一种治疗肺纤维化疾病的中药组合物及其应用

摘要

本发明涉及一种治疗肺纤维化疾病的中药组合物，所述中药组合物由以下重量份的原料药制成：生地28‑31份、积雪草29‑32份、仙茅12份、仙灵脾12份、桃仁15份、丹参9份、黄芩9份、川断15份、生甘草6份。本发明还提供了中药组合物的应用。本发明以肺痹核心病机“热毒瘀阻肺络”为纲，用药紧凑，配伍精当，扶正祛邪，固本清源。本发明应用于临床可延缓患者肺功能下降。在FVC下降率方面：中西医联合组总有效率为51.52％，高于单用西药(吡非尼酮)的对照组总有效率36.36％(P＜0.05)；动物实验证实本发明可降低博来霉素造膜大鼠肺系数、肺病理切片纤维化情况及大鼠KL‑6、IL‑6、IL‑21、TGF‑β1水平。证明本发明对肺纤维化有一定程度改善作用。

权利要求

1.一种治疗肺纤维化疾病的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由以下重量份的原料药制成：生地28‑31份、积雪草29‑32份、仙茅12份、仙灵脾12份、桃仁15份、丹参9份、黄芩9份、川断15份、生甘草6份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由以下重量份的原料药制成：生地30份、积雪草30份、仙茅12份、仙灵脾12份、桃仁15份、丹参9份、黄芩9份、川断15份、生甘草6份。

3.根据权利要求1或2任一所述的中药组合物在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，所述的肺纤维化疾病是类风湿关节炎相关肺纤维化。

说明书

一种治疗肺纤维化疾病的中药组合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及中药技术领域，具体地说，是关于一种治疗肺纤维化疾病的中药组合物及其应用。

背景技术

[0002] 肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是不同病因导致的一组异质性疾病，主要表现为进行性气短，限制性通气功能障碍、弥散功能减退以及低氧血症，最终导致患者呼吸衰竭甚至死亡，预后较差。不同病因导致的PF临床表现、影像学表现、肺功能及病理具有很多相似及重叠之处。大部分结缔组织病(connective tissue disease，CTD)，比如类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)都可能发生PF，发病率和严重程度不尽相同。肺纤维化往往呈慢性、进行性进展，最终导致肺脏功能丧失，死亡率高，造成社会医疗资源的巨大开支，并对患者及其家庭带来巨大的负担。因此积极寻求抗肺纤维化的药物，具有深远的社会意义。

[0003] 目前西医对于肺纤维化的治疗，主要选择吡非尼酮、尼达尼布等药物，虽在一定程度上延缓了肺纤维化的进程，但起效不尽如人意，且长期服用上述药物容易产生肝、肾毒性，严重制约了其在临床中的应用。其高昂的价格更另许多患者望而却步。

[0004] 中医认为，肺纤维化属于“肺痹”范畴，“肺痹”二字滥觞于《内经》：“……弗治，患者舍于肺，名曰肺痹，发咳上气。”；《素问·五脏生成》：“喘而浮，上虚下实……喘而虚，名曰肺痹。”；《素问·痹论》中曰：“肺痹者，烦满喘而呕”，均强调了肺痹“喘”的特征；历代医家对“肺痹”这一概念进行了完善及补充，但基本不出《内经》所述，定义“肺痹”为五脏痹之一。肺痹之病机复杂，中医学认为火热炽盛者多化毒，病情重笃、病势缠绵顽固、病因不清难以治者常蕴毒，肺纤维化病情复杂、病势缠绵、病因多端，究其原因，总与“热”“毒”有关。毒损肺络，正气耗伤，血行不畅，变生瘀血，搏结于肺，则见咳喘。总之，肺痹之病机复杂，总属瘀、毒痹阻肺络，其病位深，病情重，治疗应以“清解肺毒，化瘀通络”为主。

[0005] 中国专利文献CN103933360A公开了一种治疗肺纤维化的中药组合物，其特征在于它是由下列重量的原料药物的制成：黄芩3～9g、七叶一支花3～5g、桑叶6～8g、山慈菇6～9g、梅花3～5g、北沙参4～6g、枫香脂1.5～3g、葶苈子6～9g、满山红10～15g、穿心莲6～9g、天仙藤3～5g、余甘子6～8g、地龙3～5g、仙鹤草3～5g、毛诃子6～9g。

[0006] 而目前关于生地、积雪草、仙茅、仙灵脾等治疗肺纤维化疾病的中药组合物还未见报道。

发明内容

[0007] 本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种治疗肺纤维化疾病的中药组合物。

[0008] 本发明的第二个目的是，中药组合物的用途。

[0009] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种治疗肺纤维化疾病的中药组合物，所述中药组合物由以下重量份的原料药制成：生地28‑31份、积雪草29‑32份、仙茅12份、仙灵脾12份、桃仁15份、丹参9份、黄芩9份、川断15份、生甘草6份。

