一种脐带血冻存液及其冻存方法

摘要

本发明涉及医学技术领域，具体公开了一种脐带血冻存液及其冻存方法。所述的脐带血冻存液，其包含如下重量份的组分：DMSO 40～60份；葡萄糖3～5份；氯化钠0.2～0.5份；中药提取物1～3份；无菌水40～60份。所述的冻存方法为：将脐带血装入冻存袋中，然后再加入本发明所述的脐带血冻存液；接着在4℃的水域中进行预冷冻；进一步将冻存袋放入降温箱中降温至‑80℃后转移至液氮中保存。研究表明：该脐带血冻存液通过加入了由中药血风藤为原料提取得到的中药提取物，其可以有效地提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率。

权利要求

1.一种脐带血冻存液，其特征在于，包含如下重量份的组分：

DMSO 40～60份；葡萄糖 3～5份；氯化钠 0.2～0.5份；中药提取物 1～3份；无菌水 40～60份；

所述的中药提取物通过包含如下步骤的方法制备得到：

取中药血风藤用有机溶剂进行加热回流提取，提取结束后将提取液进行浓缩干燥即得有机溶剂提取物；所述的有机溶剂是由甲醇和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂；其中，甲醇和乙酸乙酯的体积比为5:1；所述中药血风藤和有机溶剂的用量比为1g:10mL；

将有机溶剂提取物进一步上硅胶柱，先用3倍柱体积的体积比为93:7的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积比为83:17的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为83:17的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。

2.根据权利要求1所述的脐带血冻存液，其特征在于，包含如下重量份的组分：DMSO 50～60份；葡萄糖 3～4份；氯化钠 0.3～0.4份；中药提取物 1～2份；无菌水 40～50份。

3.一种脐带血的冻存方法，其特征在于，包含如下步骤：将脐带血装入冻存袋中，然后再加入权利要求1～2任一项所述的脐带血冻存液；接着在4℃的水浴中进行预冷冻；再将冻存袋放入降温箱中降温至‑80℃后转移至液氮中保存。

说明书

一种脐带血冻存液及其冻存方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医学技术领域，具体涉及一种脐带血冻存液及其冻存方法。

背景技术

[0002] 脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液；研究表明，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植；在临床上脐带血已经用于治疗各种类型白血病、再生障碍性贫血、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、粘多糖病、地中海贫血、骨髓发育不良症候群、原发性免疫缺陷病、慢性肉芽肿等80多种疾病。

[0003] 因此，将脐带血进行保存，对于治疗相应的疾病具有重要的价值。目前，脐带血主要是在低温下进行保存；而保存脐带血的冻存液对于复苏后的脐带血中的细胞活率有着重要的影响作用；目前的冻存液有待进一步改进。

发明内容

[0004] 为了克服现有技术存在的至少之一的技术问题，本发明提供了一种脐带血冻存液。

[0005] 本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：

[0006] 一种脐带血冻存液，其包含如下重量份的组分：

[0007] DMSO 40～60份；葡萄糖 3～5份；氯化钠 0.2～0.5份；中药提取物 1～3份；无菌水 40～60份。

[0008] 发明人通过大量的实验研究表明，在上述组成的脐带血冻存液中冻存脐带血；可以使得复苏后的脐带血中的干细胞具有较高的细胞活率。

[0009] 优选地，所述的脐带血冻存液，其包含如下重量份的组分：

[0010] DMSO 50～60份；葡萄糖 3～4份；氯化钠 0.3～0.4份；中药提取物 1～2份；无菌水 40～50份。

[0011] 优选地，所述的中药提取物通过包含如下步骤的方法制备得到：

[0012] 取中药血风藤用有机溶剂进行加热回流提取，提取结束后将提取液进行浓缩干燥即得有机溶剂提取物，即所述的中药提取物。

[0013] 发明人在研究中惊奇的发现：在脐带血冻存液中加入由中药血风藤提取得到的中药提取物后可以大幅提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率。

[0014] 优选地，所述的有机溶剂是由甲醇和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂。

[0015] 优选地，甲醇和乙酸乙酯的体积比为4～6:1。

[0016] 最优选地，甲醇和乙酸乙酯的体积比为5:1。

[0017] 优选地，中药血风藤和有机溶剂的用量比为1g:5～15mL。

[0018] 最优选地，中药血风藤和有机溶剂的用量比为1g:10mL。

[0019] 发明人需要强调的是：有机溶剂的组成对能否提取得到可以大幅提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率的中药提取物起着重要的影响；发明人进一步研究表明：中药血风藤经由甲醇和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂提取得到的中药提取物，其对复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率的提高程度要远远高于采用其他有机溶剂提取得到的中药提取物。

