一种纳米模拟酶材料及其制备方法和应用、检测卵类粘蛋白的方法

摘要

本发明涉及生物传感检测技术领域，尤其涉及一种纳米模拟酶材料及其制备方法和应用、检测卵类粘蛋白的方法。本发明提供了一种纳米模拟酶材料，包括过氧化铜和与所述过氧化铜化学结合的3‑氨基苯硼酸。本发明所述的纳米模拟酶材料中的过氧化铜具有超高酶活性，以改善光化学信号的产生；3‑氨基苯硼酸能够特异性地与卵类粘蛋白糖链上的邻二醇结合；且所述3‑氨基苯硼酸能够使过氧化铜分散性更好，催化活性位点增多，不仅起到了特异性结合目标分子(卵类粘蛋白)的作用，并且使紫外可见光信号放大，充分的发挥了其作为探针材料的优良性能。

权利要求

1.一种检测卵类粘蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：在酶标板上依次涂覆和孵育卵类粘蛋白抗体溶液、依次涂覆和孵育牛血清蛋白溶液和依次涂覆和孵育待测卵类粘蛋白溶液后，涂覆纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的混合液，最后在反应底物中进行反应，得到待测夹心型生物免疫传感器；所述纳米模拟酶材料溶液中的纳米模拟酶材料包括过氧化铜和与所述过氧化铜化学结合的3‑氨基苯硼酸；所述反应底物为2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液，或3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液；所述纳米模拟酶材料通过将过氧化铜、3‑氨基苯硼酸和水混合，进行配位制得；

对所述待测夹心型生物免疫传感器进行紫外吸光度测试，根据得到的吸光度和预定的标准曲线，得到所述待测卵类粘蛋白溶液中卵类粘蛋白的浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过氧化铜和3‑氨基苯硼酸的质量比为（1

2）：（1 2）。

~ ~

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的线性范围0.0000316 100ng/~mL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述反应底物为2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液时，所述吸光度测试的扫描波长为400 700nm；

~

当所述反应底物为3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液时，所述吸光度测试的扫描波长为500 800nm；

~

当所述反应底物为2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液时，所述反应的温度为50 60℃，时间为20 30min；

~ ~

当所述反应底物为3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液时，所述反应的温度为30 37℃，时间为15 20min。

~ ~

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述卵类粘蛋白抗体溶液的浓度为0.5 1μg/~mL；

所述牛血清蛋白溶液的质量浓度为1 2%。

~

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米模拟酶材料溶液的浓度为0.5 1mg/~mL；所述PBS缓冲液的浓度为0.1mol/mL，pH值为9.6；

所述纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的体积比为1:1；

所述2,4‑二氯苯酚溶液和4‑氨基安替比林溶液的浓度独立的为0.5 1mg/mL；所述MES~缓冲液的pH值为6.8；

所述2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液中2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的体积比为1:1:3。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液的浓度为

10 20mmol/L，所述双氧水的浓度为90 100mmol/L，所述醋酸缓冲液的pH值为4.5；

~ ~

所述3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液中3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的体积比为1:1:3。

说明书

一种纳米模拟酶材料及其制备方法和应用、检测卵类粘蛋白

的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物传感检测技术领域，尤其涉及一种纳米模拟酶材料及其制备方法和应用、检测卵类粘蛋白的方法。

背景技术

[0002] 食物过敏是指人体摄入某种特定的食物后在体内发生的一种特异性的免疫反应。近年来，食物过敏患者日益增多，过敏症发病率也呈逐年上升的趋势。在过敏反应中，有
90％以上都是由八类食物引起的，这些食物分别为蛋类、花生、乳类、黄豆、小麦、树果仁、贝类和鱼等。其中鸡蛋是引发过敏反应最常见的食物之一。鸡蛋中的蛋白质因其独特的加工特性，如蛋清蛋白质的起泡性、乳化性、加热稳定性以及粘合性等，已在生食品行业中广泛应用，而卵类粘蛋白作为鸡蛋中的主要过敏原性蛋白质引起人们的广泛关注。

[0003] 卵类粘蛋白(OM)是一种糖基化程度超过30％的高分子量硫酸酯糖蛋白。含有O‑糖苷键连接的糖链，这些糖链与水形成广泛的氢键，形成凝胶样结构，使蛋清粘稠。OM约占蛋清蛋白总量的11％，由186个氨基酸组成，包含20％～25％的糖基组分，这些糖基组分在卵类粘蛋白的胰蛋白酶抑制活性和过敏原性中发挥着重要作用。因此，对于卵类粘蛋白的检测具有非常重要的研究意义。

