一种自身免疫系统疾病标志物抗ASAP2自身抗体及其应用

摘要

本发明公开了一种自身免疫系统疾病标志物抗ASAP2自身抗体及其应用，属于生物医药技术领域。本发明研究发现应用现有的检测方法进行血清抗ASAP2蛋白自身抗体的检测，可以较准确地将自身免疫系统疾病患者和正常人鉴别开来。在此背景下提供此方便、快捷、有效的检测自身免疫系统疾病的标志物及该标志物在制备用于自身免疫系统疾病检测的试剂盒用途，本发明可用于临床的自身免疫系统疾病早期诊断。

权利要求

1.一种自身免疫性疾病标志物在制备用于自身免疫性疾病诊断的检测试剂或检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病标志物为与ASAP2蛋白结合的自身抗体，所述ASAP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；

所述自身免疫性疾病为周围神经病；

检测样品是全血或血清。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述周围神经病包括四肢无力、感觉麻木、腱反射减低、感觉缺失、疼痛、运动瘫痪、痛性痉挛、敏感障碍或自主障碍的症状。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂或检测试剂盒在检测时是检测样品中与ASAP2蛋白结合的自身抗体。

4.一种检测自身免疫性疾病的蛋白在制备用于自身免疫性疾病诊断的检测试剂或检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述蛋白包括衍生自ASAP2全长蛋白的一个或多个表位；

或者，所述蛋白为融合其他氨基酸的融合蛋白；其中， ASAP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；

所述自身免疫性疾病为周围神经病；

检测样品是全血或血清。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述周围神经病包括四肢无力、感觉麻木、腱反射减低、感觉缺失、疼痛、运动瘫痪、痛性痉挛、敏感障碍或自主障碍的症状。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂或检测试剂盒在检测时是检测样品中与ASAP2蛋白结合的自身抗体。

7.一种固定化检测试剂在制备用于自身免疫性疾病诊断的检测试剂或检测试剂盒中的应用，其特征在于，该固定化检测试剂是蛋白固定化于固态载体上获得；

所述蛋白包括衍生自ASAP2全长蛋白的一个或多个表位；或者，所述蛋白为融合其他氨基酸的融合蛋白；其中， ASAP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；

所述自身免疫性疾病为周围神经病；

检测样品是全血或血清。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述周围神经病包括四肢无力、感觉麻木、腱反射减低、感觉缺失、疼痛、运动瘫痪、痛性痉挛、敏感障碍或自主障碍的症状。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测试剂或检测试剂盒在检测时是检测样品中与ASAP2蛋白结合的自身抗体。

说明书

一种自身免疫系统疾病标志物抗ASAP2自身抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，涉及抗ASAP2自身抗体的检测方法以及检测这些自身抗体用于诊断神经系统相关疾病的检测试剂盒，具体涉及一种自身免疫系统疾病标志物抗ASAP2自身抗体及其应用。

背景技术

[0002] 神经系统自身免疫性疾病（神经免疫性疾病），包括中枢神经系统和周围神经系统的免疫性疾病。其中，中枢神经系统的免疫性疾病包括自身免疫性脑炎、多发性硬化（MS）、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、急性播散性脑脊髓膜炎(ADEM)，急性脊髓炎、中枢神经系统血管炎等。周围神经系统的免疫性疾病有急性炎症性脱髓鞘性多发性神经根神经炎（吉兰‑巴雷综合征，AIDP），慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根神经炎(CIDP)，神经肌肉接头的自身免疫性疾病有重症肌无力（MG）。周围神经疾病是指周围运动、感觉和自主神经的结构和功能障碍，其症状学上的表现有：（1）感觉障碍，包括感觉缺失、感觉异常、疼痛、感觉性共济失调；（2）运动障碍，包括肌束震颤、肌纤维抽搐、痛性痉挛、肌力减低或丧失，及萎缩；（3）肌腱反射减低或消失；（4）自主神经受损等。

