一种利用发根农杆菌诱导红豆杉空中生根繁育的技术

摘要

本发明公开了一种利用发根农杆菌诱导红豆杉空中生根繁育的技术：1)制备发根农杆菌悬浮液；2)配制基质：取田间土壤﹕珍珠岩﹕营养土﹕蛭石﹕营养液混合配制为基质；3)选取曼地亚红豆杉健硕树种中1‑3年生枝条，用环割刀去除宽度3～6mm的树皮及维管束形成层；4)环割后立即用发根农杆菌悬浮液喷施/涂抹环割伤口处；5)用容器盛装基质并用发根农杆菌悬浮液喷湿基质表面后包裹环割伤口；6)剪掉处理枝上的新枝；7)将枝条扶正；8)根冒出基质5‑8cm时即可以剪取枝条种到田间。本发明诱导曼地亚红豆杉枝干生根(空中生根)，不仅能缩短人工繁育周期，更能为后续可持续、高效利用紫杉醇含量较高的根部奠定基础。

权利要求

1.一种利用发根农杆菌诱导红豆杉空中生根繁育的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备发根农杆菌悬浮液，制备方法为：

①用LB固体培养基活化农杆菌菌种，挑取单克隆制备母液；

②接种至新的LB液体培养基培养至OD600=0.5‑0.6；

③离心弃上清；

④用含乙酰丁香酮的1/2 MS液体培养基重悬菌体，诱导培养；

⑤收集悬浮液，保存，备用；

（2）配制基质：取田间土壤﹕珍珠岩﹕营养土﹕蛭石﹕营养液按体积比 3～5﹕0.5～1.5﹕3～5﹕1.5～2.5﹕0.5～1.5比例混合配制为基质，所述营养液包含0.01～0.03 wt%吲哚乙酸、

0.005～0.02 wt%萘乙酸、0.10～0.15 wt%高锰酸钾、1.5～2.5 wt%活力素；

（3）选取红豆杉健硕树种中1‑3年生枝条，去除枝条上的针叶及腋芽，用环割刀去除宽度3～6 mm的树皮及维管束形成层；

（4）环割后立即用发根农杆菌悬浮液喷施/涂抹环割伤口处；

（5）采用透明容器盛装基质并用发根农杆菌悬浮液喷湿基质表面后包裹环割伤口，固定盛装基质的容器，保持环割伤口被基质包裹；

（6）剪掉处理枝上的新枝；

（7）将枝条扶正，防止枝条由于容器和基质的重量往下坠；

（8）当透过透明的基质盛装容器能清晰看到根冒出基质5‑8cm时即可以剪取枝条种到田间。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述营养液包含0.02wt%吲哚乙酸、0.01wt%萘乙酸、0.13wt%高锰酸钾、2%wt活力素。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述田间土壤﹕珍珠岩﹕营养土﹕蛭石﹕营养液的体积比为 4﹕1﹕4﹕2﹕1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基质pH值为6.5‑7.5，基质水分保持在

55%‑75%之间。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中用环割刀去除宽度3‑5 mm的树皮及维管束形成层。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发根农杆菌采用菌株Qual、MSU440、Ar1193、C58、ATCC15834和A4中的一种或多种。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发根农杆菌采用菌株MSU440或/和C58。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述红豆杉为曼地亚红豆杉。

说明书

一种利用发根农杆菌诱导红豆杉空中生根繁育的技术

技术领域

[0001] 本发明涉及红豆杉苗木繁育技术领域，具体涉及一种利用发根农杆菌诱导红豆杉空中生根繁育的技术。

背景技术

[0002] 红豆杉是集药用、保健、观赏和生态为一体的国家一级重点保护植物，被世界各国视为“国宝”。红豆杉提取物紫杉醇具有广谱、高效抗癌活性，是目前最有效的天然抗癌药物之一。经过长期的机理和临床研究，紫杉醇相继应用于晚期卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种癌症的治疗，是国际公认的明星抗癌药物。目前，全世界每年紫杉醇需求量为3000kg以上，实际年产300‑500kg；国内年需求量为500kg以上，但实际紫杉醇产量仅为200kg左右，国际和国内紫杉醇供需极度不平衡。曼地亚红豆杉是全球红豆杉树种中紫杉醇含量最高的种类，其叶和枝条中紫杉醇含量分别为0.015％和0.018％，根和树皮中紫杉醇含量高达0.071％。据估算3‑6棵100年左右的红豆杉树皮提取的紫杉醇仅能满足治疗1个癌症病人的需求。野生红豆杉生长周期长、资源少，远不能满足紫杉醇生产的供需矛盾；且为获取抗癌药物紫杉醇，人们大规模砍伐野生红豆杉，使得珍贵的红豆杉资源遭受重创。扦插是当前红豆杉人工繁育的主要方式，需要剪下红豆杉枝条离体扦插，但扦插方法生根难、成活率低、耗时长，不利于后续紫杉醇提取等大规模产业化发展。如何加速红豆杉苗木繁育、突破红豆杉生根瓶颈仍是世界各国扶持发展的重点内容。