[0004] 传统的检测OM的方法有荧光法和ELSA，荧光法是通过设计并合成荧光探针，用荧光分光光度计进行荧光定量；ELSA即酶联免疫吸附测定法，此方法可以直接使用与卵类粘蛋白发生特异反应的抗体捕获所述卵类粘蛋白，并通过携带探针的抗体进行显色测定，但荧光探针易受干扰，定量较难，影响ELSA法的检测灵敏度。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种纳米模拟酶材料及其制备方法和应用、检测卵类粘蛋白的方法，所述纳米模拟酶材料与卵类粘蛋白能够特异性结合，同时具有较高的检测灵敏度。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种纳米模拟酶材料，包括过氧化铜和与所述过氧化铜化学结合的3‑氨基苯硼酸。

[0008] 优选的，所述过氧化铜和3‑氨基苯硼酸的质量比为(1～2)：(1～2)。

[0009] 本发明还提供了上述技术方案所述的纳米模拟酶材料的制备方法，包括以下步骤：

[0010] 将过氧化铜、3‑氨基苯硼酸和水混合，进行配位，得到所述纳米模拟酶材料。

[0011] 本发明还提供了上述技术方案所述的纳米模拟酶材料或上述技术方案所述的制备方法制备得到的纳米模拟酶材料在检测卵类粘蛋白中的应用。

[0012] 本发明还提供了一种检测卵类粘蛋白的方法，包括以下步骤：

[0013] 在酶标板上依次涂覆和孵育卵类粘蛋白抗体溶液、依次涂覆和孵育牛血清蛋白溶液和依次涂覆和孵育待测溶液后，涂覆纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的混合液，最后在反应底物中进行反应，得到待测夹心型生物免疫传感器；所述纳米模拟酶材料溶液中的纳米模拟酶材料为上述技术方案所述的纳米模拟酶材料；所述反应底物为2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液或3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液；

[0014] 对所述待测夹心型生物免疫传感器进行紫外吸光度测试，根据得到的吸光度和预定的标准曲线，得到所述待测卵类粘蛋白溶液中卵类粘蛋白的浓度。

[0015] 优选的，所述标准曲线的线性范围0.0000316～100ng/mL。

[0016] 优选的，当所述反应底物为2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液时，所述吸光度测试的扫描波长为400～700nm；

[0017] 当所述反应底物为3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液时，所述吸光度测试的扫描波长为500～800nm；

[0018] 当所述反应底物为2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液时，所述反应的温度为50～60℃，时间为20～30min；

[0019] 当所述反应底物为3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液时，所述反应的温度为30～37℃，时间为15～20min。

[0020] 优选的，所述卵类粘蛋白抗体溶液的浓度为0.5～1μg/mL；

[0021] 所述牛血清蛋白溶液的质量浓度为1～2％。

[0022] 优选的，所述纳米模拟酶材料溶液的浓度为0.5～1mg/mL；所述PBS缓冲液的浓度为0.1mol/mL，pH值为9.6；

[0023] 所述纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的混合液的体积比为1:1；

[0024] 所述2,4‑二氯苯酚溶液和4‑氨基安替比林溶液的浓度独立的为0.5～1mg/mL；所述MES缓冲液的pH值为6.8；

[0025] 所述2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液中2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的体积比为1:1:3。

[0026] 优选的，所述3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液的浓度为10～20mmol/L，所述双氧水的浓度为90～100mmol/L，所述醋酸缓冲液的pH值为4.5；

[0027] 所述3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液中3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的体积比为1:1:3。

[0028] 本发明提供了一种纳米模拟酶材料，包括过氧化铜和与所述过氧化铜化学结合的3‑氨基苯硼酸。本发明所述的纳米模拟酶材料中的过氧化铜具有超高酶活性，以改善光化学信号的产生；3‑氨基苯硼酸能够特异性地与卵类粘蛋白糖链上的邻二醇结合；且所述3‑氨基苯硼酸能够使过氧化铜分散性更好，催化活性位点增多，不仅起到了特异性结合目标分子(卵类粘蛋白)的作用，并且使紫外可见光信号放大，充分的发挥了其作为探针材料的优良性能。

