一种在可降解金属表面构建金属-有机分子复合物与无机相杂化功能涂层的方法

摘要

本发明公开了一种在可降解金属表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层的方法，该方法先通过液相化学沉积法，在未处理的可降解金属表面生成一层粗糙稳定的无机磷酸锌涂层；再将表面为无机磷酸锌涂层的可降解金属在胶原蛋白/阿魏酸/羟基乙叉二磷酸混合溶液和金属离子溶液中进行循环交替蒸发沉积，得到金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层。本发明通过有机功能分子与金属离子、无机组分之间的化学配位作用，复合杂化形成了致密、均一，并具有高亲水性和表面能的金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层，在兼顾可降解金属腐蚀降解控制与生物相容性的同时也具备较好的骨整合、骨再生、血管再生和抗菌抗炎的生物功能。

权利要求

1.一种在可降解金属表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将经预处理的可降解金属置于磷酸锌沉积液中，于40～60℃加热反应1.5～2.5h后，取出清洗干净，而后干燥至表面液体挥发；

(2)将阿魏酸、羟基乙叉二磷酸和水按料液比为1～5mg:0.5～2mg:1ml混合，于60～80℃下搅拌至充分溶解，其后冷却至35～40℃，得混合液；再将混合液和胶原蛋白按液料比

1ml：8～12mg混合，于35～40℃下搅拌20～40min后，调节溶液pH到5.5～6.5，得混合溶液A；

(3)将经步骤(1)处理后的可降解金属放入混合溶液A中，4～6秒钟后取出干燥至表面液体挥发；

(4)将经过步骤(3)处理后的可降解金属放入浓度为5～12mg/ml、pH为5.5～6.5的配位离子溶液中浸泡4～6min，其后取出干燥至表面液体挥发；

(5)重复步骤(3)、(4)3～6次，即可；

步骤(1)中磷酸锌沉积液由以下步骤制得：将6～9mg/ml磷酸二氢钠溶液与1～3mg/ml硝酸锌溶液按体积比5：2混合，或者是将10～15mg/ml磷酸溶液与10～15mg/ml硝酸锌溶液按体积比5：2混合；

步骤(2)中阿魏酸、羟基乙叉二磷酸和水按料液比为3mg:1.5mg:1ml混合；

步骤(2)中混合液和胶原蛋白按液料比1ml：10mg混合。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中可降解金属的预处理过程包括以下步骤：先对可降解金属进行打磨处理，然后放入无水乙醇中超声清洗10～20min。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(4)中所述配位离子溶液为镁离子溶液、钙离子溶液、亚铁离子溶液、铜离子溶液、锌离子溶液、锶离子溶液或铬离子溶液。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，镁离子溶液的由以下步骤制得：将无水硫酸镁溶于37℃的水中，再于37℃下搅拌至溶解，配置成5～12mg/ml的镁离子溶液。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述干燥方法为于37℃下干燥至表面液体挥发。

6.采用权利要求1～5任一项所述的构建方法制备得到的表面构建有金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层的可降解金属。

7.根据权利要求6所述的表面构建有金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层的可降解金属在制备骨修复材料或心血管疾病防治材料中的应用。

说明书

一种在可降解金属表面构建金属‑有机分子复合物与无机相

杂化功能涂层的方法

技术领域

[0001] 本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种在可降解金属表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层的方法。

背景技术

[0002] 与传统的金属植入材料相比，可降解金属作为临时的植入物，具备能避免二次手术并加速愈合过程等显著优点，由此大大降低了风险。基于以上优势，可降解锌材料渐渐进入人们的视野，引发广泛关注。到目前为止，可降解金属主要分为镁、铁和锌。而可降解金属锌相对于镁、铁因其自身相对适中的腐蚀速率和潜在的生物功能性，有望用于骨科疾病和心血管疾病的治疗。但由于可降解锌基金属缺乏良好的腐蚀降解模式和生物功能性，限制了其进一步的应用。对于这些不足，通过对锌基金属表面进行改性可以极大程度的解决这些问题。

