一种生物防御素及其应用

摘要

本发明提供一种生物防御素，所述的生物防御素为生物防御素KY23，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有80％以上同一性的序列。本发明根据天然生物活性肽的氨基酸序列，对其进行改造，降低其疏水性、增加其带电性、提高其稳定性，从而提供一种生物防御素，其具有较低细胞毒性，较强的杀菌作用，具有良好的市场前景。

权利要求

1.一种生物防御素，其特征在于，所述的生物防御素序列选自SEQ ID NO.2‑5。

2.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的生物防御素。

3.一种生物学载体，其特征在于，所述的生物学载体为表达载体，所述的表达载体上包括权利要求2所述的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的生物学载体，其特征在于，所述的表达载体骨架为pSmart‑1质粒；所述的核酸分子位于所述载体的sumo酶标签3’端；启动子为T7启动子。

5.一种表达生物防御素的细胞，其特征在于，所述的细胞中包括权利要求3所述的生物学载体。

6.一种细胞制备物，其特征在于，通过权利要求5所述的细胞进行制备，所述的细胞制备物包括裂解液和/或培养物。

7.一种生物防御素的制备方法，其特征在于，包括通过基因工程细胞构建对权利要求1所述的生物防御素进行表达。

8.一种生物防御素的制备方法，其特征在于，对权利要求1中所述的生物防御素进行化学固相合成。

9.权利要求1所述的生物防御素和/或权利要求2所述的核酸分子和/或权利要求3‑4任一项所述的生物学载体和/或权利要求5所述的细胞和/或权利要求6所述的细胞制备物在制备杀菌消毒剂中的应用。

10.一种杀菌消毒剂，其特征在于，包括权利要求1所述的生物防御素和/或权利要求6所述的细胞制备物。

11.一种杀菌消毒剂的制作方法，其特征在于，所述的制备方法中包括权利要求7‑8任一项所述的制备方法。

说明书

一种生物防御素及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物防御素及其应用。

背景技术

[0002] 抗生素是人类对抗细菌感染疾病取得重大的胜利，随着发现抗生素种类的增多，人类可以很好的对抗细菌感染类疾病。由于长时间依赖与抗生素类药物，使细菌慢慢对抗生素产生抗性。

[0003] 随着社会科学技术的进步，发现生物活性肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌及部分病毒具有较强的灭杀作用。生物活性肽的种类较多，如抗菌肽是一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，由20‑60个氨基酸残基组成，多具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。在细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中都已发现并成功分离获得具有抗菌活性的多肽。随着人们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用。

[0004] 中国专利202110269857.3中公开了具有抑菌功能的生物活性肽、复合生物活性肽及其制备方法和用途。首先公开了具有抑制细菌功能的生物活性肽，所述生物活性肽的制备方法包括：以羊血为原料利用酶水解法处理得到羊血血红蛋白，其中，所述的酶选自胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中的任何一种。该发明进一步公开了具有更佳抑制细菌功能的复合生物活性肽，该复合生物活性肽由采用胃蛋白酶对羊血进行酶水解法处理得到的生物活性肽以及采用木瓜蛋白酶对羊血进行酶水解法处理得到的生物活性肽复合组成，体外和体内抑制试验结果表明，该发明所提供的生物活性肽或复合生物活性肽对于沙门氏菌和大肠杆菌具有显著的抑菌和抗炎作用。

[0005] 但是天然的生物活性肽具有较强的细胞毒性以及活性较低，为实际应用带来很大的阻力。对于生物活性肽的优化是提升抗菌肽使用效果的一个重要方向。

发明内容

[0006] 为了解决上述问题，本发明根据天然生物活性肽的氨基酸序列，对其进行改造，降低其疏水性、增加其带电性、提高其稳定性，从而提供一种生物防御素，其具有较低细胞毒性，较强的杀菌作用，具有良好的市场前景。

