一种促软骨修复水凝胶材料及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202111631596.1
文献号 : CN114306732B
文献日 : 2022-11-22
发明人 : 孙烨 , 吴强 , 尤永卿 , 戴尅戎
申请人 : 孙烨
摘要 :
本发明属于软骨修复技术领域，公开了一种促软骨修复水凝胶材料及其制备方法和应用。本发明采用TGF‑β3对BMSC进行预处理以得到TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡，通过BMSC与TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡共同培养得到TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC，将所得产物与具有生物相容性的水凝胶混合均匀以得到促软骨修复水凝胶材料。该材料因TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡之间的协同作用，克服了单纯使用TGF‑β3促使BMSC成软骨分化的局限性，提高了BMSC软骨分化的效率，具有显著优异的软骨修复效果，可应用于受损软骨方面的治疗。
权利要求 :
1.一种促软骨修复水凝胶材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用转化生长因子TGF‑β对BMSC进行预处理培养，所述BMSC摄入转化生长因子TGF‑β后刺激分泌得到TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡，对所述TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡进行过滤、离心和浓缩，收集TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡悬浊液；
(2)将TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡悬浊液和BMSC进行共同培养，促使BMSC摄入TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡，得到含TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC；
(3)将含TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC与具有生物相容性的水凝胶混合均匀，得到促软骨修复水凝胶材料；
所述具有生物相容性的水凝胶为含羟基磷灰石、甘油、明胶和纤维蛋白原的液态物。
2.根据权利要求1所述的促软骨修复水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述转化生长因子TGF‑β为TGF‑β3。
3.根据权利要求1所述的促软骨修复水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述具有生物相容性的水凝胶为1～5mg/mL羟基磷灰石、5～15％v/v甘油、40～50mg/mL明胶和20～
40mg/mL纤维蛋白原的液态物。
4.根据权利要求1所述的促软骨修复水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述含TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC与具有生物相容性的水凝胶的体积比为1:(1～1.5)，所述含8
TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC中BMSC的浓度为(2～2.5)×10/mL。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述方法制备得到促软骨修复水凝胶材料。
6.权利要求5所述促软骨修复水凝胶材料在制备软骨修复材料中的应用。
7.根据权利要求6所述促软骨修复水凝胶材料在制备软骨修复材料中的应用，其特征在于，所述软骨为关节软骨。
8.根据权利要求7所述促软骨修复水凝胶材料在制备软骨修复材料中的应用，其特征在于，所述关节软骨为哺乳动物的膝关节软骨。
9.根据权利要求8所述促软骨修复水凝胶材料在制备软骨修复材料中的应用，其特征在于，所述关节软骨为大鼠的膝关节软骨。
