一种Treg细胞制备方法以及在自身免疫性疾病方面的应用

摘要

本发明涉及一种Treg细胞制备方法以及在自身免疫性疾病方面的应用，本发明还提供一种PDE9A单克隆抗体，该抗体能够促进Treg细胞的增殖及提高其活性，增殖的Treg细胞具有较好的治疗免疫相关疾病的效果。

权利要求

1.一种PDE9A的单克隆抗体1A3，所述单克隆抗体1A3的轻链可变区如SEQ ID NO：1所示； 重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种编码权利要求1所述的PDE9A的单克隆抗体1A3的表达载体。

3.增殖后的CD4+CD25+Treg细胞在制备用于治疗关节炎的药物中的用途，其中所述增殖后的CD4+CD25+Treg细胞是将分离的CD4+CD25+Treg细胞用含有1000u／ml IL‑2以及

100mg／L PDE9A的单克隆抗体1A3的完全培养基在5％CO2和37℃的条件下的培养箱中培养，每隔3d更换一次培养基，连续培养9d后收集的增殖活化后的CD4+CD25+Treg细胞,所述单克隆抗体1A3的轻链可变区如SEQ ID NO：1所示； 重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于:所述药物还含有药学上可接受的载体。

5.如权利要求4所述的用途，所述药学上可接受的载体包括赋形剂。

6.如权利要求5所述的用途，所述赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，大米，面粉，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，氯化钠，脱脂乳，甘油或丙二醇。

说明书

一种Treg细胞制备方法以及在自身免疫性疾病方面的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物领域，更具体的涉及一种Treg细胞制备方法以及在自身免疫性疾病方面的应用。

背景技术

[0002] 调节性T细胞(Regulatory cells,简称Tregs )是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，早期亦称做suppressor T cells。调节性T细胞可分为天然产生的自然调节性T细胞（n T‑regs）和诱导产生的适应性调节性T细胞(a T‑regs或i T‑regs)，如Th3、Tr1，另外尚有CD8 Treg、NKT细胞等，与自身免疫性疾病的发生关系密切，其异常表达可导致自身免疫性疾病。

[0003] 调节性T细胞（Regulatory T cells）是维持机体免疫耐受的重要因素之一，它由胸腺产生后输出至外周，并通过主动调节的方式抑制存在于正常机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，从而调节机体的免疫力，如防止自身免疫性疾病的发生。CD4* CD25’/FOXP3*细胞的数量减少或功能异常均有可能导致自身免疫病的发生，一些自身免疫性疾病如多发性硬化症、活动性类风湿关节炎、I型糖尿病等调节性T细胞的数量和功能均会发生变化。在许多恶性疾病如肺、胰腺和乳腺癌等已经发现调节性T细胞明显增高。调节性T细胞也阻断抗肿瘤免疫反应从而导致死亡率上升，也可用于骨髓移植术前术后的跟踪。

[0004] 自身免疫性疾病(autoimmunediseases，AID)是机体因免疫功能紊乱对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织、器官、系统损伤所致的一类疾病，包括自身免疫性肝病(AILD)、自身免疫性甲状腺病、自身免疫性溶血性贫血、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、多发性脑脊髓硬化症、重症肌无力、硬皮病、混合性结缔组织病等多种疾病。AID发病机制不明确，临床表现和诊断方法各异，多种细胞因子参与发病，但以效应T细胞参与的免疫反应更为显著，且肾上腺皮质激素治疗和/或免疫抑制剂治疗AID有一定疗效。T细胞除了Th1、Th2亚群外，还包括Th17和Treg两个新亚群，Th17细胞的主要效应因子IL‑17有促炎效应，而Treg细胞分泌IL‑4、IL‑10和转化生长因子β(TGF‑β)等具有免疫抑制作用且两者在AID中的作用成为近年来的研究热点。

[0005] Treg细胞是Th1、Th2、Th17之外的T细胞亚群，具有免疫调节功能，能够分泌IL‑4、IL‑10和TGF‑β等细胞因子，在免疫稳态和诱导免疫耐受中发挥重要作用。Treg细胞可分为天然型调节T细胞(nTreg)和诱导型调节T细胞(iTreg)两类;nTreg由胸腺细胞分化发育而来;iTreg由外周成熟T细胞受到特异性抗原刺激并在细胞因子的诱导下分化而来。Treg通过多种机制发挥免疫抑制作用，如产生抑制性细胞因子、破坏靶向T细胞的代谢、细胞溶解和调节树突状细胞的分化和功能。转录因子叉头盒P3(Foxp3)参与Treg细胞的分化并特异性高表达，是目前最特异的Treg细胞标志物。转录激活子STAT5是参与Treg细胞分化与存活的另一重要因素。

