下，STAT蛋白的酪氨酸残基被磷酸化，从而形成同源或异源二聚体，进入细胞核中与靶基因特殊位点结合，最终调控转录(经典的STAT3激活)。然而，最近越来越多的证据表明，STAT蛋白的功能并不局限于其经典的调控作用，即核易位后作为转录因子发挥功能。例如，STAT3既可以被JAK介导的途径在酪氨酸705(Y705)位点处被磷酸化而接着二聚化并入核，也可以通过MAPK途径在丝氨酸727(S727)位点处被磷酸化而激活并进入线粒体，从而调控细胞呼吸(非经典的STAT3激活)。研究表明，除了经典的2型免疫关键调节因子和效应因子相关基因，STAT3也被发现是哮喘的易感基因之一。首先，研究人员发现在屋尘螨诱导的慢性哮喘模型中，经典的STAT3信号在肺组织种被激活。通过构建气道上皮STAT3特异性敲除的小鼠，他们发现气道上皮STAT3缺失会导致尘螨诱导的慢性炎症减弱，包括嗜酸性粒细胞浸润减少以及气道高反应性降低。此外，STAT3还能够直接与Th2细胞的关键转录因子基因(如Gata3)结合并增强其染色质的可及性，协同STAT6增强GATA3等的表达，最终促进2型细胞因子的产生。STAT3在T细胞中的敲除致使Th2细胞发育和功能受损，也导致卵清蛋白诱导的过敏性炎症减弱。然而，非经典STAT3信号在哮喘发生发展中的作用尚有待进一步研究。

[0005] 热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)家族是机体最大一类的分子伴侣，包括小热休克蛋白、HSP40、HSP70和HSP90，能够参与蛋白质的折叠、降解和转运等过程，从而影响细胞信号转导、转录和代谢等生理进程。其中，研究表明HSP70和HSP90参与了蛋白质向线粒体的转运。此外，多篇研究发现，HSP90能够和STAT3在胞内直接相互作用，这表明HSPs可能是非经典STAT3信号的潜在检查点。基于HSP90在细胞发育和生长过程中发挥的重要作用，多种HSP90抑制剂已被应用于抗肿瘤的研究中，这包括格尔德霉素(Geldanamycin，GA)及其衍生物等。

[0006] 目前，尚未见以STAT3的线粒体转运为靶点在哮喘治疗中的报道。

发明内容

[0007] 本案发明人在研究中发现，ILC2s在哮喘中的功能发挥依赖于非经典的STAT3信号。基于这一机制，本发明还发现，HSP90抑制剂格尔德霉素(Geldanamycin，GA)可以阻碍ILC2s中的非经典STAT3信号向线粒体的转运，从而抑制ILC2s的功能和小鼠哮喘炎症反应。

[0008] 从而，一方面，本发明提供了一种HSP90抑制剂在制备用于阻碍STAT3线粒体转运的制剂中的应用。

[0009] 另一方面，本发明还提供了HSP90抑制剂在制备用于抑制2型天然淋巴样细胞的功能的制剂中的应用。

[0010] 另一方面，本发明还提供了HSP90抑制剂在制备用于治疗哮喘或其相关疾病的药物中的应用。

[0011] 本发明中，所述HSP90抑制剂是降低HSP90表达和/或阻碍HSP90功能的物质。可以是现有技术中能够实现降低HSP90表达和/或阻碍HSP90功能的任何物质。

[0012] 在本发明的一些具体实施方案中，所述HSP90抑制剂包括格尔德霉素和/或其衍生物。

[0013] 在本发明的一些具体实施方案中，所述HSP90抑制剂包括以HSP90转录本为靶点且能够抑制HSP90表达或基因转录的shRNA。

[0014] 根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述HSP90抑制剂通过阻碍STAT3进入线粒体抑制2型天然淋巴样细胞(ILC2s)的功能，进而降低气道嗜酸性粒细胞的浸润和/或改善哮喘。

[0015] 另一方面，本发明还提供了以STAT3的线粒体转运为靶点在筛选和/或制备用于治疗哮喘或其相关疾病的药物中的应用。

[0016] 另一方面，本发明还提供了一种阻碍STAT3线粒体转运的方法，该方法包括：采用HSP90抑制剂与靶细胞接触，阻碍STAT3向线粒体转运。本发明中，所述阻碍STAT3线粒体转运的方法，可以是体外实验方法，也可以是对个体的治疗方法。

