一种贝莱斯芽孢杆菌、悬浮液及制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202210011004.4
文献号 : CN114276965B
文献日 : 2022-11-04
发明人 : 张涛 , 申顺善 , 朴凤植 , 孙凯乐 , 王永 , 孟更 , 马肖静 , 欧阳兆鹏 , 邓磊
申请人 : 河南农业大学
摘要 :
本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌，为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Bv‑HR6‑1，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.14469。本发明还提供一种贝莱斯芽孢杆菌悬浮液，制备步骤包括从水稻根际分离、筛分出来的革兰式阳性菌作为菌种，经培养基培养、离心处理，获得贝莱斯芽孢杆菌的菌体；采用无菌硫酸镁溶液分散贝莱斯芽孢杆菌的菌体，获得贝莱斯芽孢杆菌悬浮液。该贝莱斯芽孢杆菌可用于配制改良土壤的微生物菌剂，尤其是治理土壤次生盐渍化和重金属污染的微生物菌剂。该微生物菌剂能提高植物免疫能力和调节土壤微生态。
权利要求 :
1.一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，它为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Bv‑HR6‑1，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.14469。
2.一种贝莱斯芽孢杆菌悬浮液，其特征在于，它包括无菌硫酸镁溶液和均匀分散在该无菌硫酸镁溶液中的权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的菌体。
3.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌悬
7 9
浮液的浓度为2×10 CFU/mL～2×10 CFU/mL。
4.一种权利要求2或3所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的制备方法，其步骤包括：将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌菌种接种到培养基上，并在28℃～32℃发酵培养
36h～50 h，得到贝莱斯芽孢杆菌发酵液；对所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液进行离心处理，得到贝莱斯芽孢杆菌的菌体；采用0.05mol/L 0.1mol/L的无菌硫酸镁溶液分散所述贝莱斯芽~孢杆菌的菌体，获得所述贝莱斯芽孢杆菌悬浮液。
5.一种权利要求2或3所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌悬浮液用于治理土壤次生盐渍化和重金属污染。
6.一种权利要求2或3所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的使用方法，包括植物移栽时利用所述贝莱斯芽孢杆菌悬浮液进行浸根处理，和/或在植物移栽后20天之内利用所述贝莱斯芽孢杆菌悬浮液对植物进行灌注处理。
说明书 :
一种贝莱斯芽孢杆菌、悬浮液及制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一种贝莱斯芽孢杆菌、悬浮液及制 备方法和应用。
背景技术
[0002] 随着工业和矿业的快速发展，以及污灌和污泥滥用，农药化肥不合理 施用，化石类燃料和农用薄膜的不完全燃烧等一系列原因，使得重金属污 染已呈日趋严重，对生态环境和人体健康造成了极大的威胁。此外，重金 属污染还将导致土壤退化，农作物歉收，并且可能通过食物链影响人类的 生命安全。因此，对重金属污染土壤的治理和修复，任务十分紧迫。
[0003] 植物根际促生菌株(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，简称PGPR) 是指存在于植物根际环境中，通过产生植物激素、溶解无机磷等直接作用 和竞争生态位、诱导植物系统抗性等间接作用促进植物生长的一类有益菌 株。近年来大量研究表明，PGPR菌株能在植物根系及根际土壤有效定殖， 具有显著的促生、防病和增产效果、同时调节植物根际土壤微生态环境、 缓解生态污染等特性，成为有机生态农业可持续发展的有效途径之一，应 用前景十分广阔。而利用植物根际有益PGPR菌株缓解土壤次生盐渍化和 重金属污染，提高产量和品质，提高植物免疫能力，并调节土壤微生态是 农业可持续发展的新途径。
发明内容