[0029] 本发明还提供了一种检测卵类粘蛋白的方法，包括以下步骤：在酶标板上依次涂覆和孵育卵类粘蛋白抗体溶液、依次涂覆和孵育牛血清蛋白溶液和依次涂覆和孵育待测溶液后，涂覆纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的混合液，最后在反应底物中进行反应，得到待测夹心型生物免疫传感器；所述纳米模拟酶材料溶液中的纳米模拟酶材料为上述技术方案所述的纳米模拟酶材料；所述反应底物为2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液或3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液；对所述待测夹心型生物免疫传感器进行紫外吸光度测试，根据得到的吸光度和预定的标准曲线，得到所述待测卵类粘蛋白溶液中卵类粘蛋白的浓度。本发明所述的方法先在酶标板上涂覆并孵育卵类粘蛋白抗体，以实现特异性捕获卵类粘蛋白的目的，然后涂覆并孵育牛血清蛋白清除酶标板本身的剩余活性位点能够避免由于酶标板本身的活性位点对检测准确性的影响；同时，利用本发明所述的纳米模拟酶材料可以通过特异性识别卵类粘蛋白，并且其具备的酶活性使反应底物变色，进而可以作为优良的探针对卵类粘蛋白进行检测。同时所述检测方法具有较高的灵敏度、较宽的检测范围、较快的检测速度且操作简单。检测范围为0.0000316～100ng/mL，最低检测下限为0.032fg/mL。

附图说明

[0030] 图1为实施例1制备得到的过氧化铜和纳米模拟酶材料的TEM图；

[0031] 图2为实施例1制备得到的纳米模拟酶材料的TEM Mapping图；

[0032] 图3为实施例1测得在400～700nm波长范围内的吸光度曲线随卵类粘蛋白溶液浓度变化曲线和标准曲线；

[0033] 图4为实施例2测得在500～800nm波长范围内的吸光度曲线随卵类粘蛋白溶液浓度变化曲线和标准曲线；

[0034] 图5为实施例1制备得到的夹心型生物免疫传感器检测不同物质的吸光度柱形图。

具体实施方式

[0035] 本发明提供了一种纳米模拟酶材料，包括过氧化铜和与所述过氧化铜化学结合的3‑氨基苯硼酸。

[0036] 在本发明中，所述化学结合的形式优选为配位。

[0037] 在本发明中，所述过氧化铜和3‑氨基苯硼酸的质量比优选为(1～2)：(1～2)，更优选为1:1、2:1或1:2。

[0038] 本发明还提供了上述技术方案所述纳米模拟酶材料的制备方法，包括以下步骤：

[0039] 将过氧化铜、3‑氨基苯硼酸和水混合，进行配位，得到所述纳米模拟酶材料。

[0040] 在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。

[0041] 在本发明中，所述过氧化铜优选通过制备得到，所述过氧化铜的制备过程优选包括以下步骤：

[0042] 将0.05g聚乙烯吡咯烷酮、0.1g二水合氯化铜和5mL去离子水混合后，加入5mL浓度为0.02M的氢氧化钠溶液和0.1mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液，室温搅拌30～40min形成均匀的棕色溶液后，循环水洗和离心(所述离心的转速优选为7000～8000rpm，所述离心的时间优选为8～10min)3次，将得到的沉淀在50～60℃真空干燥，得到所述过氧化铜。

[0043] 在本发明中，所述过氧化铜、3‑氨基苯硼酸和水的用量比优选为(5～10)mg:(5～10)mg:10mL。

[0044] 本发明对所述过氧化铜和、3‑氨基苯硼酸和水的混合没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进行即可。

[0045] 在本发明中，所述配位优选在室温和搅拌的条件下进行；本发明对所述搅拌的条件没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的条件并保证能够得到均匀的深棕色溶液即可。

[0046] 所述配位完成后，本发明还优选包括依次进行的水洗和离心；所述水洗和离心优选循环进行3次。在本发明中，所述离心的转速优选为7000～8000rpm，更优选为8000rpm；时间优选为8～10min，更优选为10min。

[0047] 所述离心完成后，本发明还优选包括干燥，所述干燥优选为真空干燥；所述真空干燥的温度优选为50～60℃，更优选为60℃。

[0048] 本发明还提供了上述技术方案所述的纳米模拟酶材料或上述技术方案所述的制备方法制备得到的纳米模拟酶材料在检测卵类粘蛋白领域中的应用。

[0049] 本发明提供了一种检测卵类粘蛋白的方法，包括以下步骤：

[0050] 在酶标板上依次涂覆和孵育卵类粘蛋白抗体溶液、依次涂覆和孵育牛血清蛋白溶液和依次涂覆和孵育待测溶液后，涂覆纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的混合液，最后在反应底物中进行反应，得到待测夹心型生物免疫传感器；所述纳米模拟酶材料溶液中的纳米模拟酶材料为上述技术方案所述的纳米模拟酶材料；所述反应底物为2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液或3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液；

[0051] 对所述待测夹心型生物免疫传感器进行紫外吸光度测试，根据得到的吸光度和预定的标准曲线，得到所述待测卵类粘蛋白溶液中卵类粘蛋白的浓度。

[0052] 在本发明中，所述标准曲线的建立优选包括以下步骤：

[0053] 在酶标板上依次涂覆和孵育卵类粘蛋白抗体溶液、依次涂覆和孵育牛血清蛋白溶液和依次涂覆和孵育一系列标准卵类粘蛋白溶液后，涂覆纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的混合液，最后在反应底物中进行反应，得到一系列标准夹心型生物免疫传感器；所述一系列标准卵类粘蛋白溶液的浓度范围为0.0000316～100ng/mL；所述反应底物为2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液或3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液；

