一种大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法

摘要

本发明提出了一种大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法，属于农业技术领域，包括：S1.感虫品种TN1秧苗带药双本移栽后，接入褐飞虱怀卵雌成虫进行虫源批量饲养；S2.鉴定材料和对照品种浸种、催芽，播种后，带药移栽，单本插种，小区间交叉排布，田间正常水肥管理；S3.分蘖盛期，材料小区罩上尼龙网罩，人工接入褐飞虱虫源，田间正常水肥管理，整个生长季，试验小区内不施用农药；S4.感虫对照小区植株致死率达90％时，统计鉴定材料的植株死亡率；S5.对每份鉴定材料叶片取样，提取DNA，采用已知抗性基因分子标记检测鉴定材料是否携带有抗褐飞虱基因。本发明形成了简化版的技术流程，按照本方法，该技术行之有效，其结果准确可靠。

权利要求

1.一种大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.感虫品种TN1，浸种、催芽，播种后，20‑30天秧龄带药移栽，双本插种后10‑30天，罩上100‑150目尼龙网罩，人工接入褐飞虱怀卵雌成虫进行虫源批量饲养；

S2.鉴定材料和对照品种浸种、催芽，播种后，20‑30天秧龄时，带药移栽，单本插种，小区间交叉排布，田间正常水肥管理；

S3.分蘖盛期每4‑5份材料小区，罩上100‑150目尼龙网罩，长宽高尺寸为5m×2m×

1.5m，人工接入褐飞虱虫源，田间正常水肥管理，整个生长季，试验小区内不施用农药；

S4.对照小区中TN1植株被取食致死率达90％时，调查各试验小区材料的死亡情况，统计每份鉴定材料的植株死亡率；

S5.对每份鉴定材料叶片取样，提取DNA，采用已知抗性基因分子标记检测鉴定材料是否携带有抗褐飞虱基因，根据每份鉴定材料的植株死亡率判断基因鉴定评价结果的准确性；

步骤S5中所述抗褐飞虱基因包括Bph3、Bph14、Bph15、Bph27；

所述Bph3基因的标记检测引物序列的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述Bph14基因的标记检测引物序列的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述Bph15基因的标记检测引物序列的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述Bph27基因的标记检测引物序列的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

2.根据权利要求1所述大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法，其特征在于，步骤S1中所述浸种条件为20‑30℃浸种44‑52h，催芽条件为25‑30℃恒温催芽24‑48h。

3.根据权利要求1所述大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法，其特征在于，步骤S1中所述带药移栽的行距和株距各15‑25cm；所述双本插种为6丛×6行。

4.根据权利要求1所述大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法，其特征在于，步骤S1中所述尼龙网罩长宽高尺寸1‑2m×1‑2m×1‑2m，单侧拉链门或双向拉链门，每个套笼接入250‑

350头怀卵雌成虫。

5.根据权利要求1所述大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法，其特征在于，步骤S2中所述浸种条件为20‑30℃浸种44‑52h，催芽条件为25‑30℃恒温催芽24‑48h。

6.根据权利要求1所述大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法，其特征在于，步骤S2中所述带药移栽的行距和株距各15‑25cm；所述单本插种为5丛×6行。

7.根据权利要求1所述大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法，其特征在于，步骤S3中所述尼龙网罩单侧拉链门或双向拉链门，每30株材料均匀接入250‑350对初羽化的褐飞虱雌雄虫，以及1000‑1400头2‑3龄褐飞虱若虫。

说明书

一种大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及农业技术领域，具体涉及一种大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法。

背景技术

[0002] 褐飞虱(Nilaparvata lugens  Stal)属于同翅目(Homoptera)飞虱科(Delphacidae)，广泛分布于南亚、东南亚、太平洋岛屿及日本、朝鲜和澳大利亚等地。褐飞虱具有远距离迁飞习性，中国各主要稻区均有分布，是目前影响我国水稻稳产、高产的主要虫害之一。培育抗虫品种是提高水稻抗虫性的有效途径，也是最经济、有效和安全的防治手段。抗褐飞虱种质资源鉴定与评价是水稻抗褐飞虱品种培育的基础，而新组合、新品种抗性鉴定及抗性展示是其审定、推广和应用的窗口。

[0003] 现有的田间自然鉴定圃，易受虫害发生的时期和虫口密度的影响，年度间波动性大，造成鉴定结果的不准确性，体现不出参试材料的真实抗性水平。人工接虫鉴定则相对稳定和可靠，它包括苗期鉴定和成株期鉴定。目前关于水稻褐飞虱抗性鉴定的工作主要集中在苗期，而生产上水稻褐飞虱的为害多发生在成株期，并且尚无研究表明水稻在苗期和成株期对褐飞虱具有一致的抗性。因此，水稻成株期褐飞虱抗性鉴定与展示观摩，更有利于大田生产的指导。