说明书 :
一种促软骨修复水凝胶材料及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于软骨修复技术领域，具体涉及一种促软骨修复水凝胶材料及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 骨关节炎(osteoarthritis,OA)属于关节退行性疾病，以关节面软骨破坏为主要病理特征。OA好发于中老年人，可严重影响生活质量，是中老年群体致残的主要因素之一。现阶段，以修复关节软骨为目标的技术手段成为防治OA的新研究方向。关节软骨由于细胞活跃程度低且无血管供应营养物质，因此再生功能有限，一旦发生破坏便难以逆转，这也是导致OA病情进展的重要因素。
[0003] 目前，使受损的关节面软骨得以修复的一个方法是利用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)行软骨方向分化。但是，在体外，BMSC行软骨方向分化是一个复杂的生物过程，需要通过细胞外多种信号分子调控、多种细胞因子参与、细胞与细胞间的多因素互相协同作用，迄今为止还未有理想的解决方案能够促使BMSC在体外有效分化并且构建关节软骨结构。现有的研究表明，转化生长因子β(transforming growth factor‑β,TGF‑β)能够促进BMSC的软骨分化，是其中的经典细胞因子。TGF‑β能调控BMSC胞内的Smad和BMP等信号通路，从而激活软骨方向的分化信号，能够逆转软骨受损过程，实现软骨修复的目标。单纯利用TGF‑β生长因子刺激间充质干细胞进行软骨分化是一种可行办法，但是由于细胞膜上TGF‑β受体数目有限，且部分受体处于失活状态，因此无法进行大量TGF‑β的跨膜转运。
[0004] CN1653179A公开了一种使用TGF‑β促进软骨再生的方法，通过在将至少一种编码TGF‑β的基因载体导入到相应的结缔组织细胞群中，然后把含有TGF‑β的该类细胞植入骨关节炎区域，通过TGF‑β促进该类细胞的软骨再生，最后用于治疗骨关节炎。该方法的不足之处在于需要构建合适的DNA载体用于编码TGF‑β蛋白，实验操作繁琐、技术难度大，推广应用潜力较为有限；此外，由于体系含有DNA成分，可能会导致不同个体间遗传信息传递带来的风险。
[0005] 鉴于此，有必要设计一种简单、快速并且安全有效的方法用于修复受损软骨，达到治疗骨关节炎的目的。
发明内容
[0006] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的如上不足，而提供一种促软骨修复水凝胶材料及其制备方法和应用，本发明方法结合了TGF‑β和细胞外囊泡各自的生物学优势，通过自体BMSC分泌的含有多种miRNA‑细胞外囊泡用于多种miRNA和TGF‑β的高效跨膜转运，从而增强自身干细胞成软骨分化功能，达到修复受损软骨的目的。
[0007] 本发明的第一目的在于提供一种促软骨修复水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：
[0008] (1)采用转化生长因子TGF‑β对BMSC进行预处理培养，所述BMSC摄入转化生长因子TGF‑β后刺激分泌得到TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡，对所述TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡进行过滤、离心和浓缩，收集TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡悬浊液；
[0009] (2)将TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡悬浊液和BMSC进行共同培养，促使BMSC摄入TGF‑β的miRNA‑细胞外囊泡，得到含TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC；
[0010] (3)将含TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC与具有生物相容性的水凝胶搅拌混合均匀，得到促软骨修复水凝胶材料。
[0011] 在一种优选的实施方式中，所述转化生长因子TGF‑β为TGF‑β3。
[0012] 在一种优选的实施方式中，所述BMSC为自体细胞。
[0013] 在一种优选的实施方式中，所述具有生物相容性的水凝胶为含羟基磷灰石、甘油、明胶和纤维蛋白原的液态物。
