一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法及在防治木薯细菌性枯萎病中的应用

摘要

本发明公开一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法及在防治木薯细菌性枯萎病中的应用。所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物为通过底盘宿主细胞异源表达细菌素基因簇所得；所述细菌素基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法有助于快速获得细菌素并提高细菌素产量且成本低廉。经实验证实所得细菌素类似物对于地毯草黄单胞木薯萎焉致病变种具有明显的抑制作用。

权利要求

1.耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物在防治木薯细菌性枯萎病中的应用，其特征在于，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物为通过底盘宿主细胞异源表达细菌素基因簇所得；所述细菌素基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述木薯细菌性枯萎病的致病菌为地毯草黄单胞菌木薯枯萎致病变种Xanthomonas axonopodis pv. manihotis。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底盘宿主细胞包括大肠杆菌细胞。

3.权利要求1所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）耐硼赖氨酸芽孢杆菌基因组DNA提取；

（2）基因簇PCR扩增；

以提取的耐硼赖氨酸芽孢杆菌全基因组DNA为模板，PCR扩增细菌素基因簇；所述细菌素基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（3）PCR产物纯化回收，得DNA片段；

（4）质粒的双酶切及凝胶回收，得克隆载体；

（5）将步骤（3）所得DNA片段与步骤（4）所得克隆载体进行无缝克隆连接；

（6）电击转化大肠杆菌感受态细胞；

（7）将成功转化的含重组质粒的大肠杆菌进行发酵培养，得发酵液，从发酵液中提取得到细菌素类似物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，采用硫酸铵沉淀法从发酵液中提取得到细菌素类似物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，向发酵液中添加硫酸铵，使硫酸铵饱和度为80％，所得沉淀即为细菌素类似物。

说明书

一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法及在防治

木薯细菌性枯萎病中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物合成生物学技术领域，具体涉及一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法及在防治木薯细菌性枯萎病中的应用。

背景技术

[0002] 1.抗病代谢途径的标准化与模块化设计

[0003] 随着耐药菌株的不断增加，目前迫切需要寻找绿色安全的抗生素替代品，而微生物可产生多种多样具生物活性的天然次级代谢产物，在医疗、农业和食品等领域有着广阔的应用前景，有望作为新药产生的主要来源之一。但目前存在某些次级代谢产物的生物合成基因簇处于沉默状态，产物不易制备以及产量低等问题。

[0004] 合成生物的应运而生将有助于解决以上难题。合成生物学是在系统生物学的研究基础上，引入工程学原理和方法，从头构建具有可预测行为的人工生物装置和系统，包括计算模型和模块化DNA，通过标准的设计和模块组件间的相互连接从而建立代谢途径并构建生物回路来控制细胞行为。因此基于系统生物学与合成生物学的微生物底盘细胞的设计与开发，可实现优良细胞工厂的构建与改造。

[0005] 2.木薯

[0006] 木薯是南美、非洲和亚洲等热带地区的主要经济作物，除了是食物的主要来源，还被广泛用于生产淀粉、饲料、酒精、药品、化妆品以及生物聚合物等。木薯尤其淀粉含量较高，且富含维生素C、类胡萝卜素和矿物质，具有重要的食用和工业价值。但随着种植面积的扩大，细菌性疾病尤其是地毯草黄单胞木薯萎焉致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.manihotis,Xam)引起的木薯细菌性枯萎病可使木薯产量损失高达75％。感染该病后，木薯出现角状叶斑、叶片萎焉、树脂渗出、茎的维管组织坏死、枝条枯死等症状。

[0007] 目前的防治方法有通过使用干净的种植材料和管理昆虫媒介，进行间作、轮作、休耕和除草等方法可以减少木薯种植中的疾病发生率和严重程度。其次是开发具有增强抗病性的木薯品种。但当前该病害缺少真正特别有效的防控措施。

[0008] 3.细菌素

[0009] 细菌素是细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的蛋白或多肽。细菌素的合成通常需要多个模块相互作用。细菌素具有分子量小、易被蛋白酶降解而无残留，对人体无毒副作用等优点，目前可用于食品防腐、人类疾病防治和生物防治等。