[0020] 进一步还包括硅胶柱层析步骤；所述的硅胶柱层析步骤具体为：

[0021] 将有机溶剂提取物进一步上硅胶柱，先用体积比为95～90:5～10的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱除杂；再用体积比为85～80:15～20的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为85～80:15～20的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。

[0022] 优选地，所述的硅胶柱层析步骤具体为：

[0023] 将有机溶剂提取物进一步上硅胶柱，先用2～4倍柱体积的体积比为95～90:5～10的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱除杂；再用4～6倍柱体积的体积比为85～80:15～20的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为85～80:15～
20的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。

[0024] 优选地，所述的硅胶柱层析步骤具体为：

[0025] 将有机溶剂提取物进一步上硅胶柱，先用3倍柱体积的体积比为93:7的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积比为83:17的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为83:17的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。

[0026] 发明人进一步研究表明，将中药血风藤经有机溶剂提取后进一步在上述硅胶柱洗脱条件下制备得到的中药提取物，其可以进一步提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率。

[0027] 发明人同样需要强调的是：硅胶柱的洗脱条件对能否制备得到进一步大幅提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率的中药提取物起着重要的影响；研究表明，只有在本发明上述硅胶柱洗脱条件下制备得到的中药提取物才能进一步大幅提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率；而在其它硅胶柱洗脱条件下制备得到的中药提取物并不能有效的提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率。

[0028] 本发明还提供一种脐带血的冻存方法，其包含如下步骤：将脐带血装入冻存袋中，然后再加入上述脐带血冻存液；接着在4℃的水浴中进行预冷冻；进一步将冻存袋放入降温箱中降温至‑80℃后转移至液氮中保存。

[0029] 有益效果：本发明提供了一种全新组成的脐带血冻存液，该脐带血冻存液通过加入了由中药血风藤为原料提取得到的中药提取物，其可以有效地提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率。

具体实施方式

[0030] 以下结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

[0031] 实施例1脐带血冻存液的制备

[0032] 脐带血冻存液的原料重量份组成：DMSO 50份；葡萄糖 4份；氯化钠 0.3份；中药提取物 2份；无菌水 50份；

[0033] 所述的中药提取物通过如下方法制备得到：

[0034] 取中药血风藤，加入有机溶剂，在加热至有机溶剂沸腾的条件下进行回流提取1.5h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得所述的中药提取物；其中，中药血风藤和有机溶剂的用量比为1g:10mL；所述的有机溶剂由体积比为5:1的甲醇和乙酸乙酯组成。

[0035] 脐带血冻存液的制备方法：将中药提取物加入到DMSO中溶解得DMSO溶液；将葡萄糖和氯化钠加入到无菌水中溶解得无菌水溶液；再将DMSO溶液和无菌水溶液混合后即得所述的脐带血冻存液。

[0036] 实施例2脐带血冻存液的制备

[0037] 脐带血冻存液的原料重量份组成：DMSO 40份；葡萄糖 5份；氯化钠 0.4份；中药提取物 1份；无菌水 60份；

[0038] 所述的中药提取物通过如下方法制备得到：

[0039] 取中药血风藤，加入有机溶剂，在加热至有机溶剂沸腾的条件下进行回流提取2h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得所述的中药提取物；其中，中药血风藤和有机溶剂的用量比为1g:15mL；所述的有机溶剂由体积比为4:1的甲醇和乙酸乙酯组成。

[0040] 脐带血冻存液的制备方法：将中药提取物加入到DMSO中溶解得DMSO溶液；将葡萄糖和氯化钠加入到无菌水中溶解得无菌水溶液；再将DMSO溶液和无菌水溶液混合后即得所述的脐带血冻存液。

[0041] 实施例3脐带血冻存液的制备

[0042] 脐带血冻存液的原料重量份组成：DMSO 60份；葡萄糖 3份；氯化钠 0.2份；中药提取物 3份；无菌水 40份；

[0043] 所述的中药提取物通过如下方法制备得到：

[0044] 取中药血风藤，加入有机溶剂，在加热至有机溶剂沸腾的条件下进行回流提取1h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得所述的中药提取物；其中，中药血风藤和有机溶剂的用量比为1g:8mL；所述的有机溶剂由体积比为6:1的甲醇和乙酸乙酯组成。

[0045] 脐带血冻存液的制备方法：将中药提取物加入到DMSO中溶解得DMSO溶液；将葡萄糖和氯化钠加入到无菌水中溶解得无菌水溶液；再将DMSO溶液和无菌水溶液混合后即得所述的脐带血冻存液。

[0046] 实施例4脐带血冻存液的制备

[0047] 脐带血冻存液的原料重量份组成：DMSO 50份；葡萄糖 4份；氯化钠 0.3份；中药提取物 2份；无菌水 50份；

[0048] 所述的中药提取物通过如下方法制备得到：

[0049] (1)取中药血风藤，加入有机溶剂，在加热至有机溶剂沸腾的条件下进行回流提取1.5h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得所述的有机溶剂提取物；其中，中药血风藤和有机溶剂的用量比为1g:10mL；所述的有机溶剂由体积比为5:1的甲醇和乙酸乙酯组成；