[0014] 在一种优选的实施方式中，所述具有生物相容性的水凝胶为1～5mg/mL羟基磷灰石、5～15％v/v甘油、40～50mg/mL明胶和20～40mg/mL纤维蛋白原的液态物。
[0015] 在一种优选的实施方式中，所述含TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC与具有生物相容性的水凝胶的体积比为1:(1～1.5)，所述含TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC中BMSC的浓8
度为(2～2.5)×10/mL。
度为(2～2.5)×10/mL。
[0016] 本发明的第二目的在于提供如上所述方法制备得到促软骨修复水凝胶材料。
[0017] 本发明的第三目的在于提供如上所述促软骨修复水凝胶材料在软骨修复中的应用。
[0018] 在一种优选的实施方式中，所述软骨为关节软骨。
[0019] 在一种优选的实施方式中，所述关节软骨为哺乳动物的膝关节软骨。
[0020] 在一种优选的实施方式中，所述关节软骨为大鼠的膝关节软骨。
[0021] 在一种优选的实施方式中，所述促软骨修复水凝胶材料通过原位注射或静脉注入体循环给药。
[0022] 在一种优选的实施方式中，所述促软骨修复水凝胶材料通过原位注射给药。
[0023] 本发明具有以下技术效果：
[0024] (1)由于细胞外囊泡的囊泡膜和细胞膜的结构组成相似，其具有生物膜的亲和性，囊泡在细胞外以特殊方式进行跨细胞膜转运，能够批量运输TGF‑β3相关因子进入BMSC细胞内，从而规避了由于BMSC细胞膜上TGF‑β3受体数目有限而导致TGF‑β3跨膜转运不足的缺陷，如此以提高BMSC软骨分化的效率。
[0025] (2)细胞外囊泡作为多种miRNA载体，克服了现有技术中单纯使用TGF‑β3促使BMSC成软骨分化的局限性。本发明提供的促软骨修复水凝胶材料中的细胞外囊泡内富集了促软骨形成的miRNA，能够模拟体内成软骨分化的微环境，实现了miRNAs多个靶点激活BMSC的软骨方向分化，TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡之间的协同作用提高了新生软骨细胞的质量，确保了关节软骨修复的稳定性，实现了膝关节透明软骨的体内修复。
[0026] (3)本发明中所使用的BMSC、细胞外囊泡和miRNA均来源于实验受体自身组织，不含其他个体的DNA成分，从而规避了不同个体间遗传信息传递带来的风险，确保了生物安全性，避免了伦理学的相关问题。
附图说明
[0027] 图1为对照组、T3‑EV‑BMSC水凝胶组的受损软骨部位的显微镜观察图(20倍镜)；
[0028] 图2为对照组、T3‑EV‑BMSC组、un‑EV组和TGF‑β3组分别用Saf‑O染色和TB染色显示的软骨细胞分化的显微镜观察图(10倍镜)；
[0029] 图3为对照组、T3‑EV‑BMSC组、un‑EV组和TGF‑β3组用免疫荧光染色显示的软骨特异蛋白的显微镜观察图(20倍镜)；
[0030] 图4为对照组、un‑EV水凝胶组、T3‑EV‑BMSC水凝胶组分别用Saf‑O染色、TB染色和H&E染色显示的受损软骨部位的显微镜观察图(20倍镜)；
[0031] 图5为对照组、un‑EV水凝胶组、T3‑EV‑BMSC水凝胶组用免疫荧光染色显示的受损软骨部位的SOX9和ACAN蛋白的显微镜观察图(20倍镜)。
具体实施方式
[0032] 为了更好地理解本发明，提供下述详细的说明。
[0033] 第一方面，本发明提供了一种促软骨修复水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：
[0034] (1)采用转化生长因子TGF‑β对BMSC进行预处理培养，所述BMSC摄入转化生长因子TGF‑β后刺激分泌得到TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡，对所述TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡进行过滤、离心和浓缩，收集TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡悬浊液；
[0035] (2)将TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡悬浊液和BMSC进行共同培养，促使BMSC摄入含TGF‑β的miRNA‑细胞外囊泡，得到含TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC；