[0010] 4.耐硼赖氨酸芽孢杆菌

[0011] 早期，申请人分离获得一株耐硼赖氨酸芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC NO.M 2019773，研究表明该菌株对于槟榔根腐病菌、水稻纹枯病菌、稻瘟病菌等病菌均具有良好的抑菌活性(参见专利文献CN111100806A、CN111100805A、CN111187726A)。但是对于耐硼赖氨酸芽孢杆菌在抑制木薯细菌性枯萎病菌方面、其细菌素基因以及合成生物学方面的研究尚未涉及。

发明内容

[0012] 鉴于现有技术的不足，本发明提出一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法及在防治木薯细菌性枯萎病中的应用。

[0013] 本发明以实验室保存的一株可拮抗多种病原细菌和病原真菌的潜在拮抗生防菌耐硼赖氨酸芽孢杆菌为研究对象，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.M 2019773。相关保藏信息也可从申请人前期申请并公开的专利文献(例如CN111100806A)中获知。

[0014] 耐硼赖氨酸芽孢杆菌是一株对多种病原细菌和病原真菌都具抑制作用的潜在拮抗生防菌，本发明主要对其基因组进行分析，挖掘细菌素基因簇，再以大肠杆菌为底盘宿主细胞，通过异源表达细菌素基因簇，使用合成生物学针对特定目标重新设计系统的方法，最终生产出具有生物学活性的细菌素抗菌活性物质。

[0015] 本发明技术方案主要包括以下内容：

[0016] 一方面，本发明提供一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物在防治木薯细菌性枯萎病中的应用。

[0017] 优选的，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物为通过底盘宿主细胞异源表达细菌素基因簇所得；所述细菌素基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0018] 优选的，所述底盘宿主细胞包括大肠杆菌细胞。

[0019] 优选的，所述木薯细菌性枯萎病的致病菌为地毯草黄单胞菌木薯枯萎致病变种。

[0020] 另一方面，本发明还提供了所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法，该方法包括以下步骤：

[0021] (1)耐硼赖氨酸芽孢杆菌基因组DNA提取；

[0022] (2)基因簇PCR扩增；

[0023] 以提取的耐硼赖氨酸芽孢杆菌全基因组DNA为模板，PCR扩增细菌素基因簇；所述细菌素基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

[0024] (3)PCR产物纯化回收，得DNA片段；

[0025] (4)P15A质粒的双酶切及凝胶回收，得克隆载体；

[0026] (5)将步骤(3)所得DNA片段与步骤(4)所得克隆载体进行无缝克隆连接；

[0027] (6)电击转化大肠杆菌感受态细胞；

[0028] (7)将成功转化的含重组质粒的大肠杆菌进行发酵培养，得发酵液，从发酵液中提取得到细菌素类似物。

[0029] 优选的，步骤(7)所述提取是：采用硫酸铵沉淀法从发酵液中提取得到细菌素类似物。更优选为：向发酵液中添加硫酸铵，使硫酸铵饱和度为80％，所得沉淀即为细菌素类似物。

[0030] 本申请中出现的一些名词具有如下释义：

[0031] 本申请所述细菌素是细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的蛋白或多肽。细菌素具有分子量小、易被蛋白酶降解而无残留，对人体无毒副作用等优点，目前可用于食品防腐、人类疾病防治和生物防治等。

[0032] 本申请所述发酵液是指菌经发酵后产生的具有细菌素类似物的液体。例如含重组质粒的E.Coli BL21发酵液为250mL菌液(初始OD约0.02OD600/mL)/1000mL LB培养基的装液量，在37℃下以150r/min转速培养约28h得到的发酵产物。发酵结束后，9000r/min离心30min去除沉淀，收集发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤，即得到无菌的发酵滤液。

[0033] 本申请所述硫酸铵沉淀法是指用不同浓度硫酸铵溶液对蛋白质进行沉淀和分离的技术。硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

[0034] 本申请所述滤纸片法是指将已灭菌的滤纸片放置在涂有指示菌的LB固体培养基表面，滴加待测物，通过观察滤纸片周围的透明圈的大小从而评估待测物的抗菌活性。

[0035] 本发明所取得的效果：

[0036] (1)与传统的抗生素相比，细菌素具有分子量小，易被蛋白酶降解而无残留，对人体健康和环境无害等优点。本发明通过生物合成方法获得了耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物，且实验证实该细菌素类似物对于地毯草黄单胞木薯萎焉致病变种具有明显的抑制作用。