[0003] 目前在关于锌基金属表面改性的研究中，大多以单一的无机涂层为主，无机涂层可以在一定程度上改善可降解锌基金属的腐蚀行为，但无法兼顾锌基可降解金属在生物相容性方面的提高，且经过无机涂层改性后的锌不能满足作为植入体材料所需的综合生物功能性，例如：骨整合、骨再生、血管再生和抗菌抗炎等功能。

发明内容

[0004] 针对上述问题，本发明提供一种在可降解金属表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层的方法，以解决现有表面改性技术中，无法兼顾锌基可降解金属的腐蚀行为调控与生物相容性的提升，以及生物功能性不足的问题。

[0005] 为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种在可降解金属表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层的方法，包括以下步骤：

[0006] (1)将经预处理的可降解金属置于磷酸锌沉积液中，于40～60℃加热反应1.5～2.5h后，取出清洗干净，而后干燥至表面液体挥发；

[0007] (2)将阿魏酸、羟基乙叉二磷酸和水按料液比为1～5mg:0.5～2mg:1ml混合，于60～80℃下搅拌至充分溶解，其后冷却至35～40℃，得混合液；再将混合液和胶原蛋白按液料比1ml：8～12mg混合，于35～40℃下搅拌20～40min后，调节溶液pH到5.5～6.5，得混合溶液A；

[0008] (3)将经步骤(1)处理后的可降解金属放入混合溶液A中，4～6秒钟后取出干燥至表面液体挥发；

[0009] (4)将经过步骤(3)处理后的可降解金属放入浓度为5～12mg/ml、pH为5.5～6.5的配位离子溶液中浸泡4～6min，其后取出干燥至表面液体挥发；

[0010] (5)重复步骤(3)、(4)3～6次，即可。

[0011] 通过化学液相沉积法在可降解金属表面生成一层粗糙稳定的无机磷酸锌涂层；再将表面为无机磷酸锌涂层的可降解金属在胶原蛋白/阿魏酸/羟基乙叉二磷酸混合溶液和富含镁离子、钙离子、亚铁离子、铜离子、锌离子、锶离子、铬离子的溶液中进行多次循环交替蒸发沉积，形成金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层。在混合溶液中，阿魏酸和羟基乙叉二膦酸与胶原蛋白中的亲水基团通过氢键等分子间作用力相结合，形成胶原蛋白/阿魏酸/羟基乙叉二磷酸复合物，再通过与磷酸锌层的物理吸附和化学配位作用蒸发沉积在磷酸锌表面，进一步地通过与富含镁离子、钙离子、亚铁离子、铜离子、锌离子、锶离子、铬离子的溶液进行化学配位，增加了涂层各有机组分之间的交联程度，提高涂层整体的质量，形成金属‑有机分子复合物，经过几次循环交替沉积，最终胶原蛋白/阿魏酸/羟基乙叉二磷酸复合物与磷酸锌层、金属离子之间复合杂化形成均一、致密和稳定的金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层。

[0012] 进一步，步骤(1)中可降解金属的预处理过程包括以下步骤：先对可降解金属进行打磨处理，然后放入无水乙醇中超声清洗10～20min。

[0013] 进一步，步骤(1)中磷酸锌沉积液由以下步骤制得：将6～9mg/ml磷酸二氢钠溶液与1～3mg/ml硝酸锌溶液按体积比5：2混合，或者是将10～15mg/ml磷酸溶液与10～15mg/ml硝酸锌溶液按体积比5：2混合。