[0036] (3)将含TGF‑β‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC与具有生物相容性的水凝胶搅拌混合均匀，得到促软骨修复水凝胶材料。
[0037] 本发明中，所述软骨是指结缔组织的一种类型，其含有软骨细胞、聚蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白、其他蛋白和水。本发明中所述软骨优选为关节软骨，关节软骨覆盖着关节骨部分的表面，可使关节活动而无直接的骨与骨的接触，从而防止并列骨表面的磨损和伤害。正常的、健康的关节软骨还被描述为“透明软骨”，其表现为抵抗变形的光滑的、坚固的表面，具有毛玻璃的独特外观特点。进一步地，所述关节软骨可以为哺乳动物的膝关节软骨，如大鼠的膝关节软骨。
[0038] 本发明中，所述转化生长因子β(transforming growth factor‑β,TGF‑β)可通过天然、合成或重组等途径获得。脊椎动物体内TGF‑β有5种同分异构体，TGF‑β1～TGF‑β3主要存在于哺乳动物体系中，以TGF‑β1最为丰富。TGF‑β在软骨成骨过程中发挥重要的作用，参与调控软骨细胞的谱系分化、增殖、成熟、凋亡和矿化。本发明中所述TGF‑β优选为TGF‑β3，其可以有效地发挥软骨诱导作用，促进骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞。
[0039] 本发明中，所述骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)为一类起源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能，可分化为多种间质组织，如骨骼、软骨、脂肪和骨髓造血组织等。本发明中BMSC优选为自体细胞，本领域技术人员可以理解为用于修复患者受损软骨的干细胞来源于患者自身的细胞；更优选为大鼠来源的BMSC；本发明中BMSC用于行软骨分化。
[0040] 本发明中，所述多种miRNA(MicroRNA,miRNA)可以结合TGF‑β，共同有效发挥调节BMSC软骨分化的作用，这也是促进关节软骨修复的关键环节。BMSC胞浆内的多种miRNA能够激活转录因子(SOX9)、聚蛋白多糖(Aggrecan,ACAN)和Ⅱ型胶原蛋白(Collagen TypeⅡα,COL2A1)等成软骨基因，同时激活FOX11/FOXO等信号通路，进而完成软骨化转变。
[0041] 本发明中，所述细胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)是一种细胞因子载体，其自身的成分结构由磷脂和脂蛋白构成，和细胞膜相似而具备生物膜的亲和性，可在细胞外以特殊的方式进行跨细胞膜运输进入胞内，同时不受到细胞膜载体数量的限制。此外进入囊泡也可延缓内部的因子渗出，最终延长细胞因子在BMSC内的作用时程。由此，可利用EV作为多种miRNA的理想载体，协助多种miRNA的高效跨膜转运，促使BMSC能够顺利摄取而加速软骨分化，实现软骨再生。
[0042] 本发明中，所述具有生物相容性的水凝胶是一种用于软骨组织工程的材料，可以为细胞的生长提供附着点和物理环境，促进细胞间的接触与信号传递。其结构类似于关节软骨组织外基质，并且具有较高质量的水分，适用于软骨组织工程的材料。
[0043] 根据本发明的一种具体的实施方式，将提取得到的BMSC放置在培养基中培养传代，然后于培养基中加入TGF‑β3溶液继续培养；将所得TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡进行过滤、离心和浓缩，收集悬浊液；接着通过免疫荧光探针PKH26标记TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡，去除游离态PKH26，剩余产物为PKH26‑EVs悬浊液，将PKH26‑EVs悬浊液孵化培养自体BMSC，以获得含TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC；最后将含TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC与具有生物相容性的水凝胶混合均匀，得到促软骨修复水凝胶材料。