[0004] 水稻成株期对褐飞虱的抗性鉴定存在鉴定效率低和鉴定结果可靠性差等问题，在抗性育种中应用和推广进程缓慢。部分鉴定方法，如稻桩鉴定法，一种水稻成株期对褐飞虱抗性规模化精准鉴定技术，它是基于鉴定稻桩上单个分蘖来评价水稻植株的抗性，而水稻单个分蘖与整株在生长等方面是有差异的，剥离分蘖的过程中也会对植株造成损伤，这种情况下单个分蘖的鉴定结果很难体现整株的抗性水平。另外一种单株鉴定法，它是基于播种后移栽钵盆留单株进行抗虫性评价，每个钵盆需要单独组装支架和罩网，适宜于在大棚、人工气候室等场地进行，不能展现出鉴定材料在田间地头的群体抗性水平。因此，解决田间水稻群体水平成株期高效、精准鉴定与展示技术问题具有重要的实际意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提出一种利用抗性基因分子标记检测大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法，结果发现，利用抗性基因分子标记检测结果与田间套笼接虫鉴定抗性级别相吻合，形成了简化版的技术流程，按照本方法，该技术行之有效，其结果准确可靠。

[0006] 本发明的技术方案是这样实现的：

[0007] 本发明提供一种大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法，包括以下步骤：

[0008] S1.感虫品种TN1，浸种、催芽，播种后，20‑30天秧龄带药移栽，双本插种后10‑30天，罩上100‑150目尼龙网罩，人工接入褐飞虱怀卵雌成虫进行虫源批量饲养；

[0009] S2.鉴定材料和对照品种浸种、催芽，播种后，20‑30天秧龄时，带药移栽，单本插种，小区间交叉排布，田间正常水肥管理；

[0010] S3.分蘖盛期每4‑5份材料小区，罩上100‑150目尼龙网罩，人工接入褐飞虱虫源，田间正常水肥管理，整个生长季，试验小区内不施用农药；

[0011] S4.感虫对照小区植株被取食致死率达90％时，调查各试验小区材料的死亡情况，统计每份鉴定材料的植株死亡率；

[0012] S5.对每份鉴定材料叶片取样，提取DNA，采用已知抗性基因分子标记检测鉴定材料是否携带有抗褐飞虱基因，根据每份鉴定材料的植株死亡率判断基因鉴定评价结果的准确性。

[0013] 分蘖盛期为全田有50％的植株发生分蘖的时期，大致的时间段为移栽后的45‑55天。

[0014] 作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述浸种条件为20‑30℃浸种44‑52h，催芽条件为25‑30℃恒温催芽24‑48h。

[0015] 作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述带药移栽的行距和株距各15‑25cm；所述双本插种为6丛×6行。

[0016] 作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述尼龙网罩长宽高尺寸 1‑2m×1‑2m×1‑2m，单侧拉链门或双向拉链门，每个套笼接入250‑350 头怀卵雌成虫。

[0017] 作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述浸种条件为20‑30℃浸种44‑52h，催芽条件为25‑30℃恒温催芽24‑48h。

[0018] 作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述带药移栽的行距和株距各15‑25cm；所述单本插种为5丛×6行。

[0019] 作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述尼龙网罩长宽高尺寸 1‑5m×1‑2m×1‑2m，单侧拉链门或双向拉链门，每30株材料均匀接入 250‑350对初羽化的褐飞虱雌雄虫，以及1000‑1400头2‑3龄褐飞虱若虫。

[0020] 作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述抗褐飞虱基因包括 Bph3、Bph14、Bph15、Bph27。

[0021] 作为本发明的进一步改进，所述Bph3基因的标记检测引物序列的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0022] 作为本发明的进一步改进，所述Bph14基因的标记检测引物序列的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

[0023] 作为本发明的进一步改进，所述Bph15基因的标记检测引物序列的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

[0024] 作为本发明的进一步改进，所述Bph27基因的标记检测引物序列的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

[0025] 本发明具有如下有益效果：本发明获得了一种利用抗性基因分子标记检测大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法，结果发现，利用抗性基因分子标记检测结果与田间套笼接虫鉴定抗性级别相吻合，形成了简化版的技术流程。采用本方法，能够展示出水稻材料在大田成株期的群体抗性水平，该技术行之有效，其结果准确可靠。

附图说明

[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0027] 图1为本发明一种大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定方法的流程示意图。

具体实施方式

[0028] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0029] 实施例1 一种大田成株期水稻褐飞虱抗性鉴定试验

[0030] 一、供试材料

[0031] 1.感虫对照的水稻品种

[0032] 台中本地1号(TN1)，感虫。

[0033] 2.鉴定材料的水稻品种/组合

[0034] 湘两优900(超优千号，生产对照)，丰两优四号(生产对照)，晶两优华占(生产对照)，华智1S/智18，泰丰优智18，晶两优智 903，晶两优智924。