[0003] 发根农杆菌是一种侵染性非常广泛的土壤细菌，能侵染几乎所有的双子叶植物和少数单子叶植物，并能诱导植物产生大量高度分支的不定根。发根农杆菌侵染植物所产生的不定根具有生长速度快、分化程度高、生理生化和遗传性稳定、易于进行操作控制等优点。

发明内容

[0004] 本发明的目的是针对上述问题，提供一种成活率高、繁育周期短的利用发根农杆菌诱导红豆杉空中生根繁育的技术。

[0005] 本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：

[0006] 一种促进红豆杉空中生根的营养液，包含0.01～0.03wt％吲哚乙酸、0.005～0.02wt％萘乙酸、0.10～0.15wt％高锰酸钾、1.5～2.5wt％活力素。

[0007] 优选所述营养液包含0.02wt％吲哚乙酸、0.01wt％萘乙酸、0.13wt％高锰酸钾、2％wt活力素。

[0008] 一种利用发根农杆菌诱导红豆杉空中生根繁育的技术，包括如下步骤：

[0009] (1)制备发根农杆菌悬浮液；

[0010] (2)配制基质：取田间土壤﹕珍珠岩﹕营养土﹕蛭石﹕营养液按体积比3～5﹕0.5～1.5﹕3～5﹕1.5～2.5﹕0.5～1.5比例混合配制为基质，所述营养液为权利要求1或2所述的营养液；

[0011] (3)选取曼地亚红豆杉健硕树种中1‑3年生枝条(枝干直径0.8‑1.2cm)，去除枝条上的针叶及腋芽，用环割刀去除宽度3～6mm的树皮及维管束形成层；

[0012] (4)环割后立即用发根农杆菌悬浮液喷施/涂抹环割伤口处；

[0013] (5)采用透明容器盛装基质并用发根农杆菌悬浮液喷湿基质表面后包裹环割伤口，固定盛装基质的容器，保持环割伤口被基质包裹；

[0014] (6)剪掉处理枝上的新枝；

[0015] (7)将枝条扶正，防止枝条由于容器和基质的重量往下坠；

[0016] (8)当透过透明的基质盛装容器能清晰看到根冒出基质5‑8cm时即可以剪取枝条种到田间。

[0017] 优选地，所述田间土壤﹕珍珠岩﹕营养土﹕蛭石﹕营养液的体积比为4﹕1﹕4﹕2﹕1。

[0018] 所述基质pH值为6.5‑7.5，基质水分保持在55％‑75％之间。

[0019] 步骤(2)中用环割刀去除宽度3‑5mm的树皮及维管束形成层。

[0020] 所述发根农杆菌采用菌株Qual、MSU440、Ar1193、C58、ATCC15834和A4中的一种或多种。

[0021] 优选地，所述发根农杆菌采用菌株MSU440或/和C58。

[0022] 其中，发根农杆菌悬浮液制备方法为：

[0023] (1)用LB固体培养基活化农杆菌菌种，挑取单克隆制备母液；

[0024] (2)接种至新的LB液体培养基培养至OD600＝0.5‑0.6；

[0025] (3)离心弃上清；

[0026] (4)用含乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基重悬菌体，诱导培养；

[0027] (5)收集悬浮液，保存，备用。

[0028] 在上述述的技术中，所述红豆杉为曼地亚红豆杉。

[0029] 现有技术中红豆杉人工繁育是从红豆杉树上将枝条剪取下来进行扦插，是离体培养。

[0030] 本发明中的术语“空中生根”是指不从红豆杉树上将枝条剪取下来，而是在红豆杉树种的枝条上直接进行诱导生根，不需要剪取枝条离体培养，是一种活体诱导生根。

[0031] 本发明的有益效果是：本发明以发根农杆菌为依托，诱导曼地亚红豆杉枝干生根(空中生根)，不仅能缩短人工繁育周期，更能可持续、高效利用紫杉醇含量较高的根部，将有效提升红豆杉经济价值、提高紫杉醇产量、促进红豆杉产业发展。