[0037] (2)通常从原始菌株中分离纯化细菌素，该过程费时费力，并且细菌素的产量一般很低。本发明提供了一种有效的可替代传统方法的细菌素生产方法，有助于快速获得细菌素并提高细菌素产量且成本低廉。

[0038] (3)本发明针对目的片段比较大的特点，通过无缝克隆进行载体的构建，不仅成功率高且操作简便。

附图说明

[0039] 图1：重组质粒载体的构建。A:Bacteriocin类似物生物合成基因簇的PCR扩增凝胶电泳图，得到的PCR产物条带清晰，大小约为8932bp，与预期的大小一致，表明成功从耐硼赖氨酸芽孢杆菌基因组上扩增出该基因簇；B:基因簇异源表达重组质粒菌落PCR凝胶电泳图，使用验证引物进行菌落PCR扩增验证，得到581bp左右的验证片段，符合预期的片段大小，说明载体构建成功。

[0040] 图2：使用滤纸片法检测发酵液硫酸铵沉淀纯化物对地毯草黄单胞木薯萎焉致病变种的抑制作用。其中，A是对照组，是用含空质粒的E.Coli BL21 28h的发酵液处理地毯草黄单胞木薯萎焉致病变种，B是实验组，是用含基因簇的重组质粒的E.Coli BL21 28h发酵液硫酸铵沉淀纯化物处理地毯草黄单胞木薯萎焉致病变种，图中出现明显的抑菌圈，表明地毯草黄单胞木薯萎焉致病变种被重组大肠杆菌的发酵液硫酸铵沉淀纯化物所抑制而无法在滤纸周围生长，最终出现透明圈。

具体实施方式

[0041] 为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

[0042] 实施例1Bacteriocin类似物基因簇的预测与分析

[0043] 上传耐硼赖氨酸芽孢杆菌的基因组文件至antiSMASH网站进行基因簇预测。该网站可接受带注释的GenBank、EMBL以及fasta格式的文件。基因簇预测完成后进行下游分析，包括结构域的分析和注释，核心化学结构的预测。然后进行ClusterBlast基因簇比较分析以及smCOG(secondary metabolite Clusters of Orthologous Groups of groups)分析。基因簇序列如SEQ ID NO.1所示。

[0044] 实施例2使用无缝克隆的方法构建基因簇异源表达载体

[0045] (1)耐硼赖氨酸芽孢杆菌基因组DNA

[0046] 取5mL过夜培养的耐硼赖氨酸芽孢杆菌菌液，按照Vazyme Biotech细菌基因组提取试剂盒说明书提取基因组DNA。

[0047] (2)基因簇的PCR扩增

[0048] 以提取的耐硼赖氨酸芽孢杆菌全基因组为模板，分别以Bac(10)‑F和Bac(10)‑R为引物PCR扩增目的基因簇，并进行凝胶电泳检测。最终得到条带清晰，与预期的大小一致(8932bp)的DNA片段，表明成功的从耐硼赖氨酸芽孢杆菌基因组上扩增出该基因簇。Bac(10)‑F：TAAGGATGATTTCTGGAATTCGGCTAAGTTTTTATATGAGTAATGTCAC(SEQ ID NO.2)；Bac(10)‑R：GTTCCACAGGGTAGCGGATCCGCCTTCTGTTACCACTTCATCAAG(SEQ ID NO.3)。

[0049] PCR反应体系及扩增程序如表1和表2所示：

[0050] 表1 PCR扩增体系

[0051]

[0052] 表2 PCR扩增程序

[0053]

[0054] (3)PCR产物纯化回收

[0055] 根据Vazyme Biotech产物纯化试剂盒说明书进行产物纯化回收，得DNA片段。

[0056] (4)P15A质粒的双酶切及凝胶回收

[0057] 将p15A质粒用BamHI和EcoRI限制性内切酶进行双酶切，37℃反应6h。将酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，回收凝胶，置于1.5mL的EP管中，后续纯化步骤按照Vazyme Biotech产物纯化试剂盒说明书进行。得克隆载体。双酶切体系如表3所示：

[0058] 表3限制性内切酶双酶切体系

[0059]

[0060]