[0054] 对所述一系列标准夹心型生物免疫传感器进行紫外吸光度测试；

[0055] 根据测试结果，建立所述卵类粘蛋白溶液的浓度与吸光度的标准曲线。

[0056] 本发明在酶标板上依次涂覆和孵育卵类粘蛋白抗体溶液、依次涂覆和孵育牛血清蛋白溶液和依次涂覆和孵育一系列标准卵类粘蛋白溶液后，涂覆纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的混合液，最后在反应底物中进行反应，得到一系列标准夹心型生物免疫传感器；所述一系列标准卵类粘蛋白溶液的浓度范围为0.0000316～100ng/mL；所述反应底物为2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液或3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液。

[0057] 本发明对所述酶标板没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的酶标板即可。

[0058] 在本发明中，所述卵类粘蛋白抗体溶液的浓度优选为0.5～1μg/mL，更优选为0.6～0.9μg/mL，最优选为0.7～0.8μg/mL。

[0059] 本发明对所述卵类粘蛋白抗体溶液的涂覆过程和涂覆量没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程和用量使卵类粘蛋白抗体溶液铺满所述酶标板即可。

[0060] 在本发明中，孵育所述卵类粘蛋白抗体溶液的温度优选为4～6℃，更优选为5℃；时间优选为过夜孵育。

[0061] 孵育所述卵类粘蛋白抗体溶液的过程完成后，本发明还优选包括采用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液进行清洗，所述清洗的次数优选为3次。

[0062] 在本发明中，所述牛血清蛋白溶液的质量浓度优选为1～2％，更优选为1.3～1.6％。

[0063] 本发明对所述牛血清蛋白溶液的涂覆过程和涂覆量没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程和用量使所述牛血清蛋白溶液铺满所述酶标板的表面并能够清除所述酶标板的其余活性位点即可。在本发明的具体实施例中，所述牛血清蛋白溶液的用量为50μL。

[0064] 在本发明中，孵育所述牛血清蛋白溶液的温度优选为室温(即不需要进行额外的加热或者降温处理)，时间优选为20～30min，更优选为24～27min。

[0065] 孵育所述牛血清蛋白溶液的过程完成后，本发明还优选包括采用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液进行清洗，所述清洗的次数优选为3次。

[0066] 在本发明中，所述一系列标准卵类粘蛋白溶液的浓度范围优选为0.0000316～100ng/mL，即在所述0.0000316～100ng/mL的范围内选取14个具体的点值即可。在本发明的具体实施例中，所述一系列标准卵类粘蛋白溶液的浓度分别为0.0000316ng/mL、0.0001ng/mL、0.000316ng/mL、0.001ng/mL、0.00316ng/mL、0.01ng/mL、0.0316ng/mL、0.1ng/mL、
0.316ng/mL、1ng/mL、3.16ng/mL、10ng/mL、31.6ng/mL和100ng/mL。

[0067] 本发明对所述一系列标准卵类粘蛋白溶液的涂覆过程和涂覆量没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程和用量使所述一系列标准卵类粘蛋白溶液铺满所述酶标板的表面并能够清除所述酶标板的其余活性位点即可。在本发明的具体实施例中，所述一系列标准卵类粘蛋白溶液的用量为50μL。

[0068] 在本发明中，孵育所述一系列标准卵类粘蛋白溶液的温度优选为4～6℃，更优选为5℃，时间优选为1.5～2h，更优选为1.6～1.8h。

[0069] 孵育所述牛血清蛋白溶液的过程完成后，本发明还优选包括采用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液进行清洗，所述清洗的次数优选为3次。

[0070] 在本发明中，所述纳米模拟酶材料溶液的浓度优选为0.5～1mg/mL，更优选为0.6～0.9mg/mL，最优选为0.7～0.8mg/mL；所述PBS缓冲液的浓度优选为0.1mol/mL，pH值优选为9.6；所述纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的混合液的体积比优选为1:1。

[0071] 本发明对所述纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的混合液的涂覆过程和涂覆量没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进行并保证使所述纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的混合液福满所述酶标板的表面即可。在本发明的具体实施例中，所述纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的混合液中纳米模拟酶材料溶液的用量为50μL；所述PBS缓冲液的用量为50μL。

[0072] 在本发明中，孵育所述纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的混合液的温度优选为4～6℃，更优选为5℃；时间优选为1.5～2h，更优选为1.6～1.8h。