[0010] 作为一个优选例，所述中药组合物由以下重量份的原料药制成：生地30份、积雪草30份、仙茅12份、仙灵脾12份、桃仁15份、丹参9份、黄芩9份、川断15份、生甘草6份。

[0011] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：中药组合物在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用。

[0012] 作为一个优选例，类风湿关节炎可继发肺纤维化。

[0013] 本发明在临床中证实对延缓类风湿关节炎相关肺纤维化进展具有疗效，在常规西药治疗基础之上服“实施例1”7月后，同一患者胸部HRCT同一层面比较，可见磨玻璃样影较用药前减少，纤维化表现减轻。本发明课题组建立博莱霉素诱导肺纤维化大鼠模型，发现实施例1能有效降低其肺系数、血清KL‑6、IL‑6、IL‑21含量及肺组织KL‑6、TGF‑β1、IL‑6含量。且高剂量组较低剂量组疗效更佳，无严重不良反应。

[0014] 本发明课题组临床应用本方治疗肺纤维化。肺纤维化属于“肺痹”范畴，清·高学山《高注金匮要略·血痹虚劳病脉证治》曰:“痹者，卑也，着也，正气卑弱，而血液有沉着之象，故曰痹”。根据本发明课题组多年临床经验总结，肺痹之病机复杂，总属痰、瘀、毒痹阻肺络。病性为本虚标实，虚实夹杂。病位在肺，与脾肾密切相关。《内经》云，“诸逆冲上，皆属于火”，“夫毒者，皆五行标盛暴烈之气所为也”，火热有余，潜伏至深，积聚成毒，即“邪极生毒”。痹阻经络，血滞脉中，瘀血从生。热瘀搏结，热胜成毒，终致毒、瘀互结为患。王清任云：“周身之气通而不滞，血活而不瘀，气通血活，何患不除”。故国医大师颜德馨以“气为百病之长，血为百病之胎”为纲，倡立“久病必有瘀，怪病必有瘀”的理论，主张“衡法”，意在“调气和血，燮理阴阳”，通过调理气血平衡，达到治疗肺痹的目的。

[0015] 本发明优点在于：依托于临床治疗经验，结合脏腑与气血理论，运用国医大师颜老“衡法”治疗肺痹，以调理气血为本，重视补益肺肾，标本兼顾，清肺化瘀通络祛痰解毒贯穿始终。

[0016] 方中生地甘寒入肾，滋阴壮水，清热凉血，积雪草苦、辛、寒，既能清肺热解痹毒，又能活血散瘀，与生地同为君药。臣以仙茅、仙灵脾温补肾阳，意在金水相生，兼祛风湿以解痹毒，共助生地滋水固金；桃仁活血祛瘀、止咳平喘，丹参活血散瘀、清热凉血，共协积雪草清泄瘀热；佐以川断，通行血脉，补益肝肾，更为防二仙温补太过，配以苦寒之黄芩；甘草为使，调和诸药，生用又能清热解毒，祛痰止咳，诸药合用，滋而不腻，清而不寒，活血而不伤正，邪正并治，共奏清肺化瘀之奇效。全方用药紧凑，配伍精当，扶正祛邪，固本清源。本发明通过观察各组肺纤维化大鼠一般情况、大鼠肺系数及KL‑6、IL‑6、IL‑21、TGF‑β1含量变化，结果显示造模是成功的，给予本发明后，模型大鼠肺系数、肺病理均有不同程度改善，且KL‑6、IL6、IL‑21、TGF‑β1等含量均有不同程度降低。，证明本发明对肺纤维化有一定程度改善作用。

附图说明

[0017] 图1服“实施例1”后同一患者胸部HRCT同一层面比较。

[0018] 图2各组肺组织大体形态A：假手术组B：造模组C：中药高剂量组D：中药低剂量组[0019] 图3各组大鼠肺组织TGF‑β1的影响

[0020] 图4各组大鼠肺组织病理情况(HE染色，×200)*肺泡间隔炎性细胞浸润↑血管[0021] 图5各组大鼠肺组织KL‑6、TGF‑β1、IL‑6蛋白表达。注：与模型组比较，*P＜0.05。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0023] 实施例1