[0050] (2)将有机溶剂提取物进一步上硅胶柱(装填有200‑300目的硅胶；硅胶的重量是有机溶剂提取物重量的20倍)，先用3倍柱体积的体积比为93:7的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积比为83:17的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为83:17的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。

[0051] 脐带血冻存液的制备方法：将中药提取物加入到DMSO中溶解得DMSO溶液；将葡萄糖和氯化钠加入到无菌水中溶解得无菌水溶液；再将DMSO溶液和无菌水溶液混合后即得所述的脐带血冻存液。

[0052] 对比例1脐带血冻存液的制备

[0053] 脐带血冻存液的原料重量份组成：DMSO 50份；葡萄糖 4份；氯化钠 0.3份；中药提取物 2份；无菌水 50份；

[0054] 所述的中药提取物通过如下方法制备得到：

[0055] 取中药血风藤，加入有机溶剂，在加热至有机溶剂沸腾的条件下进行回流提取1.5h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得所述的中药提取物；其中，中药血风藤和有机溶剂的用量比为1g:10mL；所述的有机溶剂为甲醇。

[0056] 脐带血冻存液的制备方法：将中药提取物加入到DMSO中溶解得DMSO溶液；将葡萄糖和氯化钠加入到无菌水中溶解得无菌水溶液；再将DMSO溶液和无菌水溶液混合后即得所述的脐带血冻存液。

[0057] 对比例1与实施例1的区别在于，中药提取物制备过程中，提取溶剂的选择不同，对比例1仅仅以甲醇为溶剂对中药血风藤进行提取；而实施例1则是采用由甲醇和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行提取。

[0058] 对比例2脐带血冻存液的制备

[0059] 脐带血冻存液的原料重量份组成：DMSO 50份；葡萄糖 4份；氯化钠 0.3份；中药提取物 2份；无菌水 50份；

[0060] 所述的中药提取物通过如下方法制备得到：

[0061] 取中药血风藤，加入有机溶剂，在加热至有机溶剂沸腾的条件下进行回流提取1.5h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得所述的中药提取物；其中，中药血风藤和有机溶剂的用量比为1g:10mL；所述的有机溶剂为体积分数为70％的乙醇水溶液。

[0062] 脐带血冻存液的制备方法：将中药提取物加入到DMSO中溶解得DMSO溶液；将葡萄糖和氯化钠加入到无菌水中溶解得无菌水溶液；再将DMSO溶液和无菌水溶液混合后即得所述的脐带血冻存液。

[0063] 对比例2与实施例1的区别在于，中药提取物制备过程中，提取溶剂的选择不同，对比例2仅仅以体积分数为70％的乙醇水溶液为溶剂对中药血风藤进行提取；而实施例1则是采用由甲醇和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行提取。

[0064] 对比例3脐带血冻存液的制备

[0065] 脐带血冻存液的原料重量份组成：DMSO 50份；葡萄糖 4份；氯化钠 0.3份；中药提取物 2份；无菌水 50份；

[0066] 所述的中药提取物通过如下方法制备得到：

[0067] (1)取中药血风藤，加入有机溶剂，在加热至有机溶剂沸腾的条件下进行回流提取1.5h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得所述的有机溶剂提取物；其中，中药血风藤和有机溶剂的用量比为1g:10mL；所述的有机溶剂由体积比为5:1的甲醇和乙酸乙酯组成；

[0068] (2)将有机溶剂提取物进一步上硅胶柱(装填有200‑300目的硅胶；硅胶的重量是有机溶剂提取物重量的20倍)，先用3倍柱体积的体积比为99:1的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积比为90:10的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为90:10的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。

[0069] 脐带血冻存液的制备方法：将中药提取物加入到DMSO中溶解得DMSO溶液；将葡萄糖和氯化钠加入到无菌水中溶解得无菌水溶液；再将DMSO溶液和无菌水溶液混合后即得所述的脐带血冻存液。

[0070] 对比例3与实施例4的区别在于，硅胶柱的洗脱条件不同，对比例3的硅胶柱洗脱条件为：先用体积比为99:1的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱除杂；再用体积比为90:10的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；而实施例4则是先用体积比为93:7的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱除杂；再用体积比为83:17的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱。