[0073] 孵育所述纳米模拟酶材料溶液和PBS缓冲液的混合液的过程完成后，本发明还优选包括采用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液进行清洗，所述清洗的次数优选为3次。

[0074] 在本发明中，所述反应底物为2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液或3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液。在本发明中，所述2,4‑二氯苯酚溶液和4‑氨基安替比林溶液的浓度独立的优选为0.5～1mg/mL，更优选为0.6～0.8mg/mL；所述MES缓冲液的pH值优选为6.8；所述2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液中2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的体积比优选为1:1:3。在本发明中，所述3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液的浓度优选为10～20mmol/L，更优选为12～18mmol/L，最优选为14～16mmol/L；所述双氧水的浓度优选为90～
100mmol/L，更优选为93～95mmol/L；所述醋酸缓冲液的pH值优选为4.5；所述3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液中3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的体积比优选为1:1:3。

[0075] 在本发明中，当所述反应底物为2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液时，所述反应的温度优选为50～60℃，更优选为53～57℃；时间优选为20～30min，更优选为24～27min；当所述反应底物为3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液时，所述反应的温度优选为30～37℃，更优选为33～35℃；时间优选为15～20min，更优选为16～17min。

[0076] 得到一系列标准夹心型生物免疫传感器后对所述一系列标准夹心型生物免疫传感器进行紫外吸光度测试。

[0077] 在本发明中，当所述反应底物为2,4‑二氯苯酚溶液、4‑氨基安替比林溶液和MES缓冲液的混合液时，能够使所述纳米模拟酶材料在510nm左右出现不同强度吸收峰。所述吸光度测试的扫描波长优选为400～700nm。

[0078] 在本发明中，当所述反应底物为3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液、双氧水和醋酸缓冲液的混合液时，能够使所述纳米模拟酶材料在652nm左右出现不同强度吸收峰。所述吸光度测试的扫描波长优选为500～800nm。

[0079] 在本发明中，所述紫外吸光度测试优选采用紫外分光光度计。

[0080] 测试完成后，本发明根据测试结果，建立所述卵类粘蛋白溶液的浓度与吸光度的标准曲线。本发明对所述标准曲线的建立没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进行即可。

[0081] 得到标准曲线后，本发明还包括对未知待测样(待测溶液)的检测。在本发明中，对所述待测溶液的检测优选参考上述对标准卵类粘蛋白溶液的检测过程，在此不再进行赘述。

[0082] 下面结合实施例对本发明提供的一种纳米模拟酶材料及其制备方法和应用、检测卵类粘蛋白的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0083] 实施例1

[0084] 将0.05g聚乙烯吡咯烷酮、0.1g二水合氯化铜和5mL去离子水混合后，加入5mL浓度为0.02M的氢氧化钠溶液和0.1mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液，室温搅拌30min形成均匀的棕色溶液后，循环水洗和离心(8000rpm，8～10min)3次，将得到的沉淀60℃真空干燥，得到过氧化铜；

[0085] 将10mg过氧化铜和10mg 3‑APBA分散于10mL水中，在室温下搅拌过夜，形成均匀的深棕色溶液，循环水洗和离心三次，所述离心的转速为8000rpm，时间为10min，将得到的沉淀在60℃的真空环境中干燥，得到所述纳米模拟酶材料(记为CuO2@3‑APBA)；

[0086] 将浓度为1μg/mL的卵类粘蛋白抗体溶液铺满酶标板上，4℃孵育过夜，然后用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL质量浓度为1％的牛血清蛋白溶液铺满酶标板，室温孵育30min，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL浓度分别为0.0000316ng/mL、0.0001ng/mL、0.000316ng/mL、0.001ng/mL、0.00316ng/mL、0.01ng/mL、0.0316ng/mL、0.1ng/mL、0.316ng/mL、1ng/mL、3.16ng/mL、10ng/mL、31.6ng/mL、100ng/mL的卵类粘蛋白溶液铺满酶标板，4℃孵育2h，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL浓度为1mg/mL的CuO2@3‑APBA溶液和50μL浓度为0.1mol/mL，pH为9.6的PBS缓冲液的混合液铺满酶标板，4℃孵育2h，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次后，反应在50μL浓度为1mg/mL的2,4‑二氯苯酚(2，4‑DP)溶液、50μL浓度为1mg/mL的4‑氨基安替比林(4‑AP)溶液和150μLpH值为6.8的MES缓冲溶液的混合液中，所述反应的温度为60℃，时间30min，得到一系列标准夹心型生物免疫传感器；

[0087] 采用紫外分光光度计，对所述一系列标准夹心型生物免疫传感器进行吸光度测试，测试过程中扫描波长为400～700nm，测试结果如表1所示：

[0088] 表1卵类粘蛋白溶液的浓度(ng/mL)和吸光度(a.u.)