[0024] 按重量份配比称取各原料药：生地30份、积雪草30份、仙茅12份、仙灵脾12份、桃仁15份、丹参9份、黄芩9份、川断15份、生甘草6份。

[0025] 实施例2

[0026] 按重量份配比称取各原料药：生地28份、积雪草31份、仙茅12份、仙灵脾12份、桃仁15份、丹参9份、黄芩9份、川断15份、生甘草6份。

[0027] 实施例3

[0028] 按重量份配比称取各原料药：生地29份、积雪草32份、仙茅12份、仙灵脾12份、桃仁15份、丹参9份、黄芩9份、川断15份、生甘草6份。

[0029] 实施例4

[0030] 按重量份配比称取各原料药：生地30份、积雪草28份、仙茅12份、仙灵脾12份、桃仁15份、丹参9份、黄芩9份、川断15份、生甘草6份。

[0031] 实施例5

[0032] 按重量份配比称取各原料药：生地31份、积雪草30份、仙茅12份、仙灵脾12份、桃仁15份、丹参9份、黄芩9份、川断15份、生甘草6份。

[0033] 实施例6(对照组1)

[0034] 按重量份配比称取各原料药：生地33份、积雪草30份、仙茅12份、仙灵脾14份、桃仁15份、丹参9份、黄芩9份、川断15份、生甘草6份。

[0035] 实施例7(对照组2)

[0036] 按重量份配比称取各原料药：生地30份、积雪草35份、仙茅12份、仙灵脾12份、桃仁18份、丹参9份、黄芩9份、川断16份、生甘草6份。

[0037] 实施例8临床疗效实验

[0038] 运用本发明治疗类风湿关节炎相关肺纤维化患者10余年，临床疗效肯定。

[0039] 观察病例：赵某某，女性，60岁，2020年12月诊断为类风湿关节炎相关肺间质病变。2021年3月起在常规治疗基础上服用实施例1(实施例1)。至2021年10月，服“实施例1”7月后，同一患者胸部HRCT同一层面上磨玻璃样影较用药前减少，纤维化表现明显减少。

[0040] 通过临床随机对照试验，验证“实施例1”临床疗效：

[0041] 本研究已获得临床试验伦理委员会批准，并于中国临床试验注册中心完成注册。

[0042] 1资料与方法

[0043] 1.1病例选择

[0044] 1.1.1诊断标准 ①RA诊断标准 参照2009年美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)、欧洲抗风湿病联盟(The European League Against Rheumatism，EULAR)制定的RA分类诊断标准 ②RA‑ILD诊断标准美国胸科协会/欧洲呼吸协会(American ThoracicSociety,ATS/European Respiratory Society,ERS)共同指出，其发布的特发性肺间质病变临床诊断标准同样适用于结缔组织病并发肺间质病变的诊断，即在已经确诊RA的基础上，同时符合2000年ATS/ERS提出的特发性肺间质病变临床诊断标准，可诊断为RA‑ILD。③中医诊断及辨证标准结合中医临床诊疗经验，参考《中华人民共和国中医药行业标准——中医病证诊断疗效标准》(ZY/T0OI.1‑94)，本病属尪痹(内舍于肺)，证属肺热血瘀，症见：关节疼痛，气短无力，干咳无痰或少痰，口干咽燥,舌暗少津苔少,或苔薄白,脉细数。

[0045] 1.1.2纳入标准 ①符合诊断标准及中医辨证标准 ②年龄18至80岁 ③知情同意 ④RA病情稳定，定义为：入组前6周内未开始新的或更换RA治疗方案，并被风湿免疫科专科医生判断为RA达标 ⑤肺纤维化进展，定义为：排除可归因于合并症(如感染、心力衰竭)的变化前提下，入组前24个月满足以下标准中至少一项：ⅰ.FVC预计值出现具有临床意义的下降，即相对下降≥10％；ⅱ.FVC预计值出现临界下降，即相对下降≥5且＜10％，同时合并有呼吸道症状恶化；ⅲ.FVC预计值出现临界下降，即相对下降≥5且＜10％，同时合并有胸部影像学检查纤维化改变范围增大；ⅳ.呼吸系统症状恶化以及胸部影像纤维化变化范围增大 ⑥近期未曾用过抗纤维化治疗或曾用过已经洗脱过的患者。⑦合并用药：入组前曾服用甲氨蝶呤、来氟米特者，须稳定服用3个月以上，或停药1个月以上方可纳入；曾使用过激素或生物制剂者，需停药3个月以上方可纳入