[0044] 其中，所述培养基不受限制，只要是能够用于培养BMSC的培养基均可使用，如可以‑1采用由含有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、1％抗生素(100U mL青霉素、100mg‑1 ‑1 ‑3
mL链霉素和0.25mg mL两性霉素B)溶液和1×10 mol丙酮酸钠(sodium pyruvate)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)培养基培养。所述培养条件可以为常规的培养条件，如将细胞培养箱的环境条件设置为温度为37℃，CO2浓度为5％和湿度为95％。
mL链霉素和0.25mg mL两性霉素B)溶液和1×10 mol丙酮酸钠(sodium pyruvate)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)培养基培养。所述培养条件可以为常规的培养条件，如将细胞培养箱的环境条件设置为温度为37℃，CO2浓度为5％和湿度为95％。
[0045] 其中，为了得到TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡，需要选择合适浓度的TGF‑β3溶液对‑1 ‑1BMSC进行培养，TGF‑β3浓度优选为(10～100)ng mL，更优选为(50～100)ng mL，特别优选‑1
为50ng mL。
为50ng mL。
[0046] 本发明中所述具有生物相容性的水凝胶优选为含羟基磷灰石、甘油、明胶和纤维蛋白原的液态物。其中，羟基磷灰石的含量优选为1～5mg/mL，甘油的含量优选为5～15％v/v，明胶的含量优选为40～50mg/mL，纤维蛋白原的含量优选为20～40mg/mL。一种优选实施方式中，所述具有生物相容性的水凝胶为含3mg/mL羟基磷灰石、10％v/v甘油、45mg/mL明胶和30mg/mL纤维蛋白原的液态物。
[0047] 其中，本发明中含TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC与具有生物相容性的水凝胶的体积比优选为1:(1～1.5)，例如，1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，优选为体积比8
为1:1。所述含TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC中BMSC的浓度优选为(2～2.5)×10/mL，
8 8 8 8 8 8
例如2×10/mL、2.1×10 /mL、2.2×10/mL、2.3×10/mL、2.4×10/mL或2.5×10/mL，优选
8
为2×10/mL。
为1:1。所述含TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC中BMSC的浓度优选为(2～2.5)×10/mL，
8 8 8 8 8 8
例如2×10/mL、2.1×10 /mL、2.2×10/mL、2.3×10/mL、2.4×10/mL或2.5×10/mL，优选
8
为2×10/mL。
[0048] 第二方面，本发明提供了如上述所述的方法制备得到促软骨修复水凝胶材料。
[0049] 本发明所提供的促软骨修复水凝胶材料具有良好的生物相容性、生物降解性、生物稳定性和生物安全性。其中，水凝胶为含TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC的细胞生长提供了立体的生长空间，其表面光滑且性状规则，因此该促软骨修复水凝胶材料适用于软骨修复。
[0050] 第三方面，本发明提供了如上述所述的促软骨修复水凝胶材料在软骨修复中的应用。
[0051] 本发明中的软骨修复水凝胶材料可以用于软骨修复，所述软骨包括但不限于关节软骨、肋软骨和鼻软骨，优选为关节软骨，更优选为哺乳动物的膝关节软骨，特别优选为大鼠的膝关节软骨。
[0052] 本发明的促软骨修复水凝胶材料可以通过多种途径给药到个体，如通过原位注射或静脉注入体循环的方式对个体进行给药。由于经静脉注入体循环给药有可能使个体的机体系统暴露于药物环境中，存在一定副作用。因此，优先为原位注射，向需要治疗的个体的病变位置直接给药。