[0089]

[0090]

[0091] 根据测试结果，建立所述卵类粘蛋白溶液的浓度与吸光度的标准曲线，如图3所示，其中(A)为吸光度随卵类蛋白溶液浓度的变化曲线，(B)为吸光度与卵类蛋白溶液浓度的标准曲线，由图3可知，吸光度随卵类蛋白溶液浓度的增加而增加；所述标准曲线的相关2
系数(R)为0.9931，LOD

[0092] 为0.032fg·mL‑1(S/N＝3)，显示出了良好的线性和交底的LOD值；表明，所述方法的检测范围为0.0000316～100ng/mL，最低检测下限为0.032fg/mL。

[0093] 将实施例1所述的过氧化铜和CuO2@3‑APBA进行TEM测试，测试结果如图1所示，其中(A)为所述过氧化铜在1000000x的放大倍数下的TEM图，(B)为所述过氧化铜在150000x放大倍数下的TEM图，(C)为所述过氧化铜在800000x的放大倍数下的TEM图，(D)为所述CuO2@3‑APBA在200000x放大倍数下的TEM图，(E)为所述CuO2@3‑APBA在100000x放大倍数下的TEM图，(F)为所述CuO2@3‑APBA在1000000x放大倍数下的TEM图；由图1可知，所述过氧化铜的粒径为10nm左右，负载3‑APBA后，形成纳米片；

[0094] 将所述CuO2@3‑APBA进行TEM Mapping测试，测试结果如图2所示，由图2可知，Cu、B、N均匀的分布在纳米颗粒中，表明CuO2@3‑APBA复合成功；

[0095] 参考上述标准夹心型生物免疫传感器的制备过程，制备夹心型生物免疫传感器，区别仅在于将标准卵类粘蛋白溶液替换为用量为50μL，浓度为10μg/mL的溶菌酶溶液(LYZ)、牛血清蛋白溶液(BSA)、乳清蛋白溶液(α‑La)、卵清蛋白溶液(OVA)；然后采用紫外分光光度计进行吸光度测试，测试结果如图5所示，由图5可知，所述检测方法对卵类粘蛋白有良好的特异性，并且不受其他物质干扰。

[0096] 实施例2

[0097] 将0.05g聚乙烯吡咯烷酮、0.1g二水合氯化铜和5mL去离子水混合后，加入5mL浓度为0.02M的氢氧化钠溶液和0.1mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液，室温搅拌30min形成均匀的棕色溶液后，循环水洗和离心(8000rpm，8～10min)3次，将得到的沉淀60℃真空干燥，得到过氧化铜；

[0098] 将10mg过氧化铜和10mg 3‑APBA分散于10mL水中，在室温下搅拌过夜，形成均匀的深棕色溶液，循环水洗和离心三次，所述离心的转速为8000rpm，时间为10min，将得到的沉淀在60℃的真空环境中干燥，得到所述纳米模拟酶材料(记为CuO2@3‑APBA)；

[0099] 将浓度为1μg/mL的卵类粘蛋白抗体溶液铺满酶标板上，4℃孵育过夜，然后用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL质量浓度为1％的牛血清蛋白溶液铺满酶标板，室温孵育30min，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL浓度分别为0.0000316ng/mL、0.0001ng/mL、0.000316ng/mL、0.001ng/mL、0.00316ng/mL、0.01ng/mL、0.0316ng/mL、0.1ng/mL、0.316ng/mL、1ng/mL、3.16ng/mL、10ng/mL、31.6ng/mL、100ng/mL的卵类粘蛋白溶液铺满酶标板，4℃孵育2h，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL浓度为1mg/mL的CuO2@3‑APBA溶液和50μL浓度为0.1mol/mL，pH为9.6的PBS缓冲液的混合液铺满酶标板，4℃孵育2h，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次后，反应在50μL浓度为10mmol/L的3,3',5,5'‑四甲基联苯胺(TMB)溶液、50μL浓度为100mmol/L的双氧水和150μLpH值为4.5的醋酸缓冲溶液的混合液中，所述反应的温度为37℃，时间15min，得到一系列标准夹心型生物免疫传感器；

[0100] 采用紫外分光光度计，对所述一系列标准夹心型生物免疫传感器进行吸光度测试，测试过程中扫描波长为500～800nm，测试结果如表2所示：

[0101] 表2卵类粘蛋白溶液的浓度(ng/mL)和吸光度(a.u.)