[0006] Treg细胞在免疫平衡中扮演的角色。在最严重的Treg缺乏症中，IPEX（免疫调节，多内分泌病，肠病，X连锁）综合征最为突出，关键Treg谱系特异性转录因子FOXP3（叉头盒P3）中的突变导致Treg缺陷，导致致命的多器官炎症和自身免疫。重要的是，Tregs的数量和/或功能的减少与许多常见自身免疫疾病的病理学有关。实际上，在一些疾病环境中，Treg功能缺陷或Treg生长和存活因子如白细胞介素‑2（IL‑2）的减少，再加部组织环境中高浓度炎性细胞因子如IL‑6，IL‑12，IL‑1的产生让Treg不稳定，从而导致不受控制的炎症和过度的组织损伤。

[0007] 因此，许多正在进行的研究正在开始重新利用之前获批的药物，如Treg生长因子（例如，IL‑2）和Treg稳定因子（例如，雷帕霉素），以增强Treg功能的药物，这些可以作为控制各种自身免疫疾病，GvHD和器官移植排斥反应的方法。上述这些结果强调了通过增强Treg活性直接改变病理性免疫应答的机会 ，这也是基于Treg的ACT目标。

[0008] 用于治疗自身免疫疾病的第一个临床前概念验证研究是使用多克隆的调节性T细胞（Tregs）进行的，他们称为抑制性细胞，这些细胞基于包括CD4，CD25和CD62L在内的多种细胞表面标志物表达分离出来的。这些努力以及随后使用纯化的FOXP3 + Tregs的研究获得成功，促进了在多种疾病环境中进行的若干临床试验，包括器官移植排斥，GvHD，T1D和自身免疫综合征。

[0009] 研究发现，PDE9A抑制剂能够制备提升Treg(即调节性T细胞，Regulatory cell)含量，可应用于对自身免疫疾病的治疗。PDE9A抑制剂可以用于制备提升Treg含量的试剂。但是目前，Treg细胞分离获得的数量较少，因此研究如何高产量的获得Treg细胞是目前研究的方向。

发明内容

[0010] 发明人发现， PDE9A抑制剂能够提高Treg细胞的含量，在此基础上，开发了针对PDE9A的单克隆抗体抑制剂以及相应的提高Treg细胞产量的方法。

[0011] 进一步的，本发明提供一种PDE9A的单克隆抗体1A3，所述抗体的轻重链可变区分别如下所示：

[0012] 轻链可变区（SEQ ID NO：1）

[0013] DIVITQRPALMAASPGEKVTITCALALVYWPPKYFWYQQKSGISPKPWIYDYTDIKWGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCQKDILDGNLFGAGTKLELK

[0014] 重链可变区（SEQ ID NO：2）

[0015] EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSKDSNVWIKQRPGQGLEWIGLEKMEANIREPYCDMEGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGSHSTYLSWGLGTTLAVSS

[0016] 进一步的，本发明还提供一种如上述PDE9A的单克隆抗体的编码基因。

[0017] 进一步的，PDE9A的单克隆抗体编码基因的表达载体。

[0018] 另外，本发明的抗体的另一种方式是作为任何下述抗体及其抗原结合片段的“衍生物”。 术语“衍生物”是指免疫特异性结合抗原的抗体或其抗原结合片段，但其包括相对于“亲本”（或野生型）分子的一个，两个，三个，四个，五个或更多个氨基酸取代，添加，缺失或修饰。 这种氨基酸取代或添加可以引入天然存在的（即，DNA编码的）或非天然存在的氨基酸残基。 术语“衍生物”包括，例如，具有改变的CH1，铰链，CH2，CH3或CH4区域的变体，以便形成例如具有变体Fc区域的抗体等，所述变体Fc区域表现出增强的或受损的效应子或结合特性。 术语“衍生物”还包括非氨基酸修饰， 例如，可以被糖基化的氨基酸（例如，改变了甘露糖，2‑N‑乙酰葡糖胺，半乳糖，岩藻糖，葡萄糖，唾液酸，5‑N‑乙酰神经氨酸，5‑乙醇神经氨酸等的含量），乙酰化，PEG化，磷酸化，酰胺化，由已知的保护/阻断基团衍生，蛋白水解裂解，连接到细胞配体或其它蛋白等。 在一些实施方案中，改变的碳水化合物修饰调节以下的一种或多种：抗体的溶解，促进抗体的亚细胞转运和分泌，促进抗体组装，构象完整性和抗体介导的效应子功能。 在特定的实施方案中，相对于缺少碳水化合物修饰的抗体，改变的碳水化合物修饰增强了抗体介导的效应子功能。 导致抗体介导的效应子功能改变的碳水化合物修饰在本领域是众所周知的。