[0003] 现有研究表明，神经系统疾病与某些特定靶抗原的自身抗体相关，如与重症肌无力相关靶标包括乙酰胆碱受体（AchR），肌肉特异性酪氨酸及酶（MuSK），低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP4），肌联蛋白（Titin）；与CIDP相关靶标为神经束蛋白155（NF155），神经束蛋白186（NF186），接触蛋白1（CNTN1），接触蛋白相关蛋白1（CASPR1）。

[0004] 虽然在部分表现出周围神经病症状的患者样本中可检测到相关靶标抗体，如sulfatides、GQ1b、GT1b、GT1a、GD3、GD2、GD1b、GD1a、GM4、GM3、GM2、GM1（IgG，IgM型）、LRP4、Titin、CNTN1等，但仍有部分患者在表现出周围神经病症状时，其样本检测结果为阴性。因此，在这种背景下，如果能够鉴定针对周围神经系统疾病的新的自身抗体，不仅能增加医生对自身免疫疾病的认识，有还助于医生对未知疾病的诊断和治疗。

[0005] ASAP2在心脏，脑，胎盘，肾脏，单核细胞和胰腺中均可检测到，在神经元突触区高度富集，可将paxillin，cortactin，amphiphysin和intersectin募集到质膜区域，参与囊泡运输、膜重构、细胞增殖等功能（Shigeru Hashimoto, Ari Hashimoto, Atsuko Yamada, et al. Assays and Properties of the ArfGAPs, AMAP1 and AMAP2, in Arf6 Function[J]. Methods in Enzymology, 2005, 404: 216‑231）。ASAP2的辅助分子amphiphysin，其抗体阳性患者可表现为边缘系统脑炎、脑干脑炎、亚急性小脑变性、周围神经病等多种神经综合征。当前，现有技术还尚未有关于ASAP2的自身抗体的相关报道。

发明内容

[0006] 为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种自身免疫系统疾病标志物抗ASAP2自身抗体及其应用。

[0007] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

[0008] 本发明公开了一种自身免疫性疾病标志物，所述自身免疫性疾病标志物为与ASAP2蛋白结合的自身抗体，所述ASAP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1（相当于来自人的ASAP2蛋白）或SEQ ID NO:2（相当于来自大鼠的ASAP2蛋白）所示。

[0009] 本发明公开了一种检测自身免疫性疾病的蛋白，所述蛋白包括衍生自ASAP2全长蛋白的一个或多个表位；或者，所述蛋白为融合其他氨基酸的融合蛋白；其中， ASAP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

[0010] 进一步地，所述多肽为融合其他氨基酸的融合蛋白，是指ASAP2融合了His标签、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽硫转移酶、flag标签、myc标签或strep标签。

[0011] 本发明公开了一种核酸，所述核酸编码所述的ASAP2蛋白，核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

[0012] 本发明公开了一种固定化检测试剂，将上述的检测自身免疫性疾病的蛋白固定化于固态载体上获得。

[0013] 本发明所述的固定，是指检测自身免疫性疾病的蛋白与水溶液中不可溶的固态载体结合，更为优选地借助共价键、静电相互作用、囊化或包埋或借助疏水相互作用，最为优选地借助一个或多个共价键结合。

[0014] 更进一步地，所述固态载体包括载玻片、聚苯乙烯板、玻璃板、膜（尼龙膜、硝酸纤维素膜或PVDF膜）、磁珠、柱色谱介质、生物芯片、聚丙烯酰胺凝胶等。

[0015] 本发明还公开了上述的自身免疫性疾病标志物、检测自身免疫性疾病的蛋白或固定化检测试剂在制备用于自身免疫性疾病诊断的检测试剂或检测试剂盒中的应用。

[0016] 优选地，所述自身免疫性疾病包括四肢无力、感觉麻木、腱反射减低、感觉缺失、疼痛、运动瘫痪、痛性痉挛、敏感障碍或自主障碍。这些症状大部分与神经疾病有关。