[0007] 一方面，本发明提供了一种生物防御素。

[0008] 所述的生物防御素为生物防御素KY23，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有80％以上同一性的序列。

[0009] 优选地，所述的序列选自SEQ ID NO.2‑5。

[0010] 另一方面，本发明提供了一种核酸分子。

[0011] 所述核酸分子编码前述的生物防御素。

[0012] 优选地，所述的核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.6或与SEQ ID NO.6具有80％以上同一性的序列。

[0013] 再一方面，本发明提供了一种生物学载体。

[0014] 所述的生物学载体为表达载体。

[0015] 所述的表达载体用于表达前述的生物防御素。

[0016] 所述的表达载体上包括前述的核酸分子。

[0017] 优选地，所述的表达载体骨架为pSmart‑1质粒；所述的核酸分子位于所述载体的sumo酶标签3’端；启动子为T7启动子。

[0018] 又一方面，本发明提供了一种表达生物防御素的细胞。

[0019] 所述的细胞中包括前述的生物学载体。

[0020] 所述的细胞通过前述的生物学载体进行细胞转导后得到。

[0021] 优选地，所述的细胞转导的细胞为大肠杆菌，进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

[0022] 在一些实施例中，所述的细胞为BL21(DE3)‑KY23‑1。

[0023] 又一方面，本发明提供了一种细胞制备物。

[0024] 所述的细胞制备物通过前述的细胞进行制备。

[0025] 所述的细胞制备物包括但不限于裂解液、裂解液上清、裂解沉淀、培养物、培养物提取物中的一种或多种。

[0026] 又一方面，本发明提供了一种生物防御素的制备方法。

[0027] 所述的制备方法中包括通过基因工程细胞构建对前述的生物防御素进行表达。

[0028] 或者，所述的制备方法中包括对所述的生物防御素进行化学固相合成。

[0029] 优选地，所述的基因工程细胞为前述的BL21(DE3)‑KY23‑1。

[0030] 具体地，所述的制备方法中包括对BL21(DE3)‑KY23‑1的培养，所述的培养中包括：在培养液的OD600达到25‑30时，加入0.1M IPTG进行诱导培养，诱导培养的温度为25‑30℃，pH为6.8‑7.2，诱导培养的时间10‑15h。

[0031] 所述的制备方法中还可能包括：在BL21(DE3)‑KY23‑1培养结束后，收集菌体对其进行细胞壁破碎，纯化生物防御素KY23。

[0032] 又一方面，本发明提供了一种生物防御素的纯化方法。

[0033] 所述的纯化方法中使用BL21(DE3)‑KY23‑1菌液进行纯化。

[0034] 所述的纯化方法中还包括Ni柱纯化。

[0035] 又一方面，本发明提供了前述的生物防御素和/或核酸分子和/或生物学载体和/或细胞和/或细胞制备物和/或生物防御素的制备方法和/或生物防御素的纯化方法在制备杀菌消毒剂中的应用。

[0036] 所述的杀菌消毒剂中包括前述的生物防御素和/或核酸分子和/或生物学载体和/或细胞和/或细胞制备物。

[0037] 或者，所述的生物防御素的制备方法和/或生物防御素的纯化方法作为杀菌消毒剂制作方法中的一个步骤进行应用。

[0038] 又一方面，本发明提供了一种杀菌消毒剂。

[0039] 所述的杀菌消毒剂中包括前述的生物防御素和/或核酸分子和/或生物学载体和/或细胞和/或细胞制备物。

[0040] 所述的杀菌消毒剂可对革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌产生抑制作用。

[0041] 优选地，所述的杀菌消毒剂可对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌产生抑制作用。

[0042] 又一方面，本发明提供了一种杀菌消毒剂的制作方法。

[0043] 所述的制作方法中包括前述的生物防御素的制备方法和/或纯化方法。

[0044] 本发明的有益效果：

[0045] 1、本发明提供的生物防御素KY23是在SAMP29的基础上改造而成，去除N端大量疏水氨基酸降低其细胞毒性，浓度在50μM时溶血率仅1.58％，可认为无毒副作用。