[0032] 相较于现有技术中有研究人员报道过的发根农杆菌对短叶红豆杉的转化技术，其是实验室内通过离体培养技术诱导出能直接用于紫杉醇提取的毛状根，其主要服务于实验室内基因工程技术；而本发明技术诱导出的是兼具直接用于紫杉醇提取及吸收养分及水分等生理功能的不定根，拓宽了本技术的应用范围。

附图说明

[0033] 图1是本发明的技术流程示意图；(a)1‑3年生枝条环割处理；(b)高压繁殖盒固定环割处理处；(c)环割上位处膨大形成分生组织；(d)环割上位处形成幼根；(e)枝干不定根伸长生长。

[0034] 图2是本发明技术在树体上操作处理的整体效果图。

[0035] 图3是本发明技术的效果展示图，其中，(a)为打开高压繁殖盒后根的形态，且其枝干上有新芽长出；(b)为将图(a)中基质去除后根的形态，根从环剥处长出。

[0036] 图4是采用本发明空中生根方法得到的处理枝移栽入花盆后的生长情况图。

[0037] 图5是传统繁育方法扦插枝在田间生长2年时的情况。

具体实施方式

[0038] 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

[0039] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所有生物、化学试剂，如无特殊说明，均为本领域常规试剂，均可通过商购获得。

[0040] 实施例1利用发根农杆菌诱导红豆杉空中生根

[0041] 1实验材料和方法

[0042] 1.1实验菌种

[0043] 发根农杆菌菌株种类：MSU440、Ar1193、C58、A4、Qual、ATCC15834，全部通过商购获得。

[0044] 1.2发根农杆菌悬浮液制备

[0045] (1)用LB固体培养基活化农杆菌菌种，挑取单克隆制备母液；

[0046] (2)按1:20比例接种至新的LB液体培养基，28℃，180rpm，培养至OD600＝0.5‑0.6；

[0047] (3)4800g离心10min，弃上清；

[0048] (4)用1/2MS(含200μM乙酰丁香酮(AS))液体培养基重悬菌体，定容至等体积，28℃，180rpm诱导3h；

[0049] (5)收集，4℃保存，备用。

[0050] 1.3红豆杉用于“空中生根”的枝条选取

[0051] 选取曼地亚红豆杉健硕树种中1‑3年生枝条(枝干直径0.8‑1.2cm)用于空中生根技术实施。

[0052] 1.4基质配比

[0053] 本发明技术中所涉及的基质配方按体积比田间土壤(即栽培地区的田间自然土壤)﹕珍珠岩﹕营养土﹕蛭石﹕营养液＝4﹕1﹕4﹕2﹕1比例配制，营养土为购自甘孜阿坝的腐熟土。其中营养液配方包含0.02wt％吲哚乙酸(纯度100％)、0.01wt％萘乙酸(纯度100％)、0.13wt％高锰酸钾(纯度99.9％)、2％wt活力素(郑州绿达农业科技有限公司，催根促芽型大树吊针浓缩液，登记证号：农肥(2014)临字0326，执行标准：NY1428‑2007)。

[0054] 得到的基质pH值为6.5‑7.5，基质水分保持在55％‑75％之间，若加入营养液后湿度未达标，需采用少量多次喷洒净水的方式调整湿度。

[0055] 植物高压繁殖盒准备：购买直径为8cm的可高压枝条直径尺寸7‑12mm的植物高压繁殖盒用于“空中生根”实验。把准备好的基质填满植物高压繁殖盒内后扣在枝条的环剥处，锁好自动扣并用扎带固定。

[0056] 1.5技术操作

[0057] 整个“空中生根”技术流程包括枝条选取、枝条环割、发根农杆菌处理、高压繁殖盒固定、顶端新枝修剪五个关键步骤，技术流程示意图如图1所示。实验地点为四川地珍曼地亚红豆杉生态产业园(四川省成都市郫都区)。

[0058] (1)酒精消毒环割刀。

[0059] (2)选取曼地亚红豆杉健硕树种中1‑3年生枝条(枝干直径0.8‑1.2cm)，去除枝条上针叶及腋芽，用环割刀去除宽度3‑5mm的树皮及维管束形成层。环割处维管束形成层一定要去除干净，避免伤口愈合不能生根。