[0046] 1.1.3排除标准 ①按照日本呼吸病学会制定的IPF疾病严重度分期标准，属于Ⅳ期者；或治疗前已因病情无法完成肺功能试验者 ②其他原因导致的肺间质纤维化者以及特发性肺间质纤维化者；或合并肺部感染、肺癌、肺结核者 ③以下任何标准定义的显著肺动脉高压：ⅰ.既往显著的右心衰竭的临床或超声心动图证据；ⅱ.病史包括右心导管显示心2
脏指数≤2L/min/m ；ⅲ.需要依前列醇/曲前列尼尔肠外治疗 ④妊娠或哺乳期妇女 ⑤对所用药物成分过敏者 ⑥合并心血管、肝、肾、造血系统等严重疾病者 ⑦患有精神方面疾患者 ⑧近期正在参加其他临床试验者

[0047] 1.1.4脱落标准 ①自行退出者 ②疗程未结束失访者 ③资料不全，影响疗效和安全性判断者 ④发生某些合并症、并发症或特殊生理变化，不适宜继续接受试验者 ⑤治疗期间，出现结核感染、败血症、脱髓鞘病变、病毒性肝炎者。

[0048] 1.1.5剔除标准 ①未曾使用试验药物 ②违背合并用药的规定，使用影响疗效和安全性判断的药物 ③在入组之后没有任何数据

[0049] 1.2一般资料 全部病例来自2020年6月至2021年12月上海中医药大学附属曙光医院风湿免疫科门诊及住院患者，共收入66例，其中男性25例，女性41例；最小年龄35岁，最大年龄78岁，平均(65.64±8.80)岁；平均病程(123.19±117.802)月。根据临床试验随机化方案，采用SPSS25.0软件随机数字表产生随机分组信封，按一定顺序依次纳入受试者，根据信封内数字，受试者随机进入中药组和对照组。因类风湿关节炎的发病率女性高于男性，故本次入组患者中女性人数占比较大。经统计，两组患者性别、年龄、病程均无统计学差异(P均>0.05)，具有可比性，见表1。

[0050] 表1一般资料

[0051]

[0052] 1.3干预方法根据《2018中国结缔组织病相关间质性肺病诊断和治疗专家共识》，目前对于RA缓解而ILD进展的患者，可维持免疫抑制治疗，增加抗纤维化治疗，抗纤维化药物主要为吡非尼酮、尼达尼布等。①对照组：RA缓解期治疗方案+吡非尼酮(200mg‑400mg tid po，根据患者耐受情况由200mg逐步增加用量)；②治疗组：在对照组的基础上加用“实施例1”

[0053] 1.4观察项目与方法

[0054] 1.4.1疗效指标 ①主要疗效观察指标 肺功能 参考国际通用临床终点指标，本研究主要疗效指标为用力肺活量变化率(ΔFVC)，治疗前后分别测定患者FVC，并计算治疗前后FVC变化率：ΔFVC＝(治疗后FVC‑治疗前FVC)/治疗前FVC×100％ ②肺HRCT半定量积分 参照《临床CT诊断学》,肺HRCT扫描图像由放射科医师与临床医师两人分别对影像进行诊断，评分对象定义为磨玻璃样影或实变影、网织状影(包括小叶间隔增厚，小叶内间质增厚，支气管血管束增粗，胸膜下线)、蜂窝肺、支气管扩张，并根据评分对象在扫描层面(肺尖、肺门、主动脉弓、隆突、右下肺静脉以及右膈顶上1cm共计6个层面)上所占的面积比例进行半定量记分，总分为24分：若扫描层面上无明显征象显示为0分；所示征象占层面比例＜25％则为1分；25％～50％为2分；50％～75％为3分；＞75％为4分。两位医生讨论后给出的一致意见为阅片最后结果，治疗前后分别测定肺HRCT半定量积分。③中医证候积分参照《中药新药临床研究指导原则(2002)》，并参考信度效度较好的中医证候积分量表，评价患者咳嗽、咳痰、气短、喘息、胸闷、咽干、紫绀等证候，按无、轻、中、重4个级别，分别计0、1、2、3分，舌象和脉象只记录不计分。治疗前后分别测定中医证候积分。

[0055] 1.4.2总体疗效判定标准 临床总体疗效判断根据相关专家共识与指南根据治疗后FVC变化率评判总体疗效，显效：FVC变化率＞‑5％；有效：FVC变化率≤‑5％且＞‑10％；无效：FVC变化率≤‑10％，或因病情原因无法再次完成肺功能试验。证候疗效判定标准参照《中药新药临床研究指导原则(2002)》，按尼莫地平法计算。显效：证候积分减少≥70％；能正常参加工作和劳动；有效：证候积分减少≥30％；无效：证候积分减少不足30％。总有效率＝(显效例数+有效例数)/总例数×100％。

[0056] 1.4.3不良反应评价 试验期间监测患者的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血肌酐(SCR)、以评价有无肝肾功能损伤；观察服药后患者新有无新出现的消化道症状及过敏反应，并与病证症状相区别，应随时观测记录。