[0102]

[0103]

[0104] 根据测试结果，建立所述卵类粘蛋白溶液的浓度与吸光度的标准曲线，如图4所示，其中(A)为吸光度随卵类蛋白溶液浓度的变化曲线，(B)为吸光度与卵类蛋白溶液浓度的标准曲线，由图4可知，吸光度随卵类蛋白溶液浓度的增加而增加；所述标准曲线的相关2 ‑1
系数(R)为0.9952，LOD为0.032fg·mL (S/N＝3)，显示出了良好的线性和交底的LOD值。

[0105] 实施例3

[0106] 将0.05g聚乙烯吡咯烷酮、0.1g二水合氯化铜和5mL去离子水混合后，加入5mL浓度为0.02M的氢氧化钠溶液和0.1mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液，室温搅拌30min形成均匀的棕色溶液后，循环水洗和离心(8000rpm，10min)3次，将得到的沉淀60℃真空干燥，得到过氧化铜；

[0107] 将5mg过氧化铜和10mg 3‑APBA分散于10mL水中，在室温下搅拌过夜，形成均匀的深棕色溶液，循环水洗和离心三次，所述离心的转速为8000rpm，时间为10min，将得到的沉淀在60℃的真空环境中干燥，得到所述纳米模拟酶材料(记为CuO2@3‑APBA)；

[0108] 将浓度为1μg/mL的卵类粘蛋白抗体溶液铺满酶标板上，4℃孵育过夜，然后用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL质量浓度为1％的牛血清蛋白溶液铺满酶标板，室温孵育30min，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL浓度分别为0.1ng/mL和1ng/mL的卵类粘蛋白溶液铺满酶标板，4℃孵育2h，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL浓度为1mg/mL的CuO2@3‑APBA溶液和50μL浓度为0.1ol/mL，pH为9.6的PBS缓冲液的混合液铺满酶标板，4℃孵育2h，用浓度为
0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次后，反应在50μL浓度为1mg/mL的2,4‑二氯苯酚(2，4‑DP)溶液、50μL浓度为1mg/mL的4‑氨基安替比林(4‑AP)溶液和150μLpH值为6.8的MES缓冲溶液的混合液中，所述反应的温度为60℃，时间30min，得到待测夹心型生物免疫传感器；

[0109] 采用紫外分光光度计，对所述一系列标准夹心型生物免疫传感器进行吸光度测试，测试过程中扫描波长为400～700nm，测试结果如表3所示：

[0110] 表3卵类粘蛋白溶液的浓度(ng/mL)和吸光度(a.u.)

[0111] 浓度 0.1 1吸光度 0.730775 0.837570

[0112] 根据测试结果，与实施例1对比，数值差别不大，较实施例1对应吸光度略有增大。选用CuO2：3‑APBA＝1：2，对夹心型生物传感器无太大影响。

[0113] 实施例4

[0114] 将0.05g聚乙烯吡咯烷酮、0.1g二水合氯化铜和5mL去离子水混合后，加入5mL浓度为0.02M的氢氧化钠溶液和0.1mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液，室温搅拌30min形成均匀的棕色溶液后，循环水洗和离心(8000rpm，10min)3次，将得到的沉淀60℃真空干燥，得到过氧化铜；

[0115] 将5mg过氧化铜和10mg 3‑APBA分散于10mL水中，在室温下搅拌过夜，形成均匀的深棕色溶液，循环水洗和离心三次，所述离心的转速为8000rpm，时间为10min，将得到的沉淀在60℃的真空环境中干燥，得到所述纳米模拟酶材料(记为CuO2@3‑APBA)；

[0116] 将浓度为1μg/mL的卵类粘蛋白抗体溶液铺满酶标板上，4℃孵育过夜，然后用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL质量浓度为1％的牛血清蛋白溶液铺满酶标板，室温孵育30min，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL浓度分别为0.1ng/mL和1ng/mL的卵类粘蛋白溶液铺满酶标板，4℃孵育2h，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL浓度为1mg/mL的CuO2@3‑APBA溶液和50μL浓度为0.1mol/mL，pH为9.6的PBS缓冲液的混合液铺满酶标板，4℃孵育2h，用浓度为
0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次后，反应在50μL浓度为10mmol/L的3,3',5,
5'‑四甲基联苯胺(TMB)溶液、50μL浓度为100mmol/L的双氧水和150μLpH值为4.5的醋酸缓冲溶液的混合液中，所述反应的温度为37℃，时间15min，得到待测夹心型生物免疫传感器；

[0117] 采用紫外分光光度计，对所述一系列标准夹心型生物免疫传感器进行吸光度测试，测试过程中扫描波长为500～800nm，测试结果如表4所示：

[0118] 表4卵类粘蛋白溶液的浓度(ng/mL)和吸光度(a.u.)