[0046] 2、本发明通过合成五种不同氨基酸序列，检测其细胞毒性和抗菌活性筛选出SEQ ID NO.1最佳，细胞毒性较低切最低抑菌浓度仅为1.25μg/mL。

[0047] 3、常规生物防御素KY23具有较强的杀菌作用，在基因构建表达时难以在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。本发明生物防御素KY23选择使用sumo酶标签融合表达，纯化后sumo酶酶切即可得到生物防御素KY23单体，无残留氨基酸存在。

[0048] 4、本专利筛选出SEQ ID NO.1对应的基因SEQ ID NO.6在载体中表达量高。

附图说明

[0049] 图1为溶血实验的实验结果。

[0050] 图2为pSmart‑1‑KY23‑1表达载体图谱。

[0051] 图3为重组大肠杆菌的表达能力检测实验结果。

[0052] 图4为实施例7中步骤(6)的洗脱峰峰图。

[0053] 图5为纯化后的KY23‑1单体电泳图。

[0054] 图6为BL21(DE3)‑KY23‑1菌液的电泳图。

具体实施方式

[0055] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0056] 实施例1生物防御素KY23的制备

[0057] 本发明对天然多肽进行人工改造，设计并筛选出氨基酸序列SEQ ID NO.1‑5。

[0058] 通过对筛选出的氨基酸序列进行密码子优化，构造出最优DNA序列，使用重叠PCR将DNA序列连接至pSmart‑1质粒中的sumo酶标签3’端。测序正确的质粒转染感受态细胞BL21(DE3)中，通过抗性培养基筛选出表达量高的菌株作为菌种保存。

[0059] 筛选出的菌种高密度发酵，离心收集菌体，使用含0.5M NaCl、5％甘油及0.1M咪唑的0.2M tris‑HCl pH7.4缓冲液混匀菌体，均质机在300Mpa均质两次，800Mpa均质两次，碟片离心取上清。离心上清通过Ni柱，冲洗2‑3个床体积，含0.5M NaCl及0.5M咪唑的0.02M tris‑HCl pH7.4缓冲液洗脱Ni柱，收集洗脱峰。洗脱峰在1KD超滤膜超滤，去除高浓度咪唑及NaCl。在4℃sumo酶与洗脱峰蛋白比例为1：200酶切过夜，次日酶切好的蛋白溶液通过Ni柱，收集穿过峰，穿过峰通过SP离子交换柱，使用含1.5M NaCl的0.02M tris‑HCl pH7.4缓冲液冲洗柱子，此峰为蛋白杂峰，再使用含2.0M NaCl的0.02M tris‑HCl pH7.4缓冲液洗脱，收集洗脱峰。在1KD超滤膜超滤，去除高浓度NaCl，即可得到生物防御素KY23。

[0060] 实施例2生物防御素KY23的抑菌能力检测

[0061] 采用化学固相合成的方式，合成SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5中的候选氨基酸序列；采用反相C18色谱柱检测合成的生物防御素KY23纯度，确定合成的生物防御素KY23纯度大于95％；其中C18检测条件为A：含有0.05％(V/V)的三氟乙酸，B：含有0.05％的乙腈，检测波长为210nm，在40分钟内，B从0线性提高至90％(V/V)。取得合格的合成候选序列的生物防御素KY23后，采用最低抑菌浓度(MIC)作为评价指标，优选了一株革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(杭州微球，编号HGP‑D1‑C7)和一株革兰氏阴性细菌大肠杆菌(杭州微球，编号HGP‑D1‑C7)作为指示菌进行抑菌活性评价。

