一种具有美白功效的三叶鬼针草提取物的制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种具有美白功效的三叶鬼针草提取物的制备方法，包括如下步骤：步骤一、将三叶鬼针草加入至闪式提取器的反应容器内，并加入提取溶剂；步骤二、向反应容器内补入非活性气体以排除空气，并将压力降至0.5～0.8bar；步骤三、采用超声辅助进行闪式提取，其中，超声辅助的功率为400～700W，闪式提取的机械转速为2000～4000r/min，重复提取2～4次，每次6～9min，过滤获得三叶鬼针草提取液；步骤四、将所述三叶鬼针草提取液旋蒸浓缩，经过离心留取其上清液，将所述上清液密封灌装得所述三叶鬼针草提取物。本发明提供的三叶鬼针草提取液的制备方法，在不添加人工添加剂的情况下可以长期稳定保存，并且能够显示出突出的美白功效。

权利要求

1.一种具有美白功效的三叶鬼针草提取物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一、将三叶鬼针草加入至闪式提取器的反应容器内，并加入质量浓度为65 95%的~乙醇溶液；

步骤二、向反应容器内补入二氧化碳以排除空气，并将压力降至0.7bar；

步骤三、采用超声辅助进行闪式提取，其中，超声辅助的功率为600W，闪式提取的机械转速为3500r/min，重复提取2 4次，每次6 9min，过滤获得三叶鬼针草提取液；

~ ~

步骤四、将所述三叶鬼针草提取液旋蒸除去提取溶剂，于3500r/min下离心6min留取其上清液，将所述上清液密封灌装得所述三叶鬼针草提取物。

2.根据权利要求1所述的一种具有美白功效的三叶鬼针草提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，所述过滤为用硅藻土饼真空抽滤，所述硅藻土饼采用质量比为（3 9）：~

（0.5 3）的硅藻土和EDTA‑2Na混合制得。

~

3.根据权利要求1所述的一种具有美白功效的三叶鬼针草提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，所述旋蒸浓缩的条件为：真空度为150 250mbar，水浴温度为60 70℃。

~ ~

4.如权利要求1 3任一所述方法制备获得的三叶鬼针草提取物。

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5.如权利要求4所述的三叶鬼针草提取物在制备化妆品中的应用，所述化妆品的剂型包括霜剂、乳液、化妆水、凝胶剂、面膜和洗剂。

说明书

一种具有美白功效的三叶鬼针草提取物的制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种具有美白功效的三叶鬼针草提取物的制备方法，以及其在化妆品中的应用。

背景技术

[0002] 随着生活水平的提高，人们对美白化妆品的要求也越来越高。除了美白肌肤外，还有许多方面有待加强，如延缓皮肤衰老、减少皱纹、光滑肌肤，这些可通过提高机体超氧化歧化酶活性和清除多余超氧自由基来实现；促黑素细胞激素(α‑MSH)是由黑色素细胞产生的，其与黑皮素‑1(MCR‑1)受体相结合，会通过一系列反应最终激活酪氨酸酶的合成表达，从而促进黑色素合成增加，若能抑制α‑MSH产生可从酪氨酸酶合成的源头阻止黑素生成，最终达到美白效果。此外，机制单一的美白产品总体效果较差，因此，为了研发出功效更突出的美白化妆品，需要多种机制的综合运用来更好的达到美白肌肤的目的。

[0003] 三叶鬼针草含有多元酚、香豆素、氨基酸、维生素等成分，可以治疗疔疮肿毒、感冒、咽喉肿痛等疾病，其中含有总生物碱以及类甾醇物质，具有消炎作用。其提取物具有抗菌效果，可抑制金黄色葡萄球菌活性。三叶鬼针草中的总黄酮类成分能抑制黑素细胞中酪氨酸酶的活性，能够抑制黑色素从黑素细胞中向角质层转移，同时可以清除晚期糖基化产物从而有抗氧化效果，对于皮肤美白有促进的作用。

[0004] 然而由于植物类中草药的化学成分十分复杂，通常含有生物碱、氨基酸、有机酸、酚类、皂甙、甾体、萜类化合物以及蛋白质、粘液质、鞣质、糖类、淀粉、纤维素、无机盐等，使天然植物提取物的稳定性难以控制，常常出现凝集沉淀、氧化变色等现象。三叶鬼针草同样如此，使用传统提取方法提取三叶鬼针草时，其中还原性很强的活性物质，例如维生素C等，在提取物中难以稳定存在，进而使鬼针草的提取物容易氧化变色，进而导致活性损失。目前常用的抗氧化手段为加入化学抗氧化剂，但是，一方面抗氧化剂的加入影响了提取物的稳定性，另一方面在化妆品中加入化学添加剂不仅会降低化妆品对皮肤的舒适感，也与现在“天然、绿色”的化妆品理念背道而驰，降低消费者的购买欲望。