[0119]浓度 0.1 1
吸光度 0.7163 0.8150

[0120] 根据测试结果，与实施例1对比，数值差别不大，较实施例2对应吸光度略有增大。选用CuO2：3‑APBA＝1：2，对夹心型生物传感器无太大影响。

[0121] 实施例5

[0122] 将0.05g聚乙烯吡咯烷酮、0.1g二水合氯化铜和5mL去离子水混合后，加入5mL浓度为0.02M的氢氧化钠溶液和0.1mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液，室温搅拌30min形成均匀的棕色溶液后，循环水洗和离心(8000rpm，10min)3次，将得到的沉淀60℃真空干燥，得到过氧化铜；

[0123] 将10mg过氧化铜和5mg 3‑APBA分散于10mL水中，在室温下搅拌过夜，形成均匀的深棕色溶液，循环水洗和离心三次，所述离心的转速为8000rpm，时间为10min，将得到的沉淀在60℃的真空环境中干燥，得到所述纳米模拟酶材料(记为CuO2@3‑APBA)；

[0124] 将浓度为1μg/mL的卵类粘蛋白抗体溶液铺满酶标板上，4℃孵育过夜，然后用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL质量浓度为1％的牛血清蛋白溶液铺满酶标板，室温孵育30min，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL浓度分别为0.1ng/mL和1ng/mL的卵类粘蛋白溶液铺满酶标板，4℃孵育2h，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL浓度为1mg/mL的CuO2@3‑APBA溶液和50μL浓度为0.1mol/mL，pH为9.6的PBS缓冲液的混合液铺满酶标板，4℃孵育2h，用浓度为
0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次后，反应在50μL浓度为1mg/mL的2,4‑二氯苯酚(2，4‑DP)溶液、50μL浓度为1mg/mL的4‑氨基安替比林(4‑AP)溶液和150μLpH值为6.8的MES缓冲溶液的混合液中，所述反应的温度为60℃，时间30min，得到待测夹心型生物免疫传感器；

[0125] 采用紫外分光光度计，对所述一系列标准夹心型生物免疫传感器进行吸光度测试，测试过程中扫描波长为400～700nm，测试结果如表5所示：

[0126] 表5卵类粘蛋白溶液的浓度(ng/mL)和吸光度(a.u.)

[0127]浓度 0.1 1
吸光度 0.6821 0.7801

[0128] 根据测试结果，与实施例1对比，数值差别不大，较实施例1对应吸光度无太大变化。选用CuO2：3‑APBA＝2：1，对夹心型生物传感器无太大影响。

[0129] 实施例6

[0130] 将0.05g聚乙烯吡咯烷酮、0.1g二水合氯化铜和5mL去离子水混合后，加入5mL浓度为0.02M的氢氧化钠溶液和0.1mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液，室温搅拌30min形成均匀的棕色溶液后，循环水洗和离心(8000rpm，10min)3次，将得到的沉淀60℃真空干燥，得到过氧化铜；

[0131] 将10mg过氧化铜和5mg 3‑APBA分散于10mL水中，在室温下搅拌过夜，形成均匀的深棕色溶液，循环水洗和离心三次，所述离心的转速为8000rpm，时间为10min，将得到的沉淀在60℃的真空环境中干燥，得到所述纳米模拟酶材料(记为CuO2@3‑APBA)；

[0132] 将浓度为1μg/mL的卵类粘蛋白抗体溶液铺满酶标板上，4℃孵育过夜，然后用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL质量浓度为1％的牛血清蛋白溶液铺满酶标板，室温孵育30min，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL浓度分别为0.1ng/mL和1ng/mL的卵类粘蛋白溶液铺满酶标板，4℃孵育2h，用浓度为0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次，将50μL浓度为1mg/mL的CuO2@3‑APBA溶液和50μL浓度为0.1mol/mL，pH为9.6的PBS缓冲液的混合液铺满酶标板，4℃孵育2h，用浓度为
0.1mol/L，pH＝7.4的PBST缓冲液清洗酶标板3次后，反应在50μL浓度为10mmol/L的3,3',5,
5'‑四甲基联苯胺(TMB)溶液、50μL浓度为100mmol/L的双氧水和150μLpH值为4.5的醋酸缓冲溶液的混合液中，所述反应的温度为37℃，时间15min，得到待测夹心型生物免疫传感器；

[0133] 采用紫外分光光度计，对所述一系列标准夹心型生物免疫传感器进行吸光度测试，测试过程中扫描波长为500～800nm，测试结果如表6所示：

[0134] 表6卵类粘蛋白溶液的浓度(ng/mL)和吸光度(a.u.)

[0135]浓度 0.1 1
吸光度 0.7034 0.7342

[0136] 根据测试结果，与实例1对比，数值差别不大，较实例1对应吸光度无太大变化。选用CuO2：3‑APBA＝2：1，对夹心型生物传感器无太大影响。

[0137] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。