[0057] 1.5统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件分析。计量资料若符合正态分布采用均数±标准差(x±s)描述，不符合正态分布采用中位数(四分位间距)[P50(P25，P75)]描述。试验前后测量数据组间差异性比较，若数据符合正态分布且方差齐，采用两独立样本t检验，若方差不齐，采用两独立样本t'检验；若数据不符合正态分布，则采用Mann‑Whitney U秩和检验。重复测量数据(等时间间距)采用重复测量数据资料的方差分析。计数资料采用例数(百分比)[n(％)]进行描述，组间差异性比较运用卡方检验或fisher's检验，采用Bonferroni法校正检验水准。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

[0058] 2结果

[0059] 2.1总体疗效及中医证候疗效比较 治疗后比较两组在ΔFVC的总体疗效，中药组总有效率为51.52％，对照组总有效率36.36％，差异有统计学意义(X2＝8.618，P＝0.004＜0.05)，见表2。治疗后比较两组中医症候疗效，中药组有效率为33.33％，对照组有效率
69.70％，差异有统计学意义(X2＝8.738，P＝0.013＜0.05)，见表3。

[0060] 表2总体疗效比较(例)

[0061]

[0062] *与对照组比较P＜0.05

[0063] 表3中医证候疗效比较(例)

[0064]

[0065] *与对照组比较P＜0.05

[0066] 2.2FVC变化情况 治疗前，两组患者的FVC差异无统计学意义(P＝0.448＞0.05)。治疗后，组内比较，对照组和中药组FVC均较治疗前降低，差异有统计学意义(P＝＜0.001；P＝0.025＜0.05)；组间比较，中药组FVC较对照组高，差异有统计学意义(P＝0.011＜0.05)。
说明相较于对照组，中药组患者FVC下降程度减轻，见表4。

[0067] 2.3肺HRCT半定量积分变化情况 治疗前，两组患者的肺HRCT半定量积分差异无统计学意义(P＝0.977＞0.05)。治疗后，组内比较，对照组和中药组肺HRCT积分与治疗前差异均无统计学意义(P＝0.156＞0.05；P＝0.153＞0.05)，说明在半年疗程内两组肺HRCT半定量积分均无明显变化。见表4。

[0068] 表4治疗前后两组FVC及肺HRCT半定量积分比较( n＝33)

[0069]

[0070] *与本组治疗前比较P＜0.05；▲与对照组治疗后比较P＜0.05；#与本组治疗前比较P＞0.05；

[0071] 2.4中医证候积分变化情况 治疗前，比较两组中医证候积分，差异无统计学意义(P＝0.26＞0.05)。治疗后，组内比较，对照组和中药组中医证候积分均较治疗前降低(P＜0.001；P＜0.001)；组间比较，中药组中医证侯积分较对照组低，差异有统计学意义(P＝
0.04＜0.05)。说明两组都能改善患者中医证候，且中药组改善中医证候效果优于对照组。

[0072] 表5各组中医证侯积分变换情况比较( 分)

[0073]

[0074] *与本组治疗前比较P＜0.001；▲与对照组治疗后比较P＜0.05；

[0075] 2.5不良反应评价  治疗前两组均无肝损伤患者(ALT＞ULN，upper  limit ofnormal)，ALT差异均无统计意义(P＞0.05)。治疗后对照组出现肝损伤患者3例，中药组出现肝损伤患者1例。在治疗过程中，中药组患者未出现明显不适，对照组有3例出现轻微腹胀、腹泻等胃肠道症状。两组患者治疗前后均未出现肾功能损伤患者。中药组的总不良反应发生率较对照组低(P＜0.05)。

[0076] 实施例9动物实验(一)

[0077] 本发明可缓解博来霉素造模致大鼠肺纤维化进程

[0078] 1材料与方法

[0079] 1.1材料

[0080] 1.1.1动物 SPF级雄性SD大鼠40只，体质量(200±20)g，购于常州卡文斯实验动物有限责任公司。动物生产许可证号码：SCXK(苏)2016‑0010。饲养于上海大学转化医学研究院动物实验中心，实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2014‑0016。饲养条件为室温20～25℃，湿度40％～70％，标准饲料，动物自由饮食和饮水。SD大鼠在无病原体的SPF级动物房内适养1周。

[0081] 1.1.2药物与试剂 本发明实施例1按水提法提取、浓缩至能灌胃给药的最大浓度(以能用灌胃针头注射为标准)，相当于每毫升含生药1.42g(据“人和动物按体表面积折算的等效剂量比值表”折算，以临床剂量换算大鼠给药剂量，实施例1组给药剂量为14.19g/kg体质量)。