[0014] 进一步，步骤(2)中阿魏酸、羟基乙叉二磷酸和水按料液比为3mg:1.5mg:1ml混合。

[0015] 进一步，步骤(2)中混合液和胶原蛋白按液料比1ml：10mg混合。

[0016] 进一步，步骤(4)中所述配位离子溶液为镁离子溶液、钙离子溶液、亚铁离子溶液、铜离子溶液、锌离子溶液、锶离子溶液、铬离子溶液。

[0017] 进一步，镁离子溶液由以下步骤制得：将无水硫酸镁溶于37℃的水中，再于37℃下搅拌至溶解，配置成5～12mg/ml的镁离子溶液。

[0018] 进一步，干燥方法为于37℃下干燥至表面液体挥发。

[0019] 本发明还提供了上述表面构建有金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层的可降解金属在制备骨修复材料或心血管疾病防治材料中的应用。

[0020] 本发明的有益效果是：

[0021] 1、本发明提供了一种在可降解金属表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层的方法。先通过液相化学沉积法，在未处理的可降解金属表面生成一层粗糙稳定的无机磷酸锌涂层；再将表面为无机磷酸锌涂层的可降解金属在胶原蛋白/阿魏酸/羟基乙叉二磷酸混合溶液和金属离子溶液中进行循环交替蒸发沉积，最终得到金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层。本发明构建的功能涂层，在兼顾可降解金属腐蚀降解控制与生物相容性的同时也具备较好的骨整合、骨再生、血管再生以及抗菌抗炎的生物功能。

[0022] 2、本发明构建功能层在兼顾可降解金属腐蚀降解控制与生物相容性的同时也具备较好的骨整合、骨再生、血管再生以及抗菌抗炎的生物功能；一方面通过金属离子，胶原蛋白/阿魏酸/羟基乙叉二磷酸有机分和无机磷酸锌层复合杂化形成了金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层，在结构上均一致密，性质上稳定牢固，为可降解金属提供了很好的腐蚀保护；功能层中的金属‑有机分子复合物可以螯合植入体环境中的钙离子，并诱导活性钙磷盐的沉积，进一步调控锌基金属的腐蚀性为和骨整合能力；另一方面功能层的胶原蛋白是人体的天然组织，保证了涂层的生物相容性。由于阿魏酸的存在涂层可以很好的促进内皮细胞的增殖和黏附，并具有潜在血管生成的作用，同时阿魏酸是一种天然类酚酸，具有出色的抗菌抗炎能力。羟基乙叉二磷酸不仅是很好的缓蚀剂，同时能促成骨细胞黏附和增殖，并具有潜在骨生成的作用。最后金属离子的加入不仅增加了涂层整体的交联度来形成更稳定的涂层结构，同时金属离子会赋予涂层不同的生物学功能。该功能涂层通过各组分间的联合作用赋予了可降解金属相应的生物功能性，在制备骨修复材料或心血管疾病植入材料中具有潜在的应用价值。

附图说明

[0023] 图1为锌片表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层后SEM照片；

[0024] 图2为金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层及构建所用组分的红外光谱图；

[0025] 图3为纯锌表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层前后的电化学表征结果；

[0026] 图4为纯锌表面构建改性金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层前后水接触角及表面能测试；

[0027] 图5为纯锌表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层前后表面钙磷盐沉积结果；

[0028] 图6为纯锌表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层前后成骨细胞直接培养荧光染色图；

[0029] 图7为成骨细胞直接培养黏附细胞数统计；

[0030] 图8为纯锌表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层前后内皮细胞直接培养荧光染色图；

[0031] 图9为内皮细胞直接培养黏附细胞数统计；

[0032] 图10为纯锌表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层前后巨噬细胞直接培养荧光染色图；

[0033] 图11为巨噬细胞直接培养黏附细胞数统计；

[0034] 图12为纯锌表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层前后炎症因子TNF‑α浓度；

[0035] 图13为纯锌表面金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层前后金黄葡萄球菌与大肠杆菌样品表面的菌落数；

[0036] 图14为纯锌表面金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层前后细菌悬浮液中金黄葡萄球菌的抗菌率；

[0037] 图15为纯锌表面金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层前后细菌悬浮液中大肠杆菌的抗菌率。