[0017] 进一步优选地，所述检测试剂或检测试剂盒在检测时是检测样品与ASAP2蛋白结合的自身抗体。

[0018] 进一步优选地，所述样品是全血、血清、脑脊液或唾液。

[0019] 本发明还公开了一种自身免疫性疾病检测试剂盒，检测试剂盒中包括上述的自身免疫性疾病标志物、检测自身免疫性疾病的蛋白或固定化检测试剂。

[0020] 优选地，自身免疫性疾病检测试剂盒适用于自身免疫性神经病、痴呆、边缘性人格障碍或初期精神病的诊断。该检测试剂盒包含上述检测方法中所用的抗原性多肽，即检测试剂盒中的抗原性多肽在人类细胞中重组表达，以及/或者如上所述，抗原性多肽在表达ASAP2蛋白的组织中呈现。

[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0022] 本发明提供一种操作简单、成本低、准确性高、无创伤的应用于临床的自身免疫系统疾病检测的生物标志物。本发明研究发现应用现有的检测方法进行血清抗ASAP2蛋白自身抗体的检测，可以较准确地将自身免疫系统疾病患者和正常人鉴别开来。在此背景下提供此方便、快捷、有效的检测自身免疫系统疾病的标志物及该标志物在制备用于自身免疫系统疾病检测的试剂盒用途，本发明可用于临床的自身免疫系统疾病早期诊断。

附图说明

[0023] 图1为血清在大鼠原代神经元上的免疫荧光法染色；其中，A为患者血清；B为健康受试者血清；

[0024] 图2为血清免疫沉淀结果；

[0025] 图3为患者血清免疫沉淀物的WB鉴定结果；

[0026] 图4为大鼠小脑组织的免疫组化染色；其中，A为患者血清；B为健康受试者血清；

[0027] 图5为血清中和实验验证大鼠小脑组织上的信号；其中，A为加入PBST中和血清；B为加入ASAP2蛋白中和血清；C为加入对照蛋白中和血清；

[0028] 图6为CBA法检测样受试者样本中的自身抗体；其中，A为患者血清；B为健康受试者血清；

[0029] 图7为患者1血清的CBA法中和实验；其中，A为加PBST中和血清；B为加ASAP2蛋白中和血清；C为加对照蛋白中和血清；

[0030] 图8为患者2血清的CBA法中和实验；其中，A为加PBST中和血清；B为加ASAP2蛋白中和血清；C为加对照蛋白中和血清。

具体实施方式

[0031] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

[0032] 需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

[0033] 下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

[0034] 实施例1：大鼠原代神经元细胞的免疫荧光法

[0035] 步骤1大鼠原代神经元细胞分离，具体操作包括如下步骤：

[0036] 1）、10%水合氯醛麻醉孕鼠，75%酒精浸泡消毒3min，生物安全柜取出胎鼠；

[0037] 2）、用预冷的HBSS（137mM NaCl, 5.4mM KCl, 0.6mM MgSO4·7H2O, 0.5mM MgCl2·6H2O, 0.3mM Na2HPO4·2H2O, 0.4mM kH2PO4, 5.6mM Glucose, 4.2 mM NaHCO3, pH7.2 7.4）冲洗胎鼠两次，在预冷的HBSS中解剖出胎脑浸泡在预冷的DMEM中；

[0038]~ 3）、弃DMEM，用眼科剪将组织块剪成1m3大小的糜状混合物。加入木瓜蛋白酶（浓度为2 mg/ml）。在10 cm培养皿中于37℃消化处理30分钟，每5 min轻轻摇晃一次。一般10至15个脑组织用消化液20 ml；