[0071] 对比例4脐带血冻存液的制备

[0072] 脐带血冻存液的原料重量份组成：DMSO 50份；葡萄糖 4份；氯化钠 0.3份；中药提取物 2份；无菌水 50份；

[0073] 所述的中药提取物通过如下方法制备得到：

[0074] (1)取中药血风藤，加入有机溶剂，在加热至有机溶剂沸腾的条件下进行回流提取1.5h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得所述的有机溶剂提取物；其中，中药血风藤和有机溶剂的用量比为1g:10mL；所述的有机溶剂由体积比为5:1的甲醇和乙酸乙酯组成；

[0075] (2)将有机溶剂提取物进一步上硅胶柱(装填有200‑300目的硅胶；硅胶的重量是有机溶剂提取物重量的20倍)，先用3倍柱体积的体积比为80:20的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积比为70:30的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱，收集体积比为70:30的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。

[0076] 脐带血冻存液的制备方法：将中药提取物加入到DMSO中溶解得DMSO溶液；将葡萄糖和氯化钠加入到无菌水中溶解得无菌水溶液；再将DMSO溶液和无菌水溶液混合后即得所述的脐带血冻存液。

[0077] 对比例4与实施例4的区别在于，硅胶柱的洗脱条件不同，对比例4的硅胶柱洗脱条件为：先用体积比为80:20的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱除杂；再用体积比为70:30的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；而实施例4则是先用体积比为93:7的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱除杂；再用体积比为83:17的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱。

[0078] 对比例5脐带血冻存液的制备

[0079] 脐带血冻存液的原料重量份组成：DMSO 50份；葡萄糖 4份；氯化钠 0.3份；无菌水 50份；

[0080] 脐带血冻存液的制备方法：将葡萄糖和氯化钠加入到无菌水中溶解得无菌水溶液；再将DMSO和无菌水溶液混合后即得所述的脐带血冻存液。

[0081] 对比例5与实施例1的区别在于，对比例5中的脐带血冻存液不加入中药提取物。

[0082] 实验例

[0083] 取同一脐带血分成9份；分别装入9个冻存袋中，然后分别加入5倍脐带血体积的实施例1～4以及对比例1～5制备得到的脐带血冻存液；接着在4℃的水浴中进行预冷冻；进一步将冻存袋转入降温箱中降温至‑80℃后转移至液氮中保存。

[0084] 采用上述方法冷冻保存3个月后，将装有脐带血的冻存袋取出，放入37℃水浴中进行解冻复苏；接着测试复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率；测试结果见表1。

[0085] 表1.复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率

[0086]  细胞活率
实施例1脐带血冻存液 88.75％
实施例2脐带血冻存液 82.16％
实施例3脐带血冻存液 85.39％
实施例4脐带血冻存液 96.18％
对比例1脐带血冻存液 70.12％
对比例2脐带血冻存液 68.96％
对比例3脐带血冻存液 90.16％
对比例4脐带血冻存液 84.22％
对比例5脐带血冻存液 62.78％

[0087] 从表1细胞活率检测结果可以看出，采用实施例1～4制备得到的脐带血冻存液冻存脐带血，保存3个月复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率均大于80％；远远高于保存在对比例1不加入中药提取物的脐带血冻存液冻中的细胞活率。这说明：在脐带血冻存液中加入由中药血风藤制备得到的中药提取物，其可以大幅提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率。

[0088] 从表1细胞活率检测结果还可以看出，采用实施例4制备得到的脐带血冻存液冻存脐带血，保存3个月复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率达到96.18％；与冻存在实施例1制备得到的脐带血冻存液中相比，有着进一步地提高；这说明：中药提取物进一步经本发明所述的上述硅胶柱层析方法处理，可以进一步富集大量的有效成分，其加入到冻存液中可以进一步提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率。

[0089] 从表1细胞活率检测结果还可以看出，采用对比例1和2制备得到的脐带血冻存液冻存脐带血，保存3个月复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率与对比例1相比虽有提升，但是幅度不大；这说明：有机溶剂的组成对能否提取得到可以大幅提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率的中药提取物起着重要的影响；只有采用由甲醇和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂提取得到的中药提取物才能大幅提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率；采用其他有机溶剂提取得到的中药提取物并不能大幅提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率。

[0090] 从表1细胞活率检测结果还可以看出，采用对比例3制备得到的脐带血冻存液冻存脐带血，保存3个月复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率与实施例1相比虽有提升，同样提升幅度不大；采用对比例4制备得到的脐带血冻存液冻存脐带血，保存3个月复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率与实施例1相比，还出现了下降的状况；这说明：硅胶柱的洗脱条件对能否制备得到进一步大幅提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率的中药提取物起着重要的影响；只有在本发明上述硅胶柱洗脱条件下(即，先用体积比为95～90:5～10的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱除杂；再用体积比为85～80:15～20的环己烷和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱)制备得到的中药提取物才能进一步大幅提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率；而在其它硅胶柱洗脱条件下制备得到的中药提取物并不能有效的提高复苏后的脐带血中的干细胞的细胞活率。