具体实施方式

[0038] 下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

[0039] 实施例1

[0040] 一种在可降解金属表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层的方法，包括以步骤：

[0041] (1)预的处理：将圆片纯锌依次用600#、1200#、2000#的砂纸打磨平整，并用无水乙醇在超声下清洗3次，每次5分钟，放于室温下干燥至表面液体挥发；

[0042] (2)磷酸锌打底层的制备：将7.5mg/ml NaH2PO4和2mg/ml的Zn(NO3)2·6H2O溶液按体积比5：2混合后，置于50℃水浴锅中反应2h，然后将步骤(1)中干燥后的锌片置于其中，于50℃加热反应2h后，取出用水冲洗干净，而后置于37℃恒温干燥箱干燥至表面液体挥发；

[0043] (3)将阿魏酸、羟基乙叉二磷酸和水按料液比为3mg:1.5mg:1ml混合均匀，于70℃下搅拌至充分溶解，其后冷却至37℃，得混合液；再将混合液和胶原蛋白按液料比1ml：10mg混合均匀，于37℃下搅拌30min后，用0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH到6，得混合溶液A；

[0044] (4)将步骤(2)所得干燥后的样品放入混合溶液A中，5秒钟后取出置于37℃恒温干燥箱至干燥表面液体挥发；

[0045] (5)将12mg/ml的MgSO4溶液用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至6，其后将步骤(4)所得干燥后的样品锌放入其中浸泡5min，取出置于37℃恒温干燥箱至表面液体挥发；

[0046] (6)重复步骤(4)、(5)5次，即可。

[0047] 实施例2

[0048] 一种在可降解金属表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层的方法，包括以步骤：

[0049] (1)预的处理：将纯镁样品依次用600#、1200#、2000#的砂纸打磨平整，并用无水乙醇在超声下清洗3次，每次4分钟，放于室温下干燥至表面液体挥发；

[0050] (2)磷酸锌打底层的制备：将6mg/ml Na2HPO4和1mg/ml的Zn(NO3)·6H2O溶液按体积比5：2混合后，置于50℃水浴锅中反应2h，然后将步骤(1)中干燥后的样品置于其中，于60℃加热反应1.5h后，取出用水冲洗干净，而后于室温干燥至表面液体挥发；

[0051] (3)将阿魏酸、羟基乙叉二磷酸和水按料液比为1.5mg:1mg:1ml混合均匀，于60℃下搅拌至充分溶解，其后冷却至35℃，得混合液；再将混合液和胶原蛋白按液料比1ml：9mg混合均匀，于35℃下搅拌40min后，用0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH到6.5，得混合溶液A；

[0052] (4)将步骤(2)所得干燥后的样品放入混合溶液A中，6秒钟后取出置于35℃恒温干燥箱至干燥表面液体挥发；

[0053] (5)将5mg/ml的MgSO4溶液用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至6.5，其后将步骤(4)所得干燥后的样品镁放入其中浸泡6min，取出置于35℃恒温干燥箱至表面液体挥发；

[0054] (6)重复步骤(4)、(5)4次，即可。

[0055] 实施例3

[0056] 一种在可降解金属表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层的方法，包括以步骤：

[0057] (1)预的处理：将纯铁样品进行抛光去除表面氧化层使纯铁暴露出来，并用无水乙醇在超声下清洗3次，每次6分钟，放于室温下干燥至表面液体挥发；

[0058] (2)磷酸锌打底层的制备：将9mg/ml Na2HPO4和3mg/ml的Zn(NO3)·6H2O溶液按体积比5：2混合后，置于50℃水浴锅中反应2h，然后将步骤(1)中干燥后的纯镁样品置于其中，于40℃加热反应2.5h后，取出用水冲洗干净，而后于室温干燥至表面液体挥发；

[0059] (3)将阿魏酸、羟基乙叉二磷酸和水按料液比为5mg:2mg:1ml混合均匀，于60℃下搅拌至充分溶解，其后冷却至35℃，得混合液；再将混合液和胶原蛋白按液料比1ml：12mg混合均匀，于40℃下搅拌20min后，调节溶液pH到5.5，得混合溶液A；