[0005] 因此，现有技术中未能够针对三叶鬼针草提供一种有效维持其稳定性、进而提高其活性的提取方法。

发明内容

[0006] 为了解决上述问题，本发明目的是提供一种稳定性好，且具有突出的美白功效的三叶鬼针草提取物的制备方法，包括如下步骤：

[0007] 步骤一、将三叶鬼针草加入至闪式提取器的反应容器内，并加入提取溶剂；

[0008] 步骤二、向反应容器内补入非活性气体以排除空气，并将压力降至0.5～0.8bar；

[0009] 步骤三、采用超声辅助进行闪式提取，其中，超声辅助的功率为400～700W，闪式提取的机械转速为2000～4000r/min，重复提取2～4次，每次6～9min，过滤获得三叶鬼针草提取液；

[0010] 步骤四、将所述三叶鬼针草提取液旋蒸除去提取溶剂，经过离心留取其上清液，将所述上清液密封灌装得所述三叶鬼针草提取物。

[0011] 进一步地，所述步骤一中，所述提取溶剂为质量浓度为65～95％的乙醇溶液。

[0012] 进一步地，所述步骤二中，所述非活性气体包括二氧化碳。

[0013] 进一步地，所述步骤二中，补入二氧化碳并将压力降至0.7bar。

[0014] 进一步地，所述步骤三中，超声辅助的功率为600W，闪式提取的机械转速为3500r/min。

[0015] 进一步地，所述步骤三中，所述过滤为用硅藻土饼真空抽滤，所述硅藻土饼采用质量比为(3～9)：(0.5～3)的硅藻土和EDTA‑2Na混合制得。

[0016] 进一步地，所述步骤四中，所述旋蒸浓缩的条件为：真空度为150～250mbar，水浴温度为60～70℃。

[0017] 进一步地，所述步骤四中，所述离心条件为：于2000～4000r/min下离心2～8min。

[0018] 另一方面，本申请还提供了上述方法制备获得的三叶鬼针草提取物。

[0019] 另一方面，本申请还提供了上述三叶鬼针草提取物在制备化妆品中的应用，所述化妆品的剂型包括霜剂、乳液、化妆水、凝胶剂、面膜、涂擦剂和洗剂。

[0020] 本申请的有益效果在于：

[0021] 1、本申请提供的制备方法，采用可常温提取的闪式提取法对三叶鬼针草进行提取，其中闪式提取特别适用于对纤维较大的植物叶片直接进行提取，并且结合常温以及超声辅助的提取方式，能够更有效的保留三叶鬼针草中的有效成分；

[0022] 2、本申请提供的制备方法，在闪式提取时加入了非活性气体以排出空气，特别是空气中的氧气，这是由于闪式提取对植物物料的高度破碎，使植物的内容物大量的暴露出来，又因为闪式提取器的内刃中心形成强力涡流，并带动已粉碎的物料内外翻动，从而产生剧烈搅拌作用，使植物的提取物与外界的氧气大量接触而氧化变色甚至失活，而本申请采用通入非活性气体排出氧气的方式，能够有效减少三叶鬼针草中还原性强的活性物质与空气的接触，避免被氧化变色；

[0023] 3、本申请提供的制备方法，非活性气体采用二氧化碳，二氧化碳可与提取溶剂中的水结合形成酸性环境，而酸性环境特别适用于维持三叶鬼针草中黄酮、维生素C等活性物质的稳定，进而提高其稳定性，并有利于提升其美白功效。

附图说明

[0024] 此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

[0025] 图1是本申请实施例1所制得的三叶鬼针草提取物对黑素生成的抑制作用柱状图；

[0026] 图2‑图6是本申请实施例1所制得的三叶鬼针草提取物对黑色素小体生成的抑制作用结果图，其中，图2是空白对照组结果图，图3是浓度0.625％的三叶鬼针草提取物1的结果图，图4是浓度0.3125％的三叶鬼针草提取物2的结果图，图5是浓度0.156％三叶鬼针草提取物3的结果图，图6是浓度0.078％的三叶鬼针草提取物4的结果图。具体实施方式：