[0062] MIC检查：(1)采用LB培养基倍比稀释不同浓度的待测药物溶液；(2)分别添加到96孔聚苯乙烯板中，在第1至11孔加药液，每孔100μL，药物浓度分别320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/mL，第12孔添加100uL LB培养基作为生长对照；(3)将菌悬液采
6
用LB培养基稀释制备成约2×10CFU/mL的悬液；(4)将100μL菌悬液添加至96孔板中，在37℃条件下，培养约20小时，测定吸光值，判定最小抑菌浓度。实验结果如下表：

[0063]

[0064]

[0065] 从MIC分析可以得出，SEQ ID NO.1‑5的生物防御素KY23均具有抑菌能力，其中SEQ ID NO.1具有较优的抑菌能力。

[0066] 实施例3溶血性评价

[0067] 将实施例2中化学合成的5条候选氨基酸序列，采用溶血性作为评价指标，溶血性检测采用新鲜的人红细胞进行：(1)采用pH＝7.4的PBS溶液将人红细胞1000g离心力离心7分钟，洗涤2‑3次；(2)将候选生物防御素KY23溶解至同样的PBS溶液中，按照0、100μM、200μM、400μM与洗涤后的人红细胞同等比例加入；(3)37℃条件下，孵育1小时；(4)1000g离心力离心5分钟；(5)在405nm的波长下，检测离心后的上清。计算公式如下：

[0068]

[0069] 结果如图1所示，其中SEQ ID NO.1序列具有较低的溶血性作为后续优选开发对象，后文中，将SEQ ID NO.1的生物防御素KY23命名为KY23‑1。

[0070] 实施例4表达KY23‑1细胞的制备

[0071] 1、构建含有KY23‑1基因表达载体，方法如下：

[0072] 采用全基因合成技术合成SEQ ID NO.6。

[0073] 插入pSmart‑1载体(上海禾午，货号：P1317)上，质粒图谱如图2。

[0074] 2、构建含有pSmart‑1‑KY23‑1表达载体的重组大肠杆菌

[0075] 方法：将测序正确的重组载体pSmart‑1‑KY23‑1用热激法转化BL21(DE3)感受态细胞，并用LB(含硫酸卡那霉素，100μg/mL)平皿进行筛选。热激法采用42℃热激1.5分钟，冰上静置2分钟；然后加入无抗性的LB肉汤培养基37℃、120rpm培养约1小时；最后将其均匀涂布在含有硫酸卡那霉素的LB抗性平板上，37℃倒置培养过夜，进行阳性克隆筛选。得到的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)‑KY23‑1。

[0076] 实施例5重组大肠杆菌的表达能力检测

[0077] 检测实施例4得到的重组大肠杆菌BL21(DE3)‑KY23‑1中的KY23‑1的表达情况。

[0078] 检测方法：取实施例4的重组大肠杆菌BL21(DE3)‑KY23‑1，采用LB基础培养基在37℃、220rpm培养重组BL21(DE3)‑KY23‑1，当菌体密度OD600达到0.5‑1.0时，添加0.6mM IPTG 30℃诱导4‑5小时；取0.1mL菌液离心收集菌体，加入4×loading buffer 20μL、纯化水60μL，100℃煮10min，12000rpm离心后取上清进行全菌电泳，用于检测诱导表达情况。

[0079] 并设置对照组，比较不同KY23‑1编码序列对表达水平的影响，对照组的KY23‑1编码序列如下：

[0080] 对照组1：SEQ ID NO.7；

[0081] 对照组2：SEQ ID NO.8。

[0082] 参照实施例4的方法，用对照组1或2的KY23‑1编码序列制备重组大肠杆菌，并进行表达测试。

[0083] 结果如图3所示，其中泳道1为空白菌、泳道2、3为对照菌诱导表达量、泳道4为Marker、泳道5为实施例4构建菌种诱导表达量。

[0084] 实施例6大规模生产生物防御素KY23的方法

[0085] 为了大规模获得生物防御素KY23，需要在发酵罐中进行表达培养，本实施例进行了200L中试发酵规模的工艺，条件如下：

[0086] 取实施例4得到的重组大肠杆菌BL21(DE3)‑KY23‑1，用种子培养基进行种子扩培，待大肠杆菌到达一定数量后接种于发酵基础培养基中，进行IPTG诱导表达。