[0053] 本发明的促软骨修复水凝胶材料可以根据包括所使用的特定有效成分的活性、年龄、体重、健康状况、给药时间、给药途径、排出率以及需要预防或治疗的特定疾病的重症等多种因素而进行适当变化，如含TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡的BMSC与具有生物相容性的水凝胶的体积比可以为1:(1～1.5)，如1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5；所述促软骨修复水凝胶材料的给药量可以根据个体的状态、体重、疾病程度、药物形态、给药途径及时间不同，本领域技术人员可以进行适当选择，如可以每周给药1mL、1.5mL、2mL、2.5mL或3mL，给药可以一周一次，也可以分数次进行给药，给药疗程视个体受损软骨修复情况而定。
[0054] 以下将通过实施例和测试例对本发明进行详细描述。
[0055] 实施例1制备促软骨修复水凝胶材料
[0056] 步骤一：收集TGF‑β3‑miRNA‑EV悬浊液
[0057] 从健康的成年大鼠股骨骨髓腔内提取BMSC，放置在含有10％胎牛血清(fetal ‑1 ‑1 ‑1bovine serum,FBS)、1％抗生素(100U mL青霉素、100mg mL链霉素和0.25mg mL两性霉素‑3
B)溶液和1×10 mol丙酮酸钠(sodium pyruvate)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)培养基中进行培养；其中，细胞培养箱的环境条件设置为温度为37℃，CO2浓度为
5％和湿度为95％；
B)溶液和1×10 mol丙酮酸钠(sodium pyruvate)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)培养基中进行培养；其中，细胞培养箱的环境条件设置为温度为37℃，CO2浓度为
5％和湿度为95％；
[0058] 每隔三天更换一次DMEM培养基，当BMSC的密度达到80％时进行细胞传代；
[0059] 当BMSC增殖到第三代时，在上述DMEM培养基中另外添加浓度为50ng‑1mL的TGF‑β3溶液，继续培养七天，得到TGF‑β3‑miRNA‑细胞外囊泡(本发明中，为了方便描述上述所得产物，将其记为TGF‑β3‑miRNA‑EV)；
[0060] 使用多重滤过系统过滤培养基，然后将过滤后的培养基放置在离心机中，以300rpm的转速离心10分钟，除去沉淀的细胞残渣，留取上清液；
[0061] 分别使用孔隙为0.4μm的细胞过滤器和0.22μm的过滤器头对上清液进行两次过滤，除去微小囊泡，留取悬浊液；
[0062] 将悬浊液置入切向流速过滤(tangential flow filtration,TFF)系统中，使用300kDa的截留分子量参数进行过滤，去除可溶性蛋白和抗生素，收集悬浊液；
[0063] 将上述的悬浊液放置在膜过滤系统中持续循环过滤，并且以4mL‑1min的操作速度浓缩悬浊液；
[0064] 向上述浓缩悬浊液加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)，再次利用TFF系统过滤去除可溶性蛋白，最终收集到10mL浓缩的TGF‑β3‑miRNA‑EV悬浊液，并且放置在‑70℃冰箱中保存。
[0065] 步骤二：制备含TGF‑β3‑miRNA‑EV的BMSC
[0066] 用免疫荧光探针PKH26标记TGF‑β3‑miRNA‑EV悬浊液，并用密度梯度离心法纯化悬浊液，去除未与TGF‑β3‑miRNA‑EV悬浊液结合的游离态PKH26，得到PKH26‑TGF‑β3‑miRNA‑EV悬浊液；
[0067] 将EV浓度为5×108/mL的PKH26‑TGF‑β3‑miRNA‑EV悬浊液孵化培养自体BMSC，12小时后形成含TGF‑β3‑miRNA‑EV的BMSC(本发明中，为了方便描述上述所得产物，将其记为T3‑EV‑BMSC)，并使用共聚焦激光扫描显微镜观察细胞形态。
[0068] 步骤三：制备促软骨修复水凝胶材料
[0069] 将高糖DMEM培养基与羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)粉末混合，在37℃条件下搅拌混匀过夜，使HA粉末溶解；
[0070] 向上述所得溶液中加入甘油，搅拌1小时后再添加明胶和纤维蛋白原，震荡1小时，最后制备成含有3mg/mL HA、10％v/v甘油、45mg/mL明胶和30mg/mL纤维蛋白原的液态物；
[0071] 使用0.45μm的过滤器对液态物进行过滤，制备得到水凝胶；
[0072] 将上述所得水凝胶和T3‑EV‑BMSC以1:1的体积比轻柔搅拌，混合均匀，即形成BMSC8
细胞浓度为2.5×10/mL的T3‑EV‑BMSC水凝胶，即为促软骨修复水凝胶材料。