[0027] 为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

[0028] 本申请的二氧化碳气体购自河南迎众化工产品有限公司；抽真空机为上海皓昕机电设备有限公司产品，型号为BDR16，真空度≤0.05Pa；闪式提取器为上海钒帜精密设备有限公司产品，型号为SC 200，电机转速：0～10000r/min；超声波振动棒为深圳市立岽旭超声波洗净设备有限公司产品，型号为LDX1000A‑20，功率：0～1000W；旋蒸蒸发仪具体为科兴仪器公司产品，型号为R1020，其温控为室温～99℃，真空度为≤399.9Pa；离心机为盐城市凯特实验仪器有限公司产品，型号为TD6M，转速≤6000r/min。

[0029] 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售，如未特殊说明，以下实施例中的原料等级均为化妆品级，且均可通过商业途径购得。

[0030] 另外，本发明中所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸水、高纯水、纯净水等化妆品领域能够使用的任何可行的水。

[0031] 实施例1

[0032] 该实施例提供了一种三叶鬼针草提取物的制备方法，具体步骤如下：

[0033] 第一步：剪切所述三叶鬼针草，获得直径为1.7cm的三叶鬼针草碎片，将三叶鬼针草碎片加入至闪式提取器的反应容器内，并加入质量浓度为85％的乙醇作为提取溶剂；

[0034] 第二步：向反应容器内补入二氧化碳以排除空气，密封反应容器后，控制补入的二氧化碳至反应容器内的压力为0.7bar；

[0035] 第三步：在反应容器内，将超声波振动棒部分浸入溶剂中，以600W功率进行超声，同时对三叶鬼针草碎片用闪式提取器以3500r/min提取3次，每次8min，得醇提混合液，再经醇提混合液和硅藻土及EDTA‑2Na的用量质量比为90：7：2的硅藻土饼真空抽滤得三叶鬼针草提取液；

[0036] 第四步：真空度为190mbar，水浴温度为60℃下旋蒸浓缩三叶鬼针草提取液除去提取溶剂，得三叶鬼针草浓缩液，三叶鬼针草浓缩液经过3500r/min离心6min得澄清透明的上清液，将上清液密封灌装得三叶鬼针草提取物。

[0037] 实施例2～7

[0038] 实施例2～7与实施例1的制备方法大致相同，区别仅在于，第二步中补入二氧化碳后的压强不同，第三步中超声波振动的功率不同，闪式提取器的转速不同，具体各实施例的参数见表1。

[0039] 对比例1

[0040] 该对比例与实施例1的制备方法大致相同，区别仅在于，未采用第二步。

[0041] 对比例2

[0042] 该对比例与实施例1的制备方法大致相同，区别仅在于，第三步中未采用超声波辅助。

[0043] 对比例3

[0044] 该对比例与实施例1的制备方法大致相同，区别仅在于，第三步提取方法为90℃乙醇回流提取。

[0045] 将上述各实施例和对比例制备获得的三叶鬼针草提取物置于避光且通风的环境中开口储存，观察是否有沉淀物质析出和溶液稳定性，记录开始有沉淀物质析出和溶液开始凝集的天数，连续观察15天。所得结果见表1：

[0046] 表1

[0047]

[0048] 由表1中的数据可知，相较于对比例，使用本申请提供的方法制备获得的三叶鬼针草提取物具有明显提升的储存稳定性，特别是实施例1，该参数下的三叶鬼针草提取物能够在15天后仍澄清透明，显示出了最优的稳定性提升效果。在下述实施例中，以效果最优的实施例1制备获得的三叶鬼针草提取物为示例，进行功效实验的测评。

[0049] 功效测评实验：

[0050] 一、黑色素含量检测实验：

[0051] 实验仪器：升降油浴锅(ZKYY‑5L)、CO2培养箱(Thermo，150i)、超净工作台(苏净安泰，SW‑CJ‑1F)、倒置显微镜(Olympus，CKX41)、酶标仪(BioTek，Epoch)、荧光定量PCR仪(BioRad，CFX‑96)。旋转蒸发仪(B‑300Base)。

[0052] 实验方法：

[0053] 1)接种：按3E5个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。

[0054] 2)配液：按照具体测试方案配置受试物工作液。

[0055] 3)给药：将实施例1提供的三叶鬼针草提取物分别配制成浓度0.625％、0.3125％、0.156％和0.078％，分别记为三叶鬼针草提取物1、三叶鬼针草提取物2、三叶鬼针草提取物
3和三叶鬼针草提取物4。待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔给药量为2mL，每组设3个复孔，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育72h，72h后弃培养液，PBS洗涤1次。

[0056] 4)细胞消化：用0.25％胰酶消化黑素细胞(700μL/孔)，37℃，1‑2min，显微镜下观察，细胞80％回缩为球状且未脱离贴附面时，立即加入700μL/孔含10％FBS的DMEM终止反应，吹打均匀后收集细胞到1.5mLEP管中，10000r/min离心10min，弃上清液。