[0017] 另一方面，本发明还提供了一种抑制2型天然淋巴样细胞的功能的方法，该方法包括：采用HSP90抑制剂与2型天然淋巴样细胞(ILC2s)接触，从而抑制2型天然淋巴样细胞的功能。本发明中，所述抑制2型天然淋巴样细胞的功能的方法，可以是体外实验方法，也可以是对个体的治疗方法。所述HSP90抑制剂能够抑制ILC2s的功能，进而降低气道嗜酸性粒细胞的浸润和/或改善哮喘。根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述HSP90抑制剂通过阻碍STAT3进入线粒体抑制2型天然淋巴样细胞(ILC2s)的功能。

[0018] 另一方面，本发明还提供了一种筛选用于治疗哮喘或其相关疾病的药物的方法，该方法包括：以STAT3的线粒体转运为靶点，筛选用于治疗哮喘或其相关疾病的药物。

[0019] 另一方面，本发明还提供了一种治疗哮喘或其相关疾病的方法，该方法包括：以STAT3的线粒体转运为靶点，通过阻碍STAT3的线粒体转运来治疗哮喘或其相关疾病。

[0020] 另一方面，本发明还提供了一种治疗哮喘或其相关疾病的方法，该方法包括：给予个体治疗有效量的HSP90抑制剂。

[0021] 另一方面，本发明还提供了一种治疗哮喘或其相关疾病的药物，其包括：治疗有效量的HSP90抑制剂，以及药学上可接受的辅料。根据本发明的具体实施方案，所述药物为鼻腔给药剂型。

[0022] 本发明中，所述哮喘或其相关疾病包括急性哮喘、慢性哮喘、过敏性鼻炎、鼻窦炎、慢性阻塞性肺疾病中的一种或多种。

[0023] 综上所述，本发明发现了ILC2s在哮喘中的功能发挥依赖于非经典的STAT3信号，并发现HSP90抑制剂的作用靶细胞包括ILC2s，可以阻碍ILC2s中的非经典STAT3信号向线粒体的转运，从而抑制ILC2s的功能和小鼠哮喘炎症反应，为治疗哮喘提供了新的靶点和思路，具有重要的临床价值。不仅如此，本发明进一步可采用鼻腔给药的方式，极大地降低了药物可能带来的副作用。

附图说明

[0024] 图1A至图1I显示STAT3缺失导致ILC2s功能缺陷并减轻急性哮喘肺部炎症。fl/fl icre fl/fl
Stat3 和Vav Stat3 小鼠(STAT3敲除型小鼠)经木瓜蛋白酶在第0、1和3天滴鼻处理，诱导急性哮喘，第4天分析。图1A：肺组织HE染色，标尺长度为50μm。图1B：肺组织病理学评分，结果为两次独立实验的叠加。图1C：肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids，+ +
BALF)中IL‑5和IL‑13的蛋白含量。图1D：流式检测肺组织中嗜酸性粒细胞(CD45 CD11b‑/low +
CD11c Siglec‑F)的浸润。图1E：肺组织和BALF中嗜酸性粒细胞的数目。图1F：流式检测+ ‑ + + +
肺组织中ILC2s(CD45LinCD127 CD90GATA3)的数目。图1G：肺组织中ILC2s的细胞数量和+ ‑ + + + +
Ki67表达。图1H和图1I：流式检测肺部ILC2s(CD45LinCD90 KLRG1)中IL‑5 和IL‑13 细胞的比例和数目。“ns”代表组间没有显著性差异；“*”、“**”和“***”代表组间具有显著性差异(P<0.05、P<0.01和P<0.001，one‑way ANOVA，Tukey’s test)。

[0025] 图2A至图2E显示IL‑33能够特异地激活ILC2s中STAT3在S727位点的磷酸化并促进其线粒体转运。图2A：流式检测各个因子体外刺激后ILC2s中STAT3在S727和Y705位点的磷酸化水平，红色为pSTAT3(S727)(上)和pSTAT3(Y705)(下)信号，黑色为各自的同型对照。图+ +2B：统计A中pSTAT3(S727) 细胞的比例。图2C：统计A中pSTAT3(Y705) 细胞的比例。图2D：激光共聚焦显微镜观察ILC2s细胞内信号等的定位情况，蓝色为DAPI(细胞核)信号，红色为Mito‑Tracker Red CMXRos(线粒体)信号，绿色为pSTAT3(S727)信号，亮灰色为pSTAT3(Y705)信号。黄色代表红绿信号共定位。标尺长度为3μm。图2E：pSTAT3(S727)和线粒体发生共定位的细胞比例。“nd”表示没有阳性信号。“*”和“***”代表组间具有显著性差异(P<0.05和P<0.001，one‑way ANOVA，Tukey’s test)。