[0035] 3.褐飞虱虫源

[0036] 湖南长沙春华田间采集的自然种群，经过2个世代的饲养后获得的虫源，室内养虫笼TN1植株上饲养保存。

[0037] 二、试验方法

[0038] 1.褐飞虱虫源批量饲养

[0039] 试验地点位于湖南省长沙市春华镇，华智生物技术有限公司水稻试验基地(28°18′N，113°18′E)。

[0040] 2021年5月初，取健壮的水稻种子台中本地1号(TN1，感虫)，室温浸种48h，期间换水2‑3次；于28℃恒温箱催芽36h后，均匀撒播于秧田苗床。6月初，按照行距和株距各20cm，进行带药移栽，双本插种(6丛×6行)，获得多个小区TN1养虫苗。6月底，TN1各小区罩上120目白色透明尼龙网罩(长宽高尺寸1.5m×1.5m×1.5m，单侧拉链门)，每个套笼接褐飞虱怀卵雌成虫300头进行产卵繁殖。当套笼内的TN1苗被取食死亡率超过50％时，及时补充移栽另外一批 TN1苗，不间断饲养。田间正常水肥管理，在TN1上饲养繁殖得到足够量种群备用。

[0041] 2.鉴定材料播种及单本移栽

[0042] 选择排灌方便且肥力均匀的田块作为水稻褐飞虱抗性展示区。 2021年5月下旬，取鉴定水稻材料，室温浸种48h，期间换水2‑3 次；于28℃恒温箱催芽36h后，分别播种于秧田苗床。25天秧龄时，按照行距和株距各20cm，进行带药移栽，每份材料单本插种30株 (5丛×6行)。对照品种与新组合材料，小区间交叉排布。田间正常水肥管理。

[0043] 3.分蘖盛期人工套笼及接虫

[0044] 分蘖盛期(7月底‑8月初)，每4‑5份材料小区，罩上一个120 目白色透明尼龙网罩(长宽高尺寸5m×2m×1.5m，双向拉链门)，向参试材料小区中开始人工接入褐飞虱虫源。用虫量为每30株材料均匀接入300对初羽化的褐飞虱雌雄虫，以及1200头2‑3龄褐飞虱若虫。接入虫源后，田间正常水肥管理，并且整个生长季，试验小区内均不施用任何农药。

[0045] 4.植株死亡率调查及抗性评价

[0046] 感虫对照小区TN1植株被取食致死率达90％时，调查各小区材料的死亡情况，统计每份参试材料的植株死亡率。参照“水稻田间抗虫性鉴定评价标准”(DB42/T 1376‑2018湖北省地方标准：水稻抗褐飞虱抗性鉴定技术规程)，基于参试材料的植株死亡率，评价参试材料成株期对褐飞虱的抗性。

[0047] 人工喷施杀虫剂，灭除褐飞虱虫源。两日后，揭开展示区套笼。

[0048] 5.抗性基因分子标记检测验证

[0049] 对每份参试材料叶片取样，采用CTAB法进行水稻叶片基因组DNA 提取。采用已知抗性基因分子标记检测参试材料是否携带有抗褐飞虱基因，标记检测引物序列如表1所示。

[0050] 表1 抗褐飞虱基因标记检测引物序列

[0051]

[0052] 结果如下。

[0053] 1.褐飞虱虫源饲养种群数量的评估

[0054] 同一批次里，随机挑选三个虫源饲养套笼，对褐飞虱2‑3龄若虫 和羽化后成虫种群数量进行评估。每个套笼中，随机抽查5丛TN1 养虫苗，统计每丛苗上2‑3龄若虫的数量，根据最小值和最大值估算 整个套笼中2‑3龄若虫种群的数量。继续饲养至成虫羽化后，采用同 样的方法估算每个套笼中成虫种群的数量。

[0055] 统计结果显示(表2)，同一个饲养批次里，平均每个套笼可提供5208‑5592头褐飞虱2‑3龄若虫，或者是4464‑4752头羽化后的成虫。

[0056] 表2 褐飞虱虫源饲养种群数量

[0057]

[0058]

[0059] 2.参展材料植株死亡率调查及抗性评价

[0060] 参展材料大田成株期褐飞虱抗性表型鉴定结果，如表3所示。感 虫对照品种TN1植株死亡率达90.0％，受害级别为9级，高感，抗性 展示评价体系有效；鉴定材料品种超优千号、丰两优四号和晶两优华 占，其植株死亡率变化范围均在54.2％‑62.5％之间，受害级别为7级， 感虫；华智1S/智18、泰丰优智18、晶两优智903和晶两优智924， 其植株死亡率变化范围均在3.3％‑6.7％之间，受害级别为1级，高抗。

[0061] 表3 参展材料成株期褐飞虱抗性及分子检测

[0062]

[0063]

[0064] 备注：“+”表示含有抗虫基因标记，“‑”表示不含有抗虫基因标记。

[0065] 3.参展材料抗褐飞虱基因分子标记检测

[0066] 参展材料抗褐飞虱基因分子标记检测结果显示(表3)，感虫对照品种TN1和超优千号、丰两优四号、晶两优华占，均未扩增出对应的目标片段，即不含有抗褐飞虱目标基因或者同源基因；1S/智18和泰丰优智18，携带有抗虫基因Bph3和Bph27，或者其同源基因；晶两优智903和晶两优智924，携带有抗虫基因Bph14和Bph15，或者其同源基因。由此结果说明，利用抗性基因分子标记检测结果与田间套笼接虫鉴定抗性级别相吻合。

[0067] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。