[0061] (5)无缝克隆连接

[0062] 按照 Ultra One Step Cloning Kit试剂盒进行操作。连接体系如表4所示：

[0063] 表4无缝克隆连接体系

[0064]

[0065] ①按照以下公式进行片段和载体使用量的计算，对于单片段同源重组反应。

[0066] 最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)，最适插入DNA片段使用量＝[0.04×DNA片段碱基对数]ng(0.06pmol)。

[0067] ②按照表4进行连接体系的配制

[0068] ③50℃反应5min；降至4℃或立即置于冰上冷却。

[0069] 注：若插入片段的碱基数远大于克隆载体的碱基数时，要将克隆载体当做插入片段计算。

[0070] (6)电击转化BL21感受态细胞

[0071] 设置电击转化程序为Bacteria。取出已灭菌预冷的电转杯。将感受态细胞置于冰上1min左右使其溶解，加入1～2μL连接产物或质粒，吹打混匀，快速将菌液转移到电转杯的凹槽中，轻轻震荡3‑5下，快速擦拭电转杯外壁水珠，进行电击转化。电转完毕，加入1mL LB液体培养基，吹打混匀，37℃，150rpm复苏1h。6000rpm离心3min收集菌体，弃上清，加入100μL LB液体培养基，悬浮菌体，涂布到壮观霉素抗性平板上，37℃培养12‑16h。

[0072] (7)重组质粒的筛选与鉴定

[0073] 挑取抗性平板上的单菌落到装有40μL无菌水的1.5mL EP管中，置于100℃金属浴中加热10min，使菌体完全裂解。12000rpm离心1min，取1μL上清作为菌落PCR的模板，用F3(CCTTCTGCCACTGGTCGTTTATC)和R3(GGCTTTACAGAACCGACACCAAT)引物对进行PCR扩增。通过1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行大小判断。取阳性克隆子进行质粒提取，送往上海生工责任有限公司进行测序鉴定。结果见图1。

[0074] 实施例3采用硫酸铵沉淀法制备含有细菌素类似物的重组蛋白粗提物[0075] 取400mL含基因簇重组质粒或者空载质粒的大肠杆菌发酵液，边搅拌边向发酵液中加入硫酸铵，使其饱和度达到50％、60％、70％或80％，4℃过夜沉淀。8000rpm离心10min收集沉淀，沉淀用PBS(pH7.0)溶解并定容至10mL，测定其抑菌活性，对照溶剂为PBS(pH7.0)。结果显示不同硫酸铵饱和度沉淀实验中，硫酸铵饱和度为80％的含基因簇重组质粒的重组大肠杆菌发酵液粗提物对地毯草黄单胞菌木薯枯萎致病变种的生长的抑制效果最为明显，而含有空载质粒的对照重组大肠杆菌并不具有抑制活性，说明本发明的来源于耐硼赖氨酸芽孢杆菌的细菌素类似物，经异源表达后，能够赋予重组大肠杆菌以抑制地毯草黄单胞菌木薯枯萎致病变种的生防活性。

[0076] 实施例4使用滤纸片法检测发酵液硫酸铵沉淀纯化物对地毯草黄单胞菌木薯枯萎致病变种的抗菌活性

[0077] 挑取靶标细菌，即地毯草黄单胞菌木薯枯萎致病变种的单菌落于5mL的LB液体培养基中，37℃，150rpm培养12h。按OD600＝0.02的初始接种量转接至20mL LB液体培养基中，8
培养至OD600＝0.4‑0.6。取10菌液于1.5mL的EP管中，6000rpm离心3min，弃上清，加入1mL的新鲜LB培养基，吹打混匀。吸取500μL至LB固体培养基上，用无菌棉签涂布均匀。将6mm的无菌滤纸片(5层)置于涂有靶标细菌的培养基表面。将提前准备的含基因簇重组质粒或空载质粒的E.Coli BL21发酵液硫酸铵沉淀纯化物(即实施例3中经饱和度80％硫酸铵沉淀并用PBS溶解并定容后的溶液)滴至滤纸片上，总量为80μL(多次少量滴加)，另滴加含有空质粒的E.Coli BL21的发酵液硫酸铵沉淀纯化物作为对照，设置三个平行板。置于30℃培养12h后观察靶标细菌的生长情况。结果见图2。

[0078] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。