[0060] (4)将步骤(2)所得干燥后的样品放入混合溶液A中，4秒钟后取出置于40℃恒温干燥箱至干燥表面液体挥发；

[0061] (5)将7mg/ml的CuSO4溶液用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至5.5，其后将步骤(4)所得干燥后的样品铁放入其中浸泡4min，取出置于40℃恒温干燥箱至表面液体挥发；

[0062] (6)重复步骤(4)、(5)6次，即可。

[0063] 实施例4

[0064] 一种在可降解金属表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能涂层的方法，包括以步骤：

[0065] (1)预的处理：将圆片纯锌依次用600#、1200#、2000#的砂纸打磨平整，并用无水乙醇在超声下清洗3次每次5分钟，放于室温下干燥至表面液体挥发；

[0066] (2)磷酸锌打底层的制备：将12mg/ml磷酸溶液和12mg/ml硝酸锌溶液按体积比5：2混合后，置于50℃水浴锅中反应2h，然后将步骤(1)中干燥后的锌片置于其中，于50℃加热反应2h后，取出用水冲洗干净，而后置于37℃恒温干燥箱干燥至表面液体挥发；

[0067] (3)将阿魏酸、羟基乙叉二磷酸和水按料液比为1mg:0.5mg:1ml混合均匀，于70℃下搅拌至充分溶解，其后冷却至37℃，得混合液；再将混合液和胶原蛋白按液料比1ml：8mg混合均匀，于37℃下搅拌30min后，用0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH到6调节溶液pH到6，得混合溶液A；

[0068] (4)将步骤(2)所得干燥后的样品放入混合溶液A中，5秒钟后取出置于37℃恒温干燥箱至干燥表面液体挥发；

[0069] (5)将6mg/ml的ZnSO4溶液用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至6，其后将步骤(4)所得干燥后的样品放入其中浸泡5min，取出置于37℃恒温干燥箱至表面液体挥发；

[0070] (6)重复步骤(4)、(5)3次，即可。

[0071] 下面通过对SEM对实施例1所得样品表面形貌进行观测：

[0072] 制备的涂层如图1所示，可以看到，经过砂纸打磨后的锌片表面平整且有划痕；表面构建有金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层的锌，表面被胶原蛋白完整覆盖，并且在胶原蛋白表面可以看到由胶原蛋白、阿魏酸、羟基乙叉二磷酸和镁离子配位形成的络合物。

[0073] 下面对胶原蛋白、阿魏酸、羟基乙叉二磷酸粉末通过压片法进行红外光谱测试，对实施例1所得表面构建有金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层的锌片通过反射法进行红外光谱测试：

[0074] 红外光谱测试结果如图2，在1469cm‑1和1646cm‑1处分别出现了酰胺Ⅰ键和酰胺Ⅱ‑1 ‑1键的伸缩振动峰，来源于胶原蛋白中的氨基，在1523cm 和1686cm 处分别出现了C＝O和C‑1
＝C的特征峰，来源于阿魏酸中的羧基和芳香族的碳碳双键，在1193cm 处出现了P＝O的特征峰，来源于羟基乙叉二磷酸中的磷酸基团，这表明金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层已经成功制备在纯锌表面。

[0075] 下面利用IM6电化学工作站对对实施例1所得表面构建有金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层的锌片进行动电位极化曲线测试：

[0076] 将背面打磨好的锌片及样品用导电银胶接上导线，用硅橡胶进行封样，使图层面露出。将样品放入以Hank's为电解液的三通管中，其中以饱和甘汞电极作为参比电极，金属铂作为对比电极，样品为工作电极，利用IM6电化学工作站对样品进行动电位极化曲线测试。