[0039] 4）、消化结束后，将细胞移到50 ml离心管，加入20 ml DMEM重悬，1 ml枪头吹打10次，400 g ，4℃离心5 min，

[0040] 5）、弃上清液，加入20 ml DMEM重悬，1 ml枪头吹打10次，4℃，400 g离心5 min，该步骤重复1次；

[0041] 6）、弃上清液，加入20ml Neurobasal培养基重悬细胞。

[0042] 步骤2、梯度密度法分离纯化神经元细胞，具体操作包括如下步骤：

[0043] 本实验采用A试剂，即密度为1.32 g/ml的密度介质OptiPrep（为Percoll的优化产品），对神经元进行分离纯化。

[0044] 1）、取细胞混合原液2ml，并用B试剂，即Neurobasal+B27+L‑glutamine（gibco公司）的完全培养基稀释至6ml；

[0045] 2）、配制梯度密度介质：①173μl A+827μl B；②124μl A+876μl B；③99μl A+901μl B；④74μl A+926μl B，并按照①②③④的顺序依次加入到15ml离心管底部；

[0046] 3）、将步骤1）稀释好的细胞混合液加入到介质顶层；

[0047] 4）、800g，22℃，15min离心分离；

[0048] 5）、依次去除上层6ml细胞碎片部分和1ml神经元细胞和少突胶质细胞混合细胞；

[0049] 6）、从离心管上层取体积大约为2.5ml的神经元细胞悬液，作为后续实验材料。

[0050] 7）、取出神经元细胞后，用5ml的Neurobasal+B27+L‑glutamine的完全培养基进行稀释；

[0051] 8）、200g，22℃，2min离心，去除上清；

[0052] 9）、使用完全培养基洗涤一次；

[0053] 10）、加入5ml Neurobasal+B27+L‑glutamine的完全培养基重悬；

[0054] 11）、血球计数板计数后按每孔60000细胞接种至48孔板中。

[0055] 步骤3 、对分离好的神经元进行免疫荧光染色，具体操作包括如下步骤：

[0056] 1）、将步骤2长有神经元细胞的48孔板从培养箱中拿出，弃上清，1×HEPES洗2次；

[0057] 2）、使用0.4%的多聚甲醛固定10min，弃上清，1×HEPES洗2次；

[0058] 3）、使用1.25M 甘氨酸浸泡10min ，弃上清，1×HEPES洗2次；

[0059] 4）、血清孵育：将患者1的血清使用PBS按照1:10的比例进行稀释，并将稀释好的样本加至含有神经元细胞的孔中，室温孵育60min，弃上清，1×HEPES洗3次；

[0060] 5）、二抗孵育：使用FITC标记的二抗室温孵育40min，弃上清，1×HEPES洗3次；

[0061] 6）、拍照：荧光显微镜下进行拍照。

[0062] 实验结果：

[0063] 图1为患者血清在大鼠原代神经元上的免疫荧光染色，由图1可以看出，在患者血清中存在与大鼠原代神经元结合的抗体，而健康受试者的血清未检出与神经元结合的抗体。

[0064] 实施例2：ASAP2的免疫沉淀

[0065] 实验具体包括以下步骤：

[0066] 1）、取6皿大鼠原代神经元细胞，弃上清，PBS洗2遍，0.4%多聚甲醛固定10min，1×HEPES洗3次；

[0067] 2）、血清孵育：取10ul血清加至10ml DMEM中（1:1000稀释），使用0.22um滤膜过滤后加入到固定好的细胞中，室温孵育2h；

[0068] 3）、取15ul珠子加入到2mL管子中，平衡液洗3遍，用300ul 4%BSA封闭2h；

[0069] 4）、将孵育好的细胞置于冰上，弃上清，PBS洗2遍，加入500ul裂解液（150mM NaCl, 1mM EDTA, 100mM Tris‑HCl, 0.5%脱氧胆酸钠, 1%TritonX‑100, 0.1%SDS, pH7.5），收集细胞，加入终浓度为1×的蛋白酶抑制剂，裂解30min，间隔震荡，15000rpm离心30min，取上清，测浓度；

[0070] 5）、将步骤4收集的上清加入到步骤3）处理好的珠子中，4℃过夜旋转孵育；

[0071] 6）、用裂解液将所有孵育的珠子洗4次，用80ul 2*loading buffer洗脱；

[0072] 7）、样本处理：洗脱液中先加入5×SDS‑PAGE loading buffer，再加入终浓度为0.01M的DTT，100℃加热10min，然后再加入终浓度为2%的碘乙酰胺，室温放置30min；