[0087] 其中，种子培养基为LB培养基；

[0088] 发酵基础培养基包括(g/L)：甘油20，酵母粉10，蛋白胨15，MgSO4·7H2O5；

[0089] 补料培养基(g/L)：甘油控制在20，酵母粉120，蛋白胨150；

[0090] 诱导的时机为菌体生长对数中后期，反应器规模OD600达到25‑30，诱导剂IPTG的浓度为0.1mM，诱导温度为30℃，诱导时长为15h。

[0091] 实施例7重组KY23‑1的纯化

[0092] (1)将实施例6培养的BL21(DE3)‑KY23‑1菌液，使用碟片离心机离心后，收集菌体；

[0093] (2)将收集的菌体重悬至50L含有0.5M NaCl、5％甘油、0.1M咪唑的0.02MTris‑HCl pH7.4的缓冲液中，均质机在300Mpa下均质2次，在800Mpa下均质2次，离心收集上清；

[0094] (3)上述离心上清液通过Ni柱，含有0.5M NaCl、0.1M咪唑的0.02MTris‑HCl pH7.4的缓冲液冲洗2‑3个床体积，用含有0.5M NaCl、0.5M咪唑的0.02M Tris‑HCl pH7.4的缓冲液洗脱，收集洗脱峰；

[0095] (4)上述洗脱峰在截留分子量为1KD的超滤膜下超滤，缓冲液为含有0.1MNaCl、0.1M咪唑的0.02M Tris‑HCl pH7.4的缓冲液，超滤完成后在4℃下过夜酶切，酶切比例为sumo酶与融合蛋白的量为1：200；

[0096] (5)上述溶液通过Ni柱，收集穿过峰；

[0097] (6)上述穿过峰通过SP‑Sepharose FF，使用含有1.5M NaCl的0.02MTris‑HCl pH7.4的缓冲液冲洗杂峰1个床体积，再使用含有2.0M NaCl的0.02MTris‑HCl pH7.4的缓冲液洗脱，收集洗脱峰，如图4；

[0098] (7)上述洗脱峰液经过1KD的超滤膜浓缩、脱盐、换液后，得到具有抗菌活性的KY23‑1即纯度高的生物防御素KY23，缓冲液为0.02M pH7.4 PB缓冲液，纯化后的KY23‑1单体电泳图如图5，其中，泳道1为蛋白marker、泳道2、3为纯化后生物防御素KY23单体。图6为BL21(DE3)‑KY23‑1菌液的电泳图，泳道1为融合蛋白、泳道2为BL21(DE3)‑KY23‑1裂解上清、泳道3为BL21(DE3)‑KY23‑1裂解沉淀、泳道4为4℃过夜酶切、泳道5为合成生物防御素KY23、泳道6为蛋白Marker。

[0099] 实施例8生物防御素KY23单体生物学活性检测‑MIC实验

[0100] 将指示菌大肠杆菌、金色葡萄球菌接种于TSB培养基中，33℃，180‑220rpm培养24小时后，调整OD600为0.8‑0.9左右作为待用菌悬液，用MH肉汤培养基稀释500倍后备用；

[0101] 取一支样品吸取样品50μL，2倍法逐级，稀释液为无菌超纯水，共稀释11级；

[0102] 吸取50μL的样品或者硫酸卡那霉素标品加入到96孔板，再吸取50μL待测菌加入96孔板中，第12孔为不含待测样品的生长对照。同时设置稀释液与MH肉汤的阴性对照组，每组两个平行。35℃，孵育17h，观测记录结果。

[0103] 大肠杆菌MIC抑菌实验数据如下：

[0104]

[0105] 其中序号1、2为大肠杆菌MIC、序号3、4为金色葡萄球菌MIC。