[0004] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种贝莱斯芽孢杆菌， 它为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Bv‑HR6‑1，保藏于“中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.14469。保藏日期 为2017年07月27日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国 科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
[0005] 基于上述，所述贝莱斯芽孢杆菌是由水稻根际分离、筛分出来的革兰 式阳性菌菌种，经培养基发酵培养得到的。
[0006] 基于上述，所述贝莱斯芽孢杆菌的生长温度范围为4℃～50℃，所述 贝莱斯芽孢杆菌的生长pH值为6.5～7.5。
[0007] 基于上述，所述培养基为蛋白胨培养基。
[0008] 本发明还提供一种贝莱斯芽孢杆菌悬浮液，包括无菌硫酸镁溶液和均匀 分散在该无菌硫酸镁溶液中贝莱斯芽孢杆菌的菌体。
[0009] 基于上述，所述贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的浓度为2×107CFU/mL～ 2×109CFU/mL。
[0010] 本发明还提供一种制备贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的方法，其步骤包括：
[0011] 从水稻根际分离、筛分出来的革兰式阳性菌作为菌种，经培养基培养得 到贝莱斯芽孢杆菌菌种；
[0012] 将贝莱斯芽孢杆菌菌种接种到培养基上，并在28℃～32℃发酵培养 36h～50h，得到贝莱斯芽孢杆菌发酵液；对所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液进 行离心处理，得到贝莱斯芽孢杆菌的菌体；采用0.05mol/L～0.1mol/L的无 菌硫酸镁溶液分散所述贝莱斯芽孢杆菌的菌体，获得所述贝莱斯芽孢杆菌 悬浮液。
[0013] 本发明还提供一种所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的应用，所述贝莱斯芽 孢杆菌悬浮液可用于治理土壤次生盐渍化和重金属污染。
[0014] 本发明还提供一种所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的使用方法，包括植 物移栽时利用所述贝莱斯芽孢杆菌悬浮液进行浸根处理，和/或在植物移栽 后20天之内利用所述贝莱斯芽孢杆菌悬浮液对植物进行灌注处理。
[0015] 本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Bv‑HR6‑1菌株具有以 下生物学特性：
[0016] 如图11和图12所示，本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Bv‑HR6‑1菌株是从水稻根际分离的革兰式阳性菌。菌体直杆状，NA培养基 上菌落呈不规则形，表面扁平干燥，边缘呈小锯齿状，不透明，不产生色素。 该菌株的生长温度范围为4℃～50℃，最适生长温度为30℃，最适宜的pH值 为6.5‑7.5，最高耐盐度为10％。明胶液化、淀粉水解、柠檬酸盐利用、过氧 化氢酶、硫化氢产生试验、硝酸盐还原和V‑P测定为阳性，葡糖糖氧化发酵 为发酵型。该菌16S rDNA序列全长为1428bp，与Bacillus velezensis(贝莱 斯芽孢杆菌)的16S rDNA序列相似性达到99％。
[0017] 本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Bv‑HR6‑1悬浮液在番 茄等蔬菜生长过程中在植物根际具有良好的定殖能力，能对土壤中的镉、 铅、铜等具有降解功效。
[0018] 通过试验对比表明，添加了该贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Bv‑HR6‑1悬浮液的育苗基质进行蔬菜育苗时，在叶片数、SPAD值(叶绿素 含量相对值)、茎粗、株高等指标均大于添加镉、铅、铜胁迫的对照组。
[0019] 因此，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Bv‑HR6‑1悬浮 液具有良好的缓解蔬菜根际土壤中的镉、铅、铜的危害程度，调节蔬菜根 际土壤微生态以促进植株生长，并显著提高根系活力，有利于提高产量。
[0020] 另外，通过实验表明，添加了2×109CFU/mL的Bv‑HR6‑1菌悬液的 番茄幼苗，在植株鲜重和植株干重均大于只添加清水的空白对照。