[0073] 8）、电泳：处理好的样品跑胶，使用银染试剂盒进行染色，分析结果（银染试剂盒购自于thermo公司）。

[0074] 实验结果：图2为血清免疫沉淀结果图，其中，M表示marker，1、2泳道为健康受试者血清，3泳道为患者血清。结果显示：在用患者血清获得的来自大鼠神经元的免疫沉淀物中检出一种大约100 130KD的蛋白质（图2泳道3），该蛋白质不存在于类似制备的对照中（图2~泳道1和泳道2）

[0075] 实施例3：免疫印迹

[0076] 实验具体包括以下步骤：

[0077] 1）电泳：取实施例2步骤7）得到的样品进行SDS‑PAGE；

[0078] 2）转膜：电泳完成后，使用湿法转膜，转膜条件为200mA，80min；

[0079] 3）封闭：使用5%的脱脂奶粉室温封闭1h；

[0080] 4）一抗孵育：按照1:2000的比例孵育抗ASAP2的多克隆抗体（抗体购自于sigma公司），室温孵育2h；

[0081] 5）洗涤：TBST洗3次，每次5 min；

[0082] 6）二抗孵育：加入HRP标记的二抗，室温孵育1h

[0083] 7）洗涤TBST洗3次，每次5 min；

[0084] 8）显色：加入化学发光液，记录结果。

[0085] 实验结果：

[0086] 图3为患者血清免疫沉淀物的WB鉴定结果，其中，M为marker，1泳道上样样品为患者血清免疫沉淀物，2泳道上样样品为健康受试者血清免疫沉淀物。结果显示：用患者血清捕获到的免疫沉淀物中存在与ASAP2抗体反应的条带，目的蛋白带处于100 130KD之间，而~健康受试者的免疫沉淀物中无条带出现，证明该患者体内存在与神经元蛋白反应的抗体。

[0087] 实施例4：大鼠脑组织的免疫组化及血清中和实验验证

[0088] 步骤1 取组织，切片，具体包括以下步骤：

[0089] 1）、选成年大鼠，麻醉，待老鼠四肢硬化，打开腹腔，暴露出心尖，从左心尖灌注PBS，以便全身循环；

[0090] 2）、取出脑组织；

[0091] 3）、甲醇固定10 30min；~

[0092] 4）、脱水：将样本移入30%蔗糖溶液中，4℃放置至组织块沉底；

[0093] 5）、将少量包埋剂OCT滴加到标本台，置入‑20℃冷冻切片机的冷冻台。待组织略微发白时用OCT在标本表面涂一薄层，继续冷冻20min，切片；

[0094] 步骤2 大鼠脑组织免疫组化片子的染色，具体包括以下步骤：

[0095] 1）、一抗孵育：按照1:100的比例孵育患者血清，室温孵育1h；

[0096] 2）、洗涤：PBST洗3次，每次5 min；

[0097] 3）、二抗孵育：加入荧光标记的二抗，室温孵育1h；

[0098] 4）、洗涤：PBST洗3次，每次5 min；

[0099] 5）、显微镜下观察结果拍照。

[0100] 步骤3 血清中和实验验证大鼠小脑组织上的信号，具体包括以下步骤：

[0101] 1）、中和蛋白的制备：收集过表达ASAP2蛋白的HEK293细胞（构建方法详见实施例7）1皿（10cm皿），加入200ul PBS，超声破碎（破碎条件为：15%功率，破3s，停6s，共超声3次）；
对照细胞为转入空载pCDNA3.1的细胞，对照蛋白的制备条件与ASAP2中和蛋白的制备条件相同；

[0102] 2）、中和实验：

[0103] （1）按照1:100的比例用PBST稀释患者血清，稀释好的血清中分别加入20ul ASAP2中和蛋白及对照蛋白，正常组加入20ul PBST，室温孵育10min；