[0082] 甲强龙粉剂(注射用甲泼尼松龙琥珀酸钠，40mg/支)，法玛西亚·普强公司卡拉玛祖分厂(批号：160JTB)；注射用盐酸博莱霉素(Bleomycin，15mg/支)，日本化药株式会社(批号：J162310)；盐酸氯胺酮注射液(50mg/mL)，上海中西药业股份有限公司新冈制药厂(批号：160408)；地西泮注射液(5mg/mL)，上海旭东海普药业有限公司(批号：160501)；涎液化糖链抗原(krebs vonden lungen‑6，KL‑6)、白介素6(interleukin‑6，IL‑6)、白介素21(interleukin‑21，IL‑21)、转化生长因子‑β1(transforming growth factor‑β1，TGF‑β1)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)

[0083] 1.1.3仪器 切片机，德国Leica公司(型号：RM2145)；超净工作台，新加坡ESCO公司(型号：SVE‑6A1)；医用高速低温离心机(Du Pont T21型，美国杜邦公司)；用脱色摇床，上海市新波无线电厂(型号：TY‑B)；Bio‑Rad电泳仪，上海医用分析仪器厂(型号：DY‑1)；杂交炉，上海色谱仪器有限公司(型号：Robbin Scientific 1000)；凝胶成像系统(型号：Gel‑Doc EQ)，美国BioRad公司；荧光倒置显微镜，日本OLMYPUS公司(型号：CKX41/U‑RFLT50)。

[0084] 1.2分组与造模 按随机数字表法将SD大鼠随机分为4组，即假手术组、模型组、实施例1高剂量组(高剂量组)、实施例1低剂量组(低剂量组)，每组10只。

[0085] 采用博莱霉素气管内注入法复制大鼠肺纤维化模型：予地西泮(20mg/kg体质量)腹腔注射，再予盐酸氯氨酮(20mg/kg体质量)腹腔注射麻醉。待麻醉后将大鼠仰卧固定，消毒后在颈部沿正中线切开皮肤，逐层钝性分离软组织，暴露气管。经气管软骨将已抽取博莱霉素0.9％NaCl溶液(8mg/kg体质量)的连有塑料导管的1mL注射器，插入气管，慢慢注入0.3mL药液，随即将大鼠直立旋转，辅助大鼠作直立、旋转等动作，以便药物在肺内均与分布。缝合切口，局部皮肤作抗感染处理。待动物自然清醒后置笼子饲养，以第7天大鼠出现毛无光泽、竖毛、反应迟钝、体温下降、体质量增长缓慢或下降、蜷缩等现象认定模型制作成功。假手术组动物造模方法同上，但仅用生理盐水替换博莱霉素进行气管内注入。

[0086] 1.3干预 给药方法据“人和动物按体表面积折算的等效剂量比值表”折算，以临床剂量换算大鼠用药剂量。实施例1组给药剂量为14.19g/kg体质量，配置成浓度为1.42g/mL。实施例1组每日予各自浓度实施例1高剂量按10mL/kg体质量灌胃，低剂量按5mL/kg体质量灌胃，假手术组和模型组每日予0.9％NaCl溶液按10mL/kg体质量灌胃。每日1次，共4周。上述各组均造模后第1天开始干预，直至实验结束。

[0087] 1.4检测指标与方法

[0088] 1.4.1一般情况及肺组织大体观察 4周药物干预结束后，大鼠称体质量，观察其毛发、精神状态及饮食饮水情况。予10％水合氯醛(3mL/kg)腹腔注射麻醉，大鼠仰卧固定，打开腹腔，延长切口打开胸腔，于近甲状软骨处切断气管，将心肺完整取出。先将心脏和胸腺摘除干净取出完整肺脏组织，观察肺组织大体形态，弹性，有无瘀血等。

[0089] 1.4.2肺系数 用0.9％NaCl溶液将取出的肺脏冲洗干净，滤纸吸干，微量天平称重。肺系数＝肺湿重(g)/大鼠处死时体质量(g)

[0090] 1.4.3血清KL‑6、IL‑6、IL‑21含量 从大鼠腹主动脉采血，注入离心管中，4℃离心20min(3000r/min)，吸出血清于无热源试管中封口。将所取大鼠血清，ELISA法检测大鼠血清KL‑6、IL‑6、IL‑21含量，操作步骤依照试剂盒说明书。