[0057] 5)在通风橱中按照2:5:5比例配置蒸馏水、无水乙醇和乙醚的混合液，混合均匀后按照1.2mL/管加入EP管中，摇晃，室温放置30min后10000r/min离心10min。

[0058] 6)弃上清液，加入1mL含10％(体积分数)DMSO的1mol/LNaOH水溶液，采用封口膜封口。

[0059] 7)分别将样品与不同浓度的黑色素标准品溶液放置于80℃水浴中加热30min。

[0060] 8)加热结束后，待温度平衡至室温后，向96孔板依次加入上述溶液200μL/孔，每支EP管设置2个复孔，选择405nm波长在酶标仪上测吸光度值。

[0061] 9)将不同浓度的标准品溶液测定的OD值为横坐标，黑素含量为纵坐标，制作标准曲线，获取回归方程，将样品OD值代入公式中，计算样品组黑色素含量。

[0062] 实验所得结果见图1。如图1所示，与空白对照组相比，阳性对照(光甘草定)组黑素含量显著降低，说明本次实验有效。与空白对照组相比，三叶鬼针草提取物1、2、3、4的黑素含量都显著下降。说明本申请实施例1所制得的三叶鬼针草对于黑素产生的抑制作用非常明显。

[0063] 二、黑素小体合成抑制检测实验：

[0064] 实验仪器：升降油浴锅(ZKYY‑5L)、CO2培养箱(Thermo，150i)、超净工作台(苏净安泰，SW‑CJ‑1F)、倒置显微镜(Olympus，CKX41)、酶标仪(BioTek，Epoch)、荧光定量PCR仪(BioRad，CFX‑96)。旋转蒸发仪(B‑300Base)。

[0065] 实验过程：

[0066] 1)配置实验液。

[0067] 2)接种：按照7×104/孔接种密度接种细胞于6孔板中，添加3mL黑素培养基，37℃，5％CO2培养箱继续培养24h。

[0068] 3)药物处理：配制更换含待测活性物工作浓度的3mL表皮培养基，37℃，5％CO2培养箱继续培养24h。

[0069] 4)黑素小体处理：清洗细胞孔板，加入新鲜角质形成细胞培养液。重悬前期收集的黑素小体于100uL角质形成培养基中，加入15uL重悬液于2mL培养孔中。37℃，5％CO2培养箱继续培养72h。

[0070] 5)收样，免疫荧光：对黑素小体进行免疫组化检测，并用激光共聚焦进行拍照观察，采集图片；使用Image‑ProPlus图像处理软件进行数据分析，采用GraphPadPrismProgram软件作图，各组间采用t‑test统计分析，*P＜0.05表示差异显著，**P＜0.01表示差异极显。

[0071] 所得结果见图2‑6。如图2‑6所示，与BC组相比，三叶鬼针草提取物1、2、3、4对黑素小体的生成都有明显的抑制作用，说明本申请实施例1所制得的三叶鬼针草提取物对肌肤美白的作用较好，可以用作美白类化妆品的添加。

[0072] 综上所述，本申请实施例1所制得的具有显著提升的稳定性的三叶鬼针草提取物，三叶鬼针草中含有多种活性成分，各个活性成分之间可以发生协同作用，能从多种途径出发减少皮肤黑色素。因此，三叶鬼针草提取物可以被应用在皮肤产品中发挥美白的功效。其中，总黄酮类成分能抑制黑素细胞中酪氨酸酶的活性，能够抑制黑色素从黑素细胞中向角质层转移，同时可以清除晚期糖基化产物从而有抗氧化效果，因此对于皮肤美白有促进的作用。总皂苷能够有效抑制α‑MSH引起的酪氨酸酶活性增加和黑素合成增多，且能抑制α‑MSH引起的酪氨酸酶蛋白表达，同时具有清除糖基化产物从而达到抗氧化效果。而维生素能够辅助减少氧自由基实现抗氧化，进而辅助黄酮和皂苷进一步提高对黑素细胞或黑素小体的抑制作用，因此能够有效促进皮肤美白。

[0073] 经以上实验说明，三叶鬼针草提取液通过抑制黑素小体的合成从而减少皮肤黑色素的产生，应当理解，本文所述的示例性实施例是说明性的而非限制性的。尽管结合附图描述了本发明的一个或多个实施例，本领域普通技术人员应当理解，在不脱离通过所附权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以做出各种形式和细节。

[0074] 以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。