[0104] （2）一抗孵育：将上述孵育好的样本加至鼠脑组织爬片上，室温孵育1h；

[0105] （3）洗涤：PBST洗3次，每次5 min；

[0106] （4）二抗孵育：加入荧光标记的二抗，室温孵育1h；

[0107] （5）洗涤：PBST洗3次，每次5 min；

[0108] （6）显微镜下观察结果拍照。

[0109] 实验结果：

[0110] （1）步骤2大鼠脑组织免疫荧光染色结果

[0111] 图4为大鼠小脑组织的免疫组化染色，与健康受试者血清（图4中B）染色结果相比，患者血清（图4中A）在大鼠小脑组织上分子层、浦肯野细胞层、颗粒层均有明显的信号，而健康受试者血清无着色。

[0112] （2）步骤3血清中和实验验证鼠脑组织上的信号结果

[0113] 用过表达ASAP2的HEK239裂解物及对照裂解物（转入空载pCDNA3.1的HEK239）进行血清中和实验验证，结果如图5所示，从图中可以看出，ASAP2中和蛋白明显封闭了该患者血清在大鼠小脑组织上分子层、浦肯野细胞层、颗粒层出现的信号，而对照蛋白未封闭住小脑组织上出现的信号，说明过表达ASAP2的HEK239裂解物可封住大鼠小脑组织上的阳性信号，而对照蛋白不能封住阳性信号，因此表明该信号为大鼠小脑组织上表达的抗ASAP2抗原的特异性信号。

[0114] 实施例4结论：患者1的血清中存在与鼠脑中ASAP2蛋白相结合的特异性抗体。

[0115] 实施例6：质谱法

[0116] 从凝胶条切下蛋白条带送去拜谱生物进行质谱法分析。

[0117] 结果：靶抗原与患者1的血清首先进行免疫沉淀，然后通过SDS‑PAGE电泳分离蛋白质，再进行凝胶银染。从银染胶上切下正常血清无而患者血清有的条带，送拜谱生物进行质谱分析。质谱结果证实了它含有ASAP2序列（肽段得分151.51，备注：公司建议选择得分≥20的肽段作为分析对象）。

[0118] 实施例7 HEK293细胞的免疫荧光法检测抗ASAP2自身抗体

[0119] 步骤1重组载体的构建

[0120] 通过PCR或人工合成的方法，将ASAP2基因通过分子克隆方法连至pCDNA3.1上，得到重组载体pCDNA3.1‑ASAP2，构建好的重组载体经测序正确后大提备用；

[0121] 步骤2细胞转染

[0122] （1）293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS‑DMEM高糖培养基，待细胞铺满时按1:5 1:6传代，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中过夜培养；~

[0123] （2）待细胞密度为30% 40%时，将pCDNA3.1‑ASAP2转入细胞中：~

[0124] 步骤3爬片固定

[0125] （1）洗涤：将生长48h的细胞用PBS洗涤2次，

[0126] （2）固定：加入丙酮固定5min；

[0127] （3）洗涤：丙酮固定后的爬片用PBS洗涤2次，干燥后备用。

[0128] 步骤4 受试者血清染色

[0129] （1）爬片洗涤：使用PBST洗涤步骤3获得的细胞爬片；

[0130] （2）样本孵育：将待检血清按照1:10比例稀释后加至爬片上，室温孵育1h；

[0131] （3）洗涤：PBST洗3次，每次5 min；

[0132] （4）二抗孵育：加入FITC标记的二抗，室温孵育40min；

[0133] （5）洗涤：PBST洗3次，每次5 min；

[0134] （6）显微镜下观察结果，拍照。

[0135] 步骤5 血清中和实验验证细胞爬片上的的信号

[0136] 患者1和患者2的血清在过表达ASAP2的细胞爬片上出现了比健康受试者血清明显的信号，为了进一步验证该信号的真实性，步骤5进行了血清中和实验验证，中和蛋白的制备步骤及实验过程同实施例4的步骤3，中和实验所得到的实验结果如图7和图8所示。