[0021] 而同时添加Bv‑HR6‑1悬浮液和NaCl的试验组中的番茄幼苗，无论是 在株高、生物量、SPAD值、QY(最大光量子效率)、MDA(丙二醛)、相 对电导率以及SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)、CAT(过氧 化氢酶)等抗氧化保护酶活性均比只添加NaCl的试验组明显得到了改善。 由此说明，该贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Bv‑HR6‑1悬浮液对土壤中 的盐胁迫具有缓解功效。
附图说明
[0022] 图1为镉胁迫及加菌对番茄幼苗生长趋势茎粗、叶片及株高影响结果。
[0023] 图2为铅胁迫及加菌对番茄幼苗生长趋势茎粗、叶片及株高影响结果。
[0024] 图3为铜胁迫及加菌对番茄幼苗生长趋势茎粗、叶片及株高影响结果。
[0025] 图4为施菌处理对镉胁迫下不同时期番茄叶绿素含量的影响。
[0026] 图5为施菌处理对铅胁迫下不同时期番茄叶绿素含量的影响。
[0027] 图6为施菌处理对铜胁迫下不同时期番茄叶绿素含量的影响。
[0028] 图7为施菌处理对铜、铅、镉等胁迫下番茄茎粗的影响。
[0029] 图8为施菌处理对铜、铅、镉等胁迫下番茄叶片的影响。
[0030] 图9为施菌处理对铜、铅、镉等胁迫下番茄株高的影响。
[0031] 图10为盐胁迫及加菌对番茄幼苗生长影响。
[0032] 图11为Bv‑HR6‑1的系统发育树。
[0033] 图12为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Bv‑HR6‑1菌落 图。
具体实施方式
[0034] 下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
[0035] 本实施例提供一种贝莱斯芽孢杆菌，它为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Bv‑HR6‑1，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心”，保藏号为CGMCC No.14469。
[0036] 所述贝莱斯芽孢杆菌是由水稻根际分离、筛分出来的革兰式阳性菌菌 种，经蛋白胨培养基发酵培养得到的。
[0037] 所述贝莱斯芽孢杆菌的生长温度范围为4℃～50℃，所述贝莱斯芽孢 杆菌的生长pH值为6.5～7.5。
[0038] 本实施例提供一种贝莱斯芽孢杆菌悬浮液，包括无菌硫酸镁溶液和均 匀分散在该无菌硫酸镁溶液中的所述贝莱斯芽孢杆菌的菌体。
[0039] 本实施例中，所述贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的浓度为2×107CFU/mL～ 2×109CFU/mL。
[0040] 本实施例还提供一种所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的制备方法，其步 骤包括：
[0041] 从水稻根际分离、筛分出来的革兰式阳性菌作为菌种，经培养基培养得 到贝莱斯芽孢杆菌菌种；
[0042] 将贝莱斯芽孢杆菌菌种接种到培养基上，并在28℃～32℃发酵培养36 h～50h，得到贝莱斯芽孢杆菌发酵液；对所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液进行 离心处理，得到贝莱斯芽孢杆菌的菌体；采用0.05mol/L～0.1mol/L的无菌 硫酸镁溶液溶解所述贝莱斯芽孢杆菌的菌体，获得所述贝莱斯芽孢杆菌悬 浮液。
[0043] 本实施例还提供一种所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的应用，所述贝莱斯 芽孢杆菌悬浮液可用于治理土壤次生盐渍化和重金属污染。
[0044] 本实施例还提供一种所述的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液的使用方法，包括 植物移栽时利用该贝莱斯芽孢杆菌悬浮液进行浸根处理，和/或在植物移栽 后20天之内利用该贝莱斯芽孢杆菌悬浮液进行灌注处理。
[0045] 试验验证
[0046] 对本实施例制得的贝莱斯芽孢杆菌悬浮液进行缓解铜、铅、镉重金属 试验和耐盐试验，试验效果如下：
[0047] 缓解铜、铅、镉重金属试验：
[0048] 试验原材料：
[0049] 供试番茄(粉都热美)购于河南豫艺种业科技发展有限公司，试验在 河南农业大学科教园区试验大棚进行。
[0050] 供试土壤取自南农业大学科教园区，土壤类型为潮土。土壤基本理化 性质如表1。
[0051] 表1、土壤基本理化性质
[0052]
[0053] 土壤处理：将所取土壤样品风干，充分搅拌混匀，过2mm筛，向供试 土壤添加外源‑1 ‑1 ‑1Cu、Pb、Cd，处理浓度分别为150mg·kg 、500mg·kg 、8 mg·kg 。
[0054] 溶解后均匀施于土壤，风干装入PVC盆(直径10cm，高度15cm)， 每盆装土1.5kg，加水至田间持水量的80％，将塑料盆埋至3/4处，培养2 周。其中，Cu、Pb、Cd分别由CuCl2·2H2O、Pb(CH3COO)2·3H2O和CdCl2·2.5 H2O提供。