[0026] 图3A至图3D显示HSP90抑制剂能够阻碍STAT3易位至线粒体并抑制ILC2s的功能。图3A：ILC2s中HSP70和HSP90编码基因的表达。图3B：激光共聚焦显微镜观察0.5μM格尔德霉素体外处理后ILC2s细胞内信号等的定位情况，蓝色为DAPI(细胞核)信号，红色为Mito‑Tracker Red CMXRos(线粒体)信号，绿色为pSTAT3(S727)信号。黄色代表红绿信号共定位。
标尺长度为2μm。图3C：RT‑qPCR检测0.5μM GA体外处理后ILC2s中Il5和Il13的基因表达情况。图3D：ELISA检测培养上清中IL‑5和IL‑13的浓度。“***”代表组间具有显著性差异(P<
0.001，one‑way ANOVA，Tukey’s test)。

[0027] 图4A至图4D显示HSP90抑制剂处理能够减轻小鼠哮喘炎症反应。野生型小鼠经木瓜蛋白酶短期滴鼻处理，诱导急性哮喘。同时，在第‑1到第3天，使用4.5μg GA或相应溶剂滴鼻处理小鼠。图4A：流式检测肺组织中嗜酸性粒细胞的浸润。图4B：肺组织和BALF中嗜酸性粒细胞的数目。图4C：BALF中IL‑5和IL‑13的蛋白含量；图4D：肺组织中ILC2s的数目，结果为两次独立实验的叠加。“**”和“***”代表组间具有显著性差异(P<0.01和P<0.001，one‑way ANOVA，Tukey’s test)。

具体实施方式

[0028] 下面将参照附图和具体实施例，对本发明做进一步的详细说明，但本发明并不局限于所举实施例。

[0029] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0030] 下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0031] 下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0032] 实施例1

[0033] 所有实验小鼠均为C57BL/6背景，并且性别和年龄(6‑10周龄)相匹配。所有实验小鼠均在清华大学实验动物中心SPF级房间饲养，温度22‑26℃，昼夜节律12/12小时。所有操作均严格遵守国家和清华大学实验动物福利规章制度以及清华大学实验动物使用与管理委员会(IACUC)制定的相关规定。

[0034] 为构建急性哮喘模型，采用异氟烷气体麻醉小鼠，然后用鼻腔滴入的方式给予20μg木瓜蛋白酶(均溶解在40μl 1×PBS中)。在第0、1和3天对小鼠木瓜蛋白酶滴鼻处理，第4天分析。对于GA给药，先用DMSO配制50mM GA母液，再用1×PBS稀释，在第‑1至第3天对小鼠4.5μg GA(体积40μl)滴鼻处理。

[0035] 1.STAT3缺失导致ILC2s功能缺陷并减轻急性哮喘肺部炎症

[0036] Stat3fl/fl(对照组小鼠)和VavicreStat3fl/fl小鼠(STAT3敲除型小鼠)经木瓜蛋白酶在第0、1和3天滴鼻处理，诱导急性哮喘，第4天进行分析。

[0037] 图1A显示肺组织HE染色结果，图中标尺长度为50μm。图1B为肺组织病理学评分结fl/fl果，结果为两次独立实验的叠加。HE组织染色结果表明木瓜蛋白酶处理后，Stat3 对照组icre fl/fl
小鼠肺部气道和血管周围炎性细胞浸润增加，平滑肌和血管壁增生，而Vav Stat3 小鼠肺组织的炎性细胞浸润和炎症评分均比对照组低(图1A和图1B)。

[0038] ELISA检测肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF)中IL‑5和IL‑13的蛋白含量。ELISA结果显示，木瓜蛋白酶处理后，对照组小鼠BALF中IL‑5和IL‑13的浓度显icre fl/fl著升高，而两者在Vav Stat3 小鼠BALF中的浓度显著低于对照组小鼠(图1C)。

[0039] 流式检测肺组织中嗜酸性粒细胞(CD45+CD11b+CD11c‑/lowSiglec‑F+)的浸润，以及肺组织和BALF中嗜酸性粒细胞的数目。流式细胞技术检测结果显示，木瓜蛋白酶处理导致icre fl/fl小鼠肺部和BALF中嗜酸性粒细胞大量浸润，而模型下Vav Stat3 小鼠的嗜酸性粒细胞浸润显著低于对照组(图1D和图1E)。

[0040] 流式检测肺组织中ILC2s(CD45+Lin‑CD127+CD90+GATA3+)的数目，以及肺组织中ILC2s的细胞数量和Ki67表达。检测结果显示，木瓜蛋白酶处理后，对照组小鼠肺组织中icre fl/flILC2s数目明显增加，但是Vav Stat3 小鼠肺组织中ILC2s数目增加受阻，这可能是由于STAT3缺失导致ILC2s增殖能力下降，因为本发明发现模型下STAT3敲除的ILC2s中增殖标志物Ki67的表达比对照ILC2s中的更低(图1F和图1G)。