细胞浓度为2.5×10/mL的T3‑EV‑BMSC水凝胶，即为促软骨修复水凝胶材料。
[0073] 实施例2促软骨修复水凝胶材料在大鼠膝关节软骨中的应用
[0074] 取2mL实施例1中制备得到的促软骨修复水凝胶材料(T3‑EV‑BMSC的细胞数为5×8
10)，用注射器注射至大鼠膝关节腔内关节软骨受损的损伤部位，每周一次，连续注射八周。术后八周后大鼠膝关节腔内关节软骨的修复情况见图1。从图1结果可以看出，对照组中受损软骨部位的表面由大量肉芽组织填充，而经过注射促软骨修复水凝胶材料(T3‑EV‑BMSC水凝胶组)的大鼠膝关节中受损软骨部位的表面由新生组织填满，表面光滑平整，与周围组织无明显界限。因此，本申请提供的促软骨修复水凝胶材料能够促进受损软骨的修复，可以应用于修复受损软骨。
10)，用注射器注射至大鼠膝关节腔内关节软骨受损的损伤部位，每周一次，连续注射八周。术后八周后大鼠膝关节腔内关节软骨的修复情况见图1。从图1结果可以看出，对照组中受损软骨部位的表面由大量肉芽组织填充，而经过注射促软骨修复水凝胶材料(T3‑EV‑BMSC水凝胶组)的大鼠膝关节中受损软骨部位的表面由新生组织填满，表面光滑平整，与周围组织无明显界限。因此，本申请提供的促软骨修复水凝胶材料能够促进受损软骨的修复，可以应用于修复受损软骨。
[0075] 测试例1
[0076] 使用大鼠来源的BMSC进行体外培养，诱导软骨分化。设置未经任何分化处理的对照组、经TGF‑β3预处理的EV组(本发明中，为了方便描述上述所得产物，将其记为T3‑EV‑BMSC组)、未经TGF‑β3预处理的EV组(本发明中，为了方便描述上述所得产物，将其记为un‑EV组)和单纯使用TGF‑β3的处理组。
[0077] 未经任何分化处理的对照组：将BMSC放置在含有10％胎牛血清、1％抗生素(100U‑1 ‑1 ‑1 ‑3
mL青霉素、100mg mL链霉素和0.25mg mL两性霉素B)溶液和1×10 mol丙酮酸钠的DMEM培养基中培养。每隔三天更换一次DMEM培养基，当BMSC的密度达到80％时进行细胞传代。
mL青霉素、100mg mL链霉素和0.25mg mL两性霉素B)溶液和1×10 mol丙酮酸钠的DMEM培养基中培养。每隔三天更换一次DMEM培养基，当BMSC的密度达到80％时进行细胞传代。
[0078] T3‑EV‑BMSC组：(1)将BMSC放置在含有10％胎牛血清、1％抗生素(100U‑1mL青霉素、‑1 ‑1 ‑3100mg mL链霉素和0.25mg mL两性霉素B)溶液和1×10 mol丙酮酸钠的DMEM培养基中培养。每隔三天更换一次DMEM培养基，当BMSC的密度达到80％时进行细胞传代；
[0079] (2)BMSC增殖到第三代时，在上述DMEM培养基中另外添加浓度为50ng‑1mL的TGF‑β3溶液，继续培养七天，得到TGF‑β3‑miRNA‑EV；
[0080] (3)七天后使用多重滤过系统过滤培养基，然后将过滤后的培养基放置在离心机中，以300rpm的转速离心10分钟，除去沉淀的细胞残渣，留取上清液；
[0081] (4)分别使用孔隙为0.4μm的细胞过滤器和0.22μm的过滤器头对上清液进行两次过滤，除去微小囊泡，留取悬浊液；
[0082] (5)将悬浊液置入TFF系统中，使用300kDa的截留分子量参数进行过滤，去除可溶性蛋白和抗生素，收集悬浊液；
[0083] (6)将上述悬浊液放置在膜过滤系统中持续循环过滤，并且以4mL‑1min的操作速度浓缩悬浊液；
[0084] (7)将上述悬浊液加入磷酸盐缓冲液，再次利用TFF系统过滤去除可溶性蛋白，最终收集到10mL浓缩的TGF‑β3‑miRNA‑EV悬浊液；
[0085] (8)用免疫荧光探针PKH26标记TGF‑β3‑miRNA‑EV悬浊液，并用密度梯度离心法纯化悬浊液，去除未与TGF‑β3‑miRNA‑EV悬浊液结合的游离态PKH26，得到PKH26‑TGF‑β3‑miRNA‑EV悬浊液；
[0086] (9)将EV浓度为5×108/mL的PKH26‑TGF‑β3‑miRNA‑EV悬浊液孵化培养自体BMSC，12小时后形成T3‑EV‑BMSC。
[0087] un‑EV组：(1)将BMSC放置在含有10％胎牛血清、1％抗生素(100U‑1mL青霉素、‑1 ‑1 ‑3100mg mL链霉素和0.25mg mL两性霉素B)溶液和1×10 mol丙酮酸钠的DMEM培养基中培养，每隔三天更换一次DMEM培养基，当BMSC的密度达到80％时进行细胞传代，培养到第三代时，继续培养七天；