[0060] (3)环割后立即用发根农杆菌悬浮液喷施/涂抹环割伤口处(伤口表面布满液滴即可)。

[0061] (4)采用市售的植物高压繁殖盒(通常由两个可打开合拢的半球形盒体组成，合拢后组成一个中间为球形的盒体，盒体的顶端和底端都能供水流通过)，将基质装入两个半球形盒体中，用发根农杆菌悬浮液喷湿基质表面(基质表面微湿即可)，将枝条的环割处围在植物高压繁殖盒的中间，合拢两个半球形盒体并固定住，让发根农杆菌与伤口处更好的结合，促进生根。

[0062] 植物高压繁殖盒也可采用其它容器代替，只要能盛装基质并保持基质包裹住环割伤口，且能保持土壤湿度即可。例如，可以采用塑料袋套在环割伤口外，装入基质，捆扎住塑料袋顶部和底部。

[0063] (5)剪掉处理枝上当年生新枝顶端，降低营养损耗。

[0064] (6)挂牌，用绳子将枝条扶正，防止枝条由于高压繁殖盒的重量往下坠；环割伤口朝天的一端定义为环割上位，靠近地面的一端定义为环割下位。操作完成后处理枝在树体上的总体情况如图2所示。定期检查，确保高压繁殖盒中基质的湿度，干燥时从盒体顶部注水保湿；通常实验过程中高压繁殖盒中湿度保持适中，不需要定期浇水。

[0065] (7)5个月后，环剥处能生根，6‑7个月后(或者能透过透明的植物高压繁殖盒能清晰看到根冒出基质5‑8cm)即可以剪取枝条种到田间。

[0066] 1.6实验设计

[0067] 实验设计包含1个空白对照(即不用发根农杆菌处理)，6种发根农杆菌分别处理，采用高压繁殖盒包裹。每个实验设置3个生物学重复，每个重复包含35株生根处理。

[0068] 2研究结果

[0069] 经过7个月左右的诱导处理，曼地亚红豆杉1‑3年生枝条能成功形成不定根。

[0070] 对照组和实验组中均有不能生根的枝条，与不能生根的枝条相比，正常“空中生根”的枝条仍是存活的状态，且有新芽长出，如图3所示，清理基质后观察，其根是从环剥处长出，根密集，根长为3‑8cm，根形态健壮，进一步说明本发明“空中生根”技术的可操作性。

[0071] 实验发现，能生根的枝条顶端都是绿的、活的状态，也能透过高压繁殖盒看到明显的根；而未成活的枝条均未生根。未用发根农杆菌处理的红豆杉枝条的生根率(生根的枝条占总实验枝条比例)仅为14.43％，而用发根农杆菌Qual、MSU440、Ar1193、C58、ATCC15834和A4处理的红豆杉枝条生根率分别为50.00％、55.23％、40.78％、55.00％、48.45％、37.63％。实验结果表明，与空白对照相比，不同发根农杆菌处理均能极显著提高红豆杉枝条生根率，且MSU440和C58处理效果更好。

[0072] 实施例2田间移栽实验

[0073] 将实施例1中采用发根农杆菌MSU440和C58诱导的枝条从环割处向下5cm的位置剪取，移栽入花盆中，按照常规曼地亚红豆杉田间管理方法进行管理，所有移栽枝条均成功成活，成活率100％，且生长良好、植株壮，在花盆中生长1个月的生长情况如图4所示。

[0074] 红豆杉传统扦插技术一般是选取1‑4年生枝条上的木质实生枝芽(枝条直径0.2‑0.3cm)进行扦插，繁育周期一般在12月扦插，次年5月左右生根，根长到5‑8厘米时需要6‑8个月，从扦插后到根长至5‑8厘米总共需要10几个月时间。本发明技术选取的是红豆杉1‑3生枝条的枝干(而非枝干上的枝芽，枝干直径0.8‑1.2cm)，采用本发明空中生根技术总共只需6‑7个月诱导的根就能生长到5‑8厘米，然后就可以剪下枝条在田间栽培，栽培后成活率高、枝条生长快、健壮。图5是传统扦插方法红豆杉扦插生长2年时的生长情况，图5A是其根系情况，图5B是整体生长情况，和图4相比，可以看出，扦插方法枝条生长较慢，本发明空中生根技术从开始处理枝条到图4的生长状态总共只需几个月，而图4中的枝条明显地比图5中生长了2年的扦插枝条高大、健壮，采用本发明技术能大大缩短繁育时间。