[0077] 样品极化曲线如图3所示，可以看出，经过金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层修饰后的锌表面相对于纯锌具有更正的自腐蚀电位Ecorr，同时自腐蚀电流减小，说明改性后的涂层可以减缓锌基底的腐蚀，控制腐蚀模式。

[0078] 下面测试实施例1所得表面构建有金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层的锌片的水接触角及表面能：

[0079] 1、在纯锌和表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层的样品表面滴加5μL RO水，拍照，测试水接触角。

[0080] 2、在纯锌和表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层的样品表面滴加1μL二碘甲烷，测试接触角。

[0081] 测得的水接触角及表面能如图4所示，可以看出表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层的锌水接触角为12°，表面能相比于锌明显上升，这是由于胶原蛋白、阿魏酸和羟基乙叉二磷酸中有大量的亲水基团，增加了表面能。同时和镁离子形成的络合物使锌的表面具备多尺度的微纳结构，增加了比表面积，进而表面能升高。

[0082] 下面测试实施例1中纯锌表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层前后表面钙磷盐沉积结果：

[0083] 1、配置饱和磷酸钙溶液：将3.87mM CaCl2、2.32mM NH4H2PO4和50mM NaCl溶液在25℃下混合，用50mM Tris溶液调节pH至7.2；

[0084] 2、将样品放入饱和磷酸钙溶液中10s后拿出，放于真空干燥箱干燥30min，重复上述步骤10次后，将样品放入饱和磷酸钙溶液中，在37.5℃条件下静置12h，清洗干燥后备用。

[0085] 对样品进行SEM观察，结果如图5，与纯锌相比，表面构建离子交联改性胶原蛋白功能层后的样品表面明显形成了更厚的钙磷盐层，并且于纯锌对照相比，它们表现出晶体的结构。这表明表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层后的样品促进了钙磷盐的沉积。这主要是改性后涂层形成了致密的结构和涂层中胶原蛋白等组分中的官能团能够更好的吸附钙磷盐。

[0086] 下面评价实施例1制得涂层的生物相容性：

[0087] 使用细胞为小鼠前成骨细胞(MC3T3‑E1)，小鼠内皮细胞(EC)，小鼠巨噬细胞(MA)，购于武汉塞维尔科技有限公司。细胞培养基使用添加10％FBS的DMEM(赛默飞世尔仪器有限公司，苏州)。在细胞培养至单层铺满80％左右，即可进行接种实验，具体步骤如下：

[0088] 实验准备：将实验所需耗材及样品进行灭菌(耗材采用高温高压灭菌，样品进行紫外灭菌，正反面各30min)

[0089] 在超净工作台，取出细胞单层铺满80％以上的细胞培养瓶，倒去培养基，用PBS清洗三次，用吸管吸净后，均匀加入1ml胰酶至细胞培养瓶中进行消化，经过1分钟后，加入3ml培养基终止消化并进行吹打，防止细胞团聚，最后加入新的培养基得到细胞密度为10000cell/ml的细胞悬液。

[0090] 接种：用移液枪将细胞悬液滴加到样品表面，每孔1ml，然后放入条件为5％CO2、37℃的细胞恒温孵箱中培养，其中成骨细胞和内皮细胞培养6h、12h、24h，巨噬细胞培养6h、24h。

[0091] 利用罗丹明进行细胞染色，以观察细胞生长形态，具体染色步骤如下：

[0092] 1、固定：吸取24孔板中的培养基，用生理盐水清洗三次，加入2.5％的戊二醛固定4h；

[0093] 2、染色：吸出戊二醛固定液，并用生理盐水清洗3遍，在避光条件下滴加100μl罗丹明溶液浸泡2min即可。

[0094] 3、通过荧光显微镜观察细胞黏附数量及状态。

[0095] 通过Elisa试剂盒测量TNF‑α炎症因子的浓度具体步骤如下：

[0096] 1、设置标准孔：分别向试剂盒用的酶标板中加入5种不同浓度标准品溶液，每孔50μl，其中TNF‑α试剂盒中标准品浓度为480、320、160、80、40ng/L。