[0041] 流式检测肺部ILC2s(CD45+Lin‑CD90+KLRG1+)中IL‑5+和IL‑13+细胞的比例和数目。icre fl/fl
结果显示，在此急性哮喘模型中，Vav Stat3 小鼠肺组织中ILC2s表达IL‑5和IL‑13的细胞比例和数目均显著低于对照组(图1H和图1I)。

[0042] 2.IL‑33特异地激活ILC2s中STAT3在S727位点的磷酸化并促进其线粒体转运[0043] 为了探究STAT3在ILC2s中的上游信号因子，从经木瓜蛋白酶短期滴鼻处理的野生型小鼠肺组织中分选出ILC2s并在体外加入IL‑2扩增培养5天左右。然后先用无细胞因子培养基静息培养2小时，再分别用IL‑2、IL‑4、IL‑7、IL‑25、IL‑33和TSLP刺激15分钟，流式检测STAT3在两个位点(Y705和S727)的磷酸化状态。

[0044] 检测结果显示，在上述这些细胞因子刺激后，STAT3在Y705位点并没有磷酸化阳性信号(图2A和图2C)。有趣的是，IL‑33刺激后，STAT3在S727位点的磷酸化信号显著增强，+pSTAT3(S727) 细胞比例更是增加了约50％(图2A和图2B)。

[0045] 一般而言，STAT3在Y705位点的磷酸化会导致其二聚化并转运到细胞核中，从而直接与DNA应答元件结合并调节基因表达，而S727位点的磷酸化则促进STAT3转运到线粒体中，进而调节电子传递链活性和细胞呼吸。

[0046] 激光共聚焦显微镜观察结果(图2D)显示，IL‑33刺激后，并未检测到野生型(WT)ILC2s中有pSTAT3(Y705)的信号，而是在其中检测到了大量的pSTAT3(S727)的信号。不仅如此，大多数pSTAT3(S727)信号处于细胞质中，且有一部分与线粒体有明显的共定位。本发明同时也检测了STAT3敲除型(KO)ILC2s中的pSTAT3(Y705)和pSTAT3(S727)信号作为阴性对照，结果发现STAT3 KO ILC2s中并未有磷酸化STAT3的信号(图2D和图2E)。

[0047] 3.HSP90抑制剂阻碍STAT3易位至线粒体并抑制ILC2s的功能

[0048] 为了研究HSPs对ILC2s中线粒体STAT3信号转导的影响，本发明检测了ILC2s中HSP70和HSP90的基因表达水平。

[0049] 相对于编码HSP70的基因Hspa1b、Hspa1a和Hspa2，ILC2s高度特异性地表达编码HSP90的基因Hsp90ab1和Hsp90aa1(图3A)。

[0050] 本发明还在体外使用HSP90的抑制剂GA(0.5μM)处理ILC2s，并激光共聚焦显微镜观察STAT3定位情况以及该抑制剂对ILC2s细胞因子表达的影响。共聚焦成像分析显示，GA处理能够显著抑制ILC2s中pSTAT3(S727)与线粒体的共定位(图3B)。

[0051] 此外，RT‑qPCR检测0.5μM GA体外处理后ILC2s中Il5和Il13的基因表达情况，ELISA检测培养上清中IL‑5和IL‑13的浓度。结果显示，GA处理显著抑制了IL‑33体外刺激后ILC2s中Il5和Il13的基因表达以及IL‑5和IL‑13的分泌(图3C和图3D)。

[0052] 4.HSP90抑制剂减轻小鼠哮喘炎症反应

[0053] 野生型小鼠经木瓜蛋白酶短期滴鼻处理，诱导急性哮喘。同时，在第‑1到第3天，使用4.5μg GA或相应溶剂滴鼻处理小鼠。流式检测肺组织中嗜酸性粒细胞的浸润，检测肺组织和BALF中嗜酸性粒细胞的数目，检测BALF中IL‑5和IL‑13的蛋白含量，检测肺组织中ILC2s的数目。

[0054] 结果显示，GA滴鼻给药能够显著改善木瓜蛋白酶诱导的急性哮喘炎症反应，包括减少肺组织和BALF中嗜酸性粒细胞的浸润，以及降低肺组织中ILC2s的数目和BALF中2型细胞因子IL‑5和IL‑13的浓度(图4A‑图4D)。从而表明HSP90抑制剂处理能够减轻小鼠哮喘炎症反应。

[0055] 以上所述仅是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，也应视为本发明的保护范围。