[0137] 实验结果：

[0138] 图6为CBA法检测受试者样本中的自身抗体，与健康受试者血清（B）染色结果相比，患者血清(A)在表达ASAP2抗原的细胞爬片上有明显的信号。

[0139] 图7为患者1血清的中和实验结果，用过表达ASAP2的HEK239裂解物及对照裂解物（转入空载pCDNA3.1的HEK239）对细胞爬片上患者1血清检测出的信号进行血清中和实验验证，结果显示，过表达ASAP2的HEK239裂解物可封住细胞爬片上的阳性信号，而对照蛋白不能封住阳性信号，表明患者1血清中的信号是与ASAP2蛋白特异性结合的信号。

[0140] 图8为患者2血清的中和实验结果，用过表达ASAP2的HEK239裂解物及对照裂解物（转入空载pCDNA3.1的HEK239）对细胞爬片上患者2血清检测出的信号进行血清中和实验验证，结果显示，过表达ASAP2的HEK239裂解物可封住细胞爬片上的阳性信号，而对照蛋白不能封住阳性信号，表明患者2血清中的信号是与ASAP2蛋白特异性结合的信号。

[0141] 实施例7结论：

[0142] 患者1和患者2血清中存在与人ASAP2抗原相结合的自身抗体。当患者出现了四肢无力、感觉麻木、腱反射减低、感觉缺失、疼痛、运动瘫痪、痛性痉挛、敏感障碍或自主障碍这些神经系统症状中的一种或几种时，患者样本中如果检测出ASAP2自身抗体，即该患者很有可能患有周围神经病。

[0143] 实施例8 基于细胞的免疫荧光法验证抗ASAP2自身抗体的特异性

[0144] 1、取实施例7已经干燥好的过表达ASAP2自身抗体的细胞爬片，备用；

[0145] 2、取患者1的血清，再选取具有各种神经自身抗体（抗Hu、Yo、CV2、Ma2 Amphiphysin、Ma1、SOX1、NMDAR、AMPAR1、AMPAR2、LGI1、CASPR2、GABABR、DPPX、IgLON5、GQ1b、GT1b、GT1a、GD3、GD2、GD1b、GD1a、GM4、GM3、GM2、GM1）的30位患者和40位健康对照的血清，进行免疫荧光染色，具体步骤如下：（1）一抗孵育：按照1:100的比例孵育患者血清，室温孵育1h；（2）洗涤：PBST洗3次，每次5 min；（3）二抗孵育：加入荧光标记的二抗，室温孵育40mi；
（3）洗涤：PBST洗3次，每次5 min；（4）；显微镜下观察结果。

[0146] 3、拍照：在表达ASAP2的HEK293细胞上，上述血清均不产生与患者血清相似的细胞形态。

[0147] 实施例8结论：患有本发明首次描述的神经系统疾病的患者具有针对ASAP2蛋白的自身抗体，而另一些患有神经系统疾病的患者和健康受试者样本没有这种抗体。本发明为实现神经系统疾病的诊断提供了待测的与自身抗体结合的新抗原，说明该抗体对周围神经病的诊断具有辅助作用。

[0148] 实施例9

[0149] 抗ASAP2自身抗体在疑似自身免疫性疾病样本中的检出率

[0150] 取156例周围神经病患者样本，使用实施例7的爬片进行检测，阳性数为6例，抗ASAP2抗体的检出率为3.85%。

[0151] 实施例10

[0152] ASAP2突变体检测患者血清中的ASAP2自身抗体

[0153] 本实施例选择人ASAP2基因的一个突变体，即缺失了ASAP2蛋白的第622‑762个氨基酸的突变体，按照实施例6的步骤进行载体构建、制备过表达缺失ASAP2基因的细胞爬片及对患者血清检测，结果显示，ASAP2的缺失突变体仍能识别患者血清中的抗ASAP2抗体。

[0154] 本发明涉及的ASAP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1（人源）或SEQ ID NO:2（鼠源）所示，对应的，编码ASAP2蛋白的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:3（人源）或SEQ ID NO:4（鼠源）所示。

[0155] 以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。