[0088] (2)七天后使用多重滤过系统过滤培养基，然后将过滤后的培养基放置在离心机中，以300rpm的转速离心10分钟，除去沉淀的细胞残渣，留取上清液；
[0089] (3)分别使用孔隙为0.4μm的细胞过滤器和0.22μm的过滤器头对上清液进行两次过滤，除去微小囊泡，留取悬浊液；
[0090] (4)将悬浊液置入切TFF系统中，使用300kDa的截留分子量参数进行过滤，去除可溶性蛋白和抗生素，收集悬浊液；
[0091] (5)将上述悬浊液放置在膜过滤系统中持续循环过滤，并且以4mL‑1min的操作速度浓缩悬浊液；
[0092] (6)将上述悬浊液加入磷酸盐缓冲液，再次利用TFF系统过滤去除可溶性蛋白，最终收集到10mL浓缩的EV‑miRNA悬浊液；
[0093] (7)用免疫荧光探针PKH26标记EV‑miRNA悬浊液，并用密度梯度离心法纯化悬浊液，去除未与EV结合的游离态PKH26，得到PKH26‑EV‑miRNA悬浊液；
[0094] (8)将EV浓度为5×108/mL的PKH26‑EV‑miRNA悬浊液孵化培养自体BMSC，12小时后形成含EV‑miRNA的BSMC(本发明中，为了方便描述上述所得产物，将其记为un‑EV)。
[0095] 单纯使用TGF‑β3组：将BMSC放置在含有10％胎牛血清、1％抗生素(100U‑1mL青霉‑1 ‑1 ‑3 1素、100mg mL链霉素和0.25mg mL两性霉素B)溶液、1×10 mol丙酮酸钠和50ngmL TGF‑β3的DMEM培养基中培养；每隔三天更换一次DMEM培养基，当BMSCs的密度达到80％时进行细胞传代。
[0096] 在软骨分化培养后的第21天，运用番红固绿(Safranin‑O staining,Saf‑O)和阿尔新蓝(Alcian blue staining,TB)这两种软骨特异性染色的方法，显微镜观察软骨细胞形成情况，实验结果见图2。从图2结果可以看出，T3‑EV‑BMSC组的颜色最深，证明了T3‑EV‑BMSC的体外促软骨分化的效果最好。
[0097] 同样在第21天，使用免疫荧光染色显微镜观察四组细胞的转录因子SOX9、聚蛋白多糖(Aggrecan,ACAN)和Ⅱ型胶原蛋白(Collagen TypeⅡα,COL2A1)这三种软骨特异蛋白的表达情况，实验结果见图3。从图3结果可以看出，T3‑EV‑BMSC组的蛋白荧光表达最强，从另一方面说明了T3‑EV‑BMSC组具有最佳的促软骨形成效应。
[0098] 测试例2
[0099] 大鼠膝关节的OA造模：将大鼠麻醉后，沿右侧膝关节外行纵行切开，暴露髌骨并将其脱位，使膝关节腔完全暴露，使用电钻在股骨远端的滑车槽中形成圆柱状缺损(直径为2mm，深度3mm)。
[0100] 设置生理盐水注射的对照组、经un‑EV处理的凝胶组(本发明中，为了方便描述上述所得产物，将其记为un‑EV水凝胶组)和经T3‑EV‑BMSC组处理的凝胶组(本发明中，为了方便描述上述所得产物，将其记为T3‑EV‑BMSC水凝胶组)。
[0101] un‑EV水凝胶的制备：将测试例1中制备得到的un‑EV和实施例1步骤三中制备得到的水凝胶以1:1的体积比轻柔搅拌，混合均匀，得到un‑EV水凝胶。
[0102] T3‑EV‑BMSC水凝胶的制备：将测试例1中制备得到的T3‑EV‑BMSC和实施例1步骤三中制备得到的水凝胶以1:1的体积比轻柔搅拌，混合均匀，得到T3‑EV‑BMSC水凝胶。
[0103] 在股骨滑车槽形成软骨缺损后，用缝合线(4‑0线)闭合手术的膝关节，并通过肌肉注射抗生素预防感染。从术后第1周至第8周，分别向对照组的膝关节腔内注射2mL生理盐水，向un‑EV水凝胶组的膝关节腔内注射2mL的un‑EV水凝胶，向T3‑EV‑BMSC水凝胶组的膝关节腔内注射2mL的T3‑EV‑BMSC水凝胶；以上三组每周同一时间点注射一次。造模后第24周，取膝关节软骨进行H&E组织学染色、Saf‑O染色和TB染色，显微镜观察受损软骨的修复情况，实验结果见图4。从图4的H&E染色结果可以看出，T3‑EV‑BMSC水凝胶组的新生软骨形态正常、软骨外基质丰富，同时，T3‑EV‑BMSC水凝胶组的Saf‑O和TB染色效果也是最佳。
[0104] 同样在造模后第24周，对膝关节软骨行免疫荧光染色，显微镜观察SOX9和ACAN蛋白的表达，实验结果见图5；从图5中SOX9和ACAN的荧光强度表达情况，证明了T3‑EV‑BMSC水凝胶组的BMSC成软骨分化完整，达到了软骨受损后的有效再生修复。
[0105] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。