[0091] 1.4.4肺组织TGF‑β1含量 在微量天平上剪取上述肺脏组织样品约3mg，在清洁的生物组织碾钵中先加入0.9％NaCl溶液1mL，放入肺脏组织样品，反复加液氮，在液氮中迅速碾磨至组织完全粉碎，用移液器将碾钵中组织匀浆液移至清洁试管中，用0.9％NaCl溶液1mL冲洗碾钵共2次，将冲洗液移至清洁试管中，低温离心2000r/min共10min，用移液器将上清液吸出移至清洁尖底管中，取0.5g样品于玻璃管，加入0.5mL组织提取液，置于110℃烘箱，水解6～12h，16000r/min，25℃，离心20min，用提取液定容至5mL，取上清，ELISA法检测肺组织TGF‑β1含量。

[0092] 1.4.5肺组织HE染色 肺脏右叶切取部分肺组织，甲醛固定，石蜡包埋，4μm切片，进行常规HE染色：石蜡切片二甲苯脱蜡2次，12min/次，乙醇梯度(100％、95％、80％、70％)入水，苏木精染色6min，自来水蓝化10min，视核染深浅进行盐酸乙醇分化，伊红染色3min，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。镜检观察肺脏组织炎症及胶原纤维增生程度。

[0093] 1.4.6肺组织KL‑6、IL‑6、IL‑12蛋白表达 采用Western Blot法检测肺组织KL‑6、IL‑6、IL‑12蛋白表达。将制备好的SDS‑PAGE胶胶板扣上电泳槽，加入1×Running Buffer，拔掉梳子，加入蛋白Marker和样品，80V，30min；120V，70min电泳。将转膜槽置于冰水混合物中300mA，1h进行转膜。用5％脱脂牛奶封闭后，加入含有目的抗体的抗体稀释液，4℃过夜孵育。次日用TBST在高低摇床上洗膜3遍，每次5min；再加入含有二抗的抗体稀释液，室温孵育1～2h；最后按照1︰1的比例配置ECL显色液的A、B液，并用锡箔纸包裏避光。将膜放置于检测板上，小心吸除残余TBST，加入200μL左右的显色液，铺匀后扫膜。隔天室温二抗孵育2h，随后用凝胶成像仪进行发光拍照，并用Image J分析条带灰度值。

[0094] 1.5统计学方法 采用SPSS 26.0软件对数据进行处理。计量资料以x±s表示，若资料符合正态分布且满足方差齐性，则多组间比较采用单因素方差分析，两两之间的比较用LSD‑t检验，各给药组与空白组比较用Dunnett‑t检验。若资料呈偏态分布或不满足方差齐性，则采用秩转换的非参数检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义

[0095] 2.1对大鼠一般情况及肺组织大体形态的观察 与假手术组相比，模型组中大鼠的毛发无光泽、反应迟钝、体温下降、体质量增长缓慢或下降。与模型组相比，实施例1高、低剂量组大鼠的毛发光泽、反应更灵敏、体温和体质量恢复。假手术组大鼠肺组织呈淡红色，未见出血点、瘀点、瘀斑；模型组大鼠肺组织苍白，大体形态可见散状出血点、黑色瘀斑和表面结节样改变；高、低剂量组大鼠两侧肺组织表面变白，可见少量点状出血灶及少量瘀斑，右肺中、后叶明显，出血点较模型组减少。见图2。

[0096] 2.2对大鼠肺系数的影响与假手术组相比，模型组大鼠的肺质量增加、体质量减轻且肺系数升高，差异有统计学意义(所有P＜0.01)。与模型组比较，实施例1高、低剂量组体质量增加、肺质量和肺系数降低，差异有统计学意义(所有P＜0.01)。实施例1高、低剂量组间比较，大鼠肺系数差异无统计学意义(P＞0.05)。见表6。

[0097] 表6各组大鼠的肺质量、体质量及肺系数比较(n＝10， )

[0098]

[0099]

[0100] 注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

[0101] 2.3对大鼠血清KL‑6、IL‑6、IL‑21含量的影响 与假手术组比较，模型组大鼠的血清KL‑6、IL‑6、IL‑21含量均升高，差异均有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，实施例1高、低剂量组KL‑6、IL‑6、IL‑21含量均有不同程度降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。实施例1高剂量组与低剂量组相比，KL‑6降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表7。

[0102] 表7各组大鼠血清KL‑6、IL‑6、IL‑21的比较(n＝10， )

[0103]

[0104] 注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与高剂量组比较，△△P＜0.01。

[0105] 2.4对大鼠肺组织TGF‑β1含量的影响(见图3)与假手术组比较，模型组大鼠肺组织TGF‑β1含量增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，实施例1高、低剂量组大鼠肺组织TGF‑β1含量有不同程度降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。实施例1高、低剂量组间比较，TGF‑β1含量差异无统计学意义(P＞0.05)。见表8。