[0019] 另一方面，抗体的编码序列可以同源性限定所述序列，任选地使用下面更详细讨论的方法。 例如， 核酸序列可以不同于以上所述的序列，因为(a)可变区可以与轻链和重链的恒定结构域分离， (b)核酸可以不同于上述核酸，同时不影响其编码的残基， (c)核酸可以与上述核酸相差给定的百分比， 例如， 70%， 75%， 80%， 85%， 90%， 91%， 92%， 93%， 94%， 95%， 96%， 97%， 98%或99%同源性， (d)由于在高严谨条件下杂交的能力，核酸可以不同于上述核酸， 以低盐和/或高温条件为例， 例如由约0.02M至约0.15M NaCl在约50℃至约70℃的温度下提供的，  (e)氨基酸可以与以上所述的那些改变给定的百分比，例如
80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%同源性，或者(f)氨基酸可以通过允许保守取代而与以上所述的那些改变

[0020] 更进一步的，本发明提供了PDE9A的单克隆抗体在制备免疫性疾病药物中的应用。

[0021] 更进一步的，本发明提供一种药物组合物，其含有PDE9A的单克隆抗体药物或者PDE9A的单克隆抗体培养的Treg细胞以及合适的载体。

[0022] 本公开提供的组合物包含预防或治疗有效量的抗体或其片段或者PDE9A的单克隆抗体培养的Treg细胞以及合适的载体。 在一个特定的实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或列在美国药典或其它公认的药典中用于动物，更具体地用于人。 术语“载体”是指给予治疗的稀释剂，赋形剂或载体。 这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油，动物，植物或合成来源的那些，例如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等。 当药物组合物静脉内给药时，水是特定的载体。 盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。 其它合适的药用赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，大米，面粉，粉笔，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，氯化钠，脱脂乳干，甘油，丙二醇，水，乙醇等。

[0023] 如果需要，该组合物还可含有少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。 这些组合物可以采取溶液，悬浮液，乳剂，片剂，丸剂，胶囊，散剂，缓释制剂等形式。 口服制剂可包括标准载体，例如药物级甘露醇， 乳糖， 淀粉， 硬脂酸镁， 糖精钠， 纤维素， 碳酸镁， 合适的药物制剂的例子在“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述。这样的组合物将含有预防或治疗有效量的抗体或其片段， 优选为纯化形式，与适量载体一起为患者提供合适的给药形式。 该制剂应当适合给药方式，其可以是口服，静脉内，动脉内，颊内，鼻内，喷雾，支气管吸入，直肠内，阴道内，局部或通过机械通气递送。

[0024] 通过本发明方法扩增的富集TREG细胞优选给予受试者至少一天，优选7‑180天，更优选30‑90天的时间。

[0025] 优选的给药方案是至少一个月的恒定输注相当于106‑108个/kg/天，但是可以达到7 8 6 8
10‑10个/kg/天。 或者，可以每天注射（1或2次/天），每天注射应当达到10‑10个/kg/天，
8
但是可以达到10个/kg/天。

[0026] 在局部递送的情况下，由于没有毒性，可以使用更高浓度，但也可以使用更低剂量。 对于局部递送，范围可以根据吸收程度，到达靶器官的能力（从肺部，口服或局部应用）而变化，并达到治疗功效。 因此，在局部应用中，剂量可以在0.001g‑50mg/kg/天的范围内。

[0027] 在一个优选实施例中， 通过从患者中提取T细胞的混合群体来扩增Treg细胞， 通过阴性和阳性免疫选择和/或细胞分选从该群体中分离富集Treg细胞的T细胞亚群，并通过使该亚群与有效量的PDE9A单克隆抗体以及IL‑2接触来扩增该亚群的Treg细胞。 优选地，该富集的T细胞亚群包括至少10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或大于98%CD4+CD25+T细胞（Treg细胞）。 更优选地，富集的亚群包括至少85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或大于
98%CD4+CD25+T细胞（Treg细胞）。 最优选的亚群包括大于98%的CD4+CD25+T细胞（Treg细胞）。