[0055] 试验方法：
[0056] 将番茄种子进行穴盘育苗，选择生长一致的两叶一心幼苗移植到装有蛭 石的试验盆中。将幼苗在气候室中培养，温度为28℃/18℃(白天/黑夜)， 光周期为14h/10h(白天/黑夜)。待番茄幼苗长至4片真叶时，选出长势一 致的番茄幼苗进行移栽，每盆1株。
[0057] 试验共设计6个试验组，分别为铜、铅、镉、悬浮液(Bv‑HR6‑1)+铜、 悬浮液(Bv‑HR6‑1)+铅、悬浮液(Bv‑HR6‑1)+镉。
[0058] 其中每个试验组30株番茄幼苗，悬浮液(Bv‑HR6‑1)浓度为2×109 CFU/ml，带菌处理的营养钵每个浇灌15ml。
[0059] 栽培后第6天(6月17号)、8天(6月19号)、10天(6月21号)、 12天(6月23号)、14天(6月25号)测一次叶绿素(叶绿素生长点下数 第三片叶)，14天(6月25号)测一次株高、茎粗、叶片数。
[0060] 其中，试验过程中，追肥采用霍格兰营养液配方：硝酸钾404克、四水 硝酸钙590克、七水硫酸镁246克、磷酸二氢钾136克、鳌合铁EDTA‑‑2NaFe 20克、硼酸2.86克、硫酸锰2.13克、硫酸锌0.22克、硫酸铜0.08克、钼酸 铵0.02克，追肥4天一次。
[0061] 番茄幼苗生长结果如图1至图3所示，从图中可以看出：添加了贝莱斯 芽孢杆菌Bv‑HR6‑1悬浮液的番茄幼苗无论是在株高、叶片数、茎粗等方面 均大于只添加清水的空白对照组。
[0062] 具体地，从图1、图4、图7、图8、图9中可以看出，添加了贝莱斯芽 孢杆菌Bv‑HR6‑1悬浮液+镉的试验组中，番茄幼苗无论是在株高、叶片数、 茎粗、SPAD值等方面均大于只添加镉的试验组。由此可以说明，该贝莱斯芽 孢杆菌Bv‑HR6‑1悬浮液对土壤中的镉具有降解功效。
[0063] 从图2、图5、图8、图9中可以看出，添加了贝莱斯芽孢杆菌Bv‑HR6‑1 悬浮液+铅的试验组中，番茄幼苗无论是在株高、叶片数、SPAD值等方面均 大于只添加铅的试验组。由此可以说明，该贝莱斯芽孢杆菌Bv‑HR6‑1悬浮 液对土壤中的铅具有降解功效。
[0064] 从图3、图6、图7、图8、图9中可以看出，添加了贝莱斯芽孢杆菌Bv‑HR6‑1 悬浮液+铜的试验组中，番茄幼苗无论是在株高、叶片数、SPAD值、茎粗等 方面均大于只添加铜的试验组。由此可以说明，该贝莱斯芽孢杆菌Bv‑HR6‑1 悬浮液对土壤中的铜具有降解功效。
[0065] 耐盐试验：
[0066] 利用盆栽实验研究贝莱斯芽孢杆菌Bv‑HR6‑1悬浮液对盐胁迫下植物 幼苗的生长的影响。
[0067] 从未施加过Bv‑HR6‑1菌剂的大田中取土，加入营养钵中，每个营养 钵杯中加入基质约130g。播种番茄种子，进行施加贝莱斯芽孢杆菌 Bv‑HR6‑1悬浮液处理和NaCl胁迫处理，分别设置对照组。NaCl处理2 周后，检测番茄幼苗的存活率、株高、鲜重等。
[0068] 盆栽试验具体设计如下。
[0069] (1)Bv‑HR6‑1菌的施加方法。
[0070] 耐盐试验中，Bv‑HR6‑1菌使用浇灌方式进行施加。
[0071] 具体地，播种相同数量的番茄种子，番茄幼苗长出2个真叶后，分别 向营养钵中加入15mL利用稀释至不同浓度的Bv‑HR6‑1悬浮液进行浇灌 处理，每营养钵1株，共60株，分别用于仅添加Bv‑HR6‑1悬浮液试验组 和同时添加Bv‑HR6‑1悬浮液与NaCl胁迫处理的试验组。
[0072] 其中Bv‑HR6‑1菌悬液的浓度为2×107CFU/ml、2×108CFU/ml、2× 109CFU/ml。
[0073] (2)NaCl胁迫处理方法。
[0074] 采用Bv‑HR6‑1悬浮液处理后，番茄幼苗长至三四片真叶时，用15ml 200mmol/L NaCl处理番茄幼苗，2至3天处理1次，共处理3次，株高 和鲜重NaCl处理完2周后，测定幼苗的株高和鲜重。
[0075] 上述盆栽番茄幼苗用NaCl处理2周后，检测番茄幼苗的耐盐生理生 化反应，包括叶绿素含量相对值(SPAD)、最大光量子效率(QY)、相 对电导率、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD) 和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化保护酶活性。
[0076] 试验结果如图10以及表2和表3所示。从图10中可以看出：添加了不 同浓度的Bv‑HR6‑1悬浮液的番茄幼苗无论是在叶片数、株高、茎粗等方面 均大于只添加NaCl的处理组。
[0077] 同时，从表2和表3中可以看出，不同浓度2×107CFU/ml、2×108 CFU/ml、2×9
10CFU/ml的Bv‑HR6‑1菌悬液培养的番茄幼苗的株高、干 重和鲜重也存在区别。Bv‑HR6‑1菌悬液的浓度越高，番茄幼苗的株高、干 重和鲜重越大。说明Bv‑HR6‑1菌悬液能促进番茄幼苗的生长。