[0097] 2、设置样品孔：先在待测样品孔中，加入40μl样品稀释液，再加入10μl待测样品；

[0098] 3、加酶：每孔加入酶标试剂50μl；

[0099] 4、孵育：将酶标板用封膜密封，放入37℃孵箱孵育30min；

[0100] 5、反应：取出酶标板，吸出液体，加入洗涤液清洗5次后，分别加入Elisa试剂盒中的显色剂A液和显色剂B液各50μl，避光，放入孵箱反应15min；

[0101] 6、终止反应和测量；孵育完成后每孔加入50μl终止液体，利用酶标仪测量450nm处溶液吸光度值，计算浓度。

[0102] 成骨细胞的培养如图6‑7，由荧光图片可以看出，未改性的纯锌表面成骨细胞形态皱缩，随着培养时间增加，数量逐渐减少。经过本发明在金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层后的锌，细胞数量明显多于纯锌，经过6小时培养后细胞开始铺展，随着培养时间增加，细胞数量增加，形态更好。内皮细胞的培养如图8‑9，未改性的纯锌表面内皮细胞在培养6小时左右就基本上死亡，表面构建改性胶原蛋白‑金属离子复合功能层后的样品在6小时培养后，内皮细胞形态为球状还未开始黏附，当培养12h和24h时，内皮细胞具有梭状的形态，且数量明显增多。巨噬细胞的培养如图10‑12，培养6h后纯锌表面的巨噬细胞形态有一定的铺展，培养24h后细胞数量有一定的减少，表面构建离改性胶原蛋白‑金属离子复合功能层后的样品在经过6h的培养后巨噬细胞减少，24h后细胞数量显著减少，说明改性后的样品具有更显著的抑制巨噬细胞生长的能力。表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层后的样品相对于纯锌的TNF‑α含量有一定的降低，表明涂层改性样品不会引起巨噬细胞的激活，导致严重的炎症反应。胶原蛋白对成骨细胞和内皮细胞都具备良好的生物相容性，而阿魏酸、羟基乙叉二膦酸及镁离子的加入能在胶原蛋白的基础上进一步增强成骨细胞和内皮细胞的生物相容性，同时还能抑制炎症因子的表达。

[0103] 下面对表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层后的样品进行抗菌性能评价：

[0104] 1、实验准备：将实验所需耗材及样品进行灭菌(耗材采用高温高压灭菌，样品进行紫外灭菌，正反面各30min)；

[0105] 2、复苏细菌：在LB平板上划线复苏金黄葡萄球菌和大肠杆菌；

[0106] 3、次日调取单菌落，接种至液体培养基中，吸取菌液，将新鲜细菌悬液稀释至光密度0.02(600nm的吸光光度值)；

[0107] 4、接种：吸取适当体积菌液，保证菌体总浓度为1*106CFU/ml，用移液枪将细菌悬液滴加到样品表面，每孔1ml，置于37℃培养24h，其中无样品的细菌悬浮液作为阴性对照；24后通过波长为600nm的吸收光度值，测量来自每个样品的100μl细菌悬液的吸光度值，并根据公式并根据公式AR(％)＝(ODcontrol‑ODsample)/ODcontrol计算抗菌率。ODcontrol是阴性对照组不锈钢的OD值；ODsample是样品组的OD值。

[0108] 5、将样品转移到含有5ml细菌液体培养基的无菌离心管中，以最大转速漩涡震荡1min，以去除表面的细菌，收集细菌悬浮液，并稀释100倍，用菌液30μl/皿进行涂板，讲平板倒置放入37℃孵箱中培养12h，数菌落计算抗菌率。

[0109] 菌落数结果和抗菌率如图13‑15，可以看出与未改性的纯锌相比，表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层后的样品表面所黏附的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的数目大大减少。这说明表面构建金属‑有机分子复合物与无机相杂化功能层后的样品具备很好的抗菌性能。

[0110] 虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。