[0028] 在Treg细胞扩增后，优选将细胞移植或再导入患者体内。 这通常如本领域已知的那样进行，并且通常包括通过静脉内给药将处理过的细胞注射或导入患者体内，如本领域技术人员所理解的。 例如，可以通过使用无菌注射器或其它无菌转移机构注射将细胞放置在输液袋中。 然后可通过静脉内给药在一段时间例如15分钟内立即输注细胞。 另外的试剂如缓冲液或盐也可以加入到细胞中。 或者，当需要时，也可以进行处理细胞的局部移植。

[0029] 可应用本发明的另一个例子是具有自身免疫成分的疾病，包括那些遗传疾病，如Wiskott‑Aldrich综合征，其中Treg细胞在激活，存活，迁移增殖和/或抑制功能方面表现出显著的缺陷。

[0030] 先前的研究已经证实Treg在控制肠道炎症中的明确作用，并且提示Treg细胞功能的丧失是在患有炎症性肠病的患者中观察到的免疫调节缺乏的原因。炎性肠病（克罗恩病，溃疡性结肠炎）是特发性慢性炎性慢性疾病，导致各种临床症状，如腹痛，严重腹泻，直肠出血和消瘦。 已经开发了几种IBD模型以增加我们对这些炎性疾病的机制的理解。 这些模型中的一些模型与在一些人类形式的IBD中观察到的放大的促炎T细胞反应相平行。 事实上，慢性肠道炎症主要由T淋巴细胞介导。 过继转移模型已经证明T细胞引发和维持肠和/或结肠炎症。 它们还证明了TREG在控制肠道炎症中的明确作用。 Treg似乎通过细胞因子IL‑10和TGF‑13介导它们的一些作用。 因此，增强CD4+CD25+Treg细胞的数量和活性是治疗IBD和抑制炎症的明显目标。

[0031] 有益效果

[0032] 本发明涉及Treg细胞的增殖以及相应的用于免疫相关疾病的治疗，更具体的提供一种PDE9A单克隆抗体，该抗体能够促进Treg细胞的增殖及提高其活性，增殖的Treg细胞具有较好的治疗免疫相关疾病的效果。

附图说明

[0033] 图1 治疗结果评分图

具体实施方式

[0034] 下面的详细描述通过举例说明的方式指的是其中可以实施本发明的具体细节和实施例。 这些实施例被充分详细地描述，以使本领域技术人员能够实施本发明。 在不脱离本发明的范围的情况下，可以使用其它实施例，并且可以进行结构上和逻辑上的改变。 由于一些实施例可以与一个或多个其它实施例组合以形成新的实施例，所以各个实施例不一定是相互排斥的。

[0035] 实施例1 PDE9A单克隆抗体的制备

[0036] 根据人和鼠PDE9A的蛋白序列，针对共同保守区以及高免疫原性区，设计并获得了特异性的抗原序列：lavlekrvel eglkvveiek cksdikkmre elaarssrtn cpckysfldn hkkltprrdv ptypkyllsp etiealrkpt fdvwlwepne mlsclehmyh dlglvrdfsi npvtlrrwlf，将所述抗原序列由艾柏森(北京)生物科技有限公司进行表达合成。经过HPLC分析其纯度>98.5%，将合成肽于血蓝蛋白KLH偶联后，作为免疫原备用。

[0037] 采用一次免疫3只小鼠．每次取50ug PDE9A多肽KLH偶联物，采取小鼠皮下多点注射法，间隔3周，第三次免疫1周后采血测其效价，选择高效价者进行加强免疫，加强免疫3天后准备细胞融合，按照传统单克隆抗体制备技术进行，经有限稀释法克隆化培养获得杂交瘤细胞株。并经过反复冻存、复苏后，鉴定染色体及单抗分泌稳定者建立杂交瘤细胞株共3株，分别是1A3，4D3，6E2三株杂交瘤细胞株。

[0038] 按常规方法取8周龄BALB／c小鼠进行腹水制备。将单抗腹水以1：100比例开始倍比稀释，采用间接ELISA检测其反应效价，3株杂交瘤细胞株的效价均在1:12800以上。同时用HRP标记羊抗小鼠抗体亚类鉴定试剂盒对纯化腹水中单抗进行亚类鉴定，3株单抗均为IgG1，轻链均为κ链。

[0039] PDE9A蛋白检测采用间接ELISA法。通过间接ELISA检测三株单抗均能与PDE9A蛋白（ab125666）发生特异性结合。与BSA蛋白和KLH均不结合，表现较好的特异性。

[0040] 实施例2  PDE9A单克隆抗体1A3的性能鉴定

[0041] 利用Fortibio测定抗体结合及解离常数。利用OctetRED(Fortebio,USA)仪器，测定抗1A3抗体亲和力。PBS稀释抗体