10CFU/ml的Bv‑HR6‑1菌悬液培养的番茄幼苗的株高、干 重和鲜重也存在区别。Bv‑HR6‑1菌悬液的浓度越高，番茄幼苗的株高、干 重和鲜重越大。说明Bv‑HR6‑1菌悬液能促进番茄幼苗的生长。
[0078] 进一步的，从试验结果中还可以看出，同时添加了Bv‑HR6‑1悬浮液处 理和NaCl的试验组中，番茄幼苗无论是在株高、植株鲜重、植株干重均比 只添加NaCl的试验组显著增加；并且提高了SPAD值、QY以及抗氧化保 护酶(SOD、POD、CAT)活性，降低了MDA、相对电导率，减轻了盐胁 迫下自由基对细胞膜伤害程度，促进了植株生长。
[0079] 由此说明，该贝莱斯芽孢杆菌Bv‑HR6‑1悬浮液对土壤中的盐胁迫具有 缓解功效。
[0080] 表2、不同浓度Bv‑HR6‑1悬浮液和NaCl处理对番茄幼苗的生长影响[0081] 处理 株高(cm) 鲜重(g) 干重(g) SPAD QYCK(水) 29.23±1.05a 27.70±1.48ab 1.97±0.08b 59.02±0.35a 0.78
7
J10 23.97±0.73c 24.50±1.86bcd 2.02±0.17b 54.27±1.23a 0.77
8
J10 25.93±0.59bc 25.49±0.91bc 2.12±0.10b 54.73±0.28a 0.78
9
J10 27.8±0.87ab 32.79±1.31a 2.62±0.13a 57.77±1.54a 0.78
± 13.2±0.35f 11.80±0.68f 0.94±0.08d 48.47±0.38b 0.76
7
J10+盐 16.3±0.25e 15.88±0.95ef 1.37±0.10cd 54.23±3.21a 0.76
8
J10+盐 19.93±0.70d 19.37±1.32de 1.61±0.11bc 54.83±1.13a 0.78
9
J10+盐 20.27±1.12d 20.41±1.27cde 1.83±0.03bc 58.23±1.26a 0.78
7
J10 23.97±0.73c 24.50±1.86bcd 2.02±0.17b 54.27±1.23a 0.77
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J10 25.93±0.59bc 25.49±0.91bc 2.12±0.10b 54.73±0.28a 0.78
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J10 27.8±0.87ab 32.79±1.31a 2.62±0.13a 57.77±1.54a 0.78
± 13.2±0.35f 11.80±0.68f 0.94±0.08d 48.47±0.38b 0.76
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J10+盐 16.3±0.25e 15.88±0.95ef 1.37±0.10cd 54.23±3.21a 0.76
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J10+盐 19.93±0.70d 19.37±1.32de 1.61±0.11bc 54.83±1.13a 0.78
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J10+盐 20.27±1.12d 20.41±1.27cde 1.83±0.03bc 58.23±1.26a 0.78
[0082] 其中，盐为200mmol/L NaCl；J107、J108、J109分别为用2×107 CFU/mL、2×108CFU/9
mL、2×10CFU/mL的Bv‑HR6‑1菌液进行浸种处 理。
mL、2×10CFU/mL的Bv‑HR6‑1菌液进行浸种处 理。
[0083] 表3、不同浓度Bv‑HR6‑1菌和NaCl处理对番茄幼苗生理生化指标的影响[0084]
[0085] 其中，盐为200mmol/L NaCl；J107、J108、J109分别为用2×107 CFU/mL、2×108CFU/9
mL、2×10CFU/mL的Bv‑HR6‑1菌液进行浸种处 理。
mL、2×10CFU/mL的Bv‑HR6‑1菌液进行浸种处 理。
[0086] 最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对 其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通 技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分 技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本 发明请求保护的技术方案范围当中。