[0106] 表8各组大鼠肺组织TGF‑β1的影响(n＝10， )

[0107]

[0108] 注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

[0109] 2.5各组大鼠肺组织HE染色结果 假手术组大鼠肺组织结构正常，HE染色未见明显炎性细胞渗出及出血，博来霉素造模后，模型组切片病变分布不均匀，病变处肺组织结构破坏，肺泡腔不规则缩塌融合，肺泡间隔明显增宽，内见炎症细胞浸润、成纤维细胞增生。肺动脉内膜增生，中层增厚，模型组动脉中膜厚度比例已达假手术组的两倍之多。实施例1高、低剂量组大鼠肺组织肺泡结构改变、炎症细胞浸润及胶原沉积较模型组改善，血管扩张现象较模型组减轻，见图4。

[0110] 2.6对肺纤维化大鼠肺组织KL‑6、TGF‑β1、IL‑6蛋白表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠肺组织内KL‑6、TGF‑β1、IL‑6蛋白表达增加。与模型组比较，实施例1高、低剂量组KL‑6、TGF‑β1、IL‑6蛋白表达均有降低。见图5。

[0111] 实施例10动物实验(二)

[0112] 不同组分对博来霉素致大鼠肺纤维化影响

[0113] 1材料与方法(参实施例9)

[0114] 1.1材料

[0115] 1.1.1动物 SPF级雄性SD大鼠30只，体质量(200±20)g，购于常州卡文斯实验动物有限责任公司。动物生产许可证号码：SCXK(苏)2016‑0010。饲养于上海大学转化医学研究院动物实验中心，实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2014‑0016。饲养条件为室温20～25℃，湿度40％～70％，标准饲料，动物自由饮食和饮水。SD大鼠在无病原体的SPF级动物房内适养1周。

[0116] 1.2分组与造模和干预 按随机数字表法将SD大鼠随机分为3组，即本发明组(使用实施例2组合物)、对照组1(使用实施例6组合物)、对照组2(使用实施例7组合物)，每组10只。给药方法据“人和动物按体表面积折算的等效剂量比值表”折算，以临床剂量换算大鼠用药剂量。本发明组给药剂量为14.19g/kg体质量，配置成浓度为1.42g/mL。本发明组每日予各自浓度实施例2高剂量按10mL/kg体质量灌胃。对照组1给药剂量为14.19g/kg体质量，配置成浓度为1.42g/mL。对照组1每日予各自浓度实施例6高剂量按10mL/kg体质量灌胃。对照组2给药剂量为14.19g/kg体质量，配置成浓度为1.42g/mL。对照组2每日予各自浓度实施例7高剂量按10mL/kg体质量灌胃。上述各组均造模后第1天开始干预，直至实验结束。

[0117] 1.3检测指标与方法

[0118] 肺组织KL‑6、IL‑6、IL‑12蛋白表达 采用Western Blot法检测肺组织KL‑6、IL‑6、IL‑12蛋白表达。将制备好的SDS‑PAGE胶胶板扣上电泳槽，加入1×Running Buffer，拔掉梳子，加入蛋白Marker和样品，80V，30min；120V，70min电泳。将转膜槽置于冰水混合物中300mA，1h进行转膜。用5％脱脂牛奶封闭后，加入含有目的抗体的抗体稀释液，4℃过夜孵育。次日用TBST在高低摇床上洗膜3遍，每次5min；再加入含有二抗的抗体稀释液，室温孵育
1～2h；最后按照1︰1的比例配置ECL显色液的A、B液，并用锡箔纸包裏避光。将膜放置于检测板上，小心吸除残余TBST，加入200μL左右的显色液，铺匀后扫膜。隔天室温二抗孵育2h，随后用凝胶成像仪进行发光拍照，并用Image J分析条带灰度值。

[0119] 2.1对大鼠血清KL‑6、IL‑6、IL‑21含量的影响见表9

[0120] 表9各组大鼠血清KL‑6、IL‑6、IL‑21的比较(n＝10， )

[0121]

[0122] 大鼠血清KL‑6含量：对照组1、对照组2高于本发明组；大鼠血清IL‑6含量：对照组1、对照组2高于本发明组；大鼠血清IL‑21含量：对照组1、对照组2高于本发明组。本发明的特定的组分配比技术方案治疗大鼠肺纤维化带来显著效果。本发明通过调节KL‑6、IL‑6、IL‑21的表达，减轻大鼠肺纤维化程度，且高剂量组较低剂量组效果更佳。各组均无大鼠死亡，药物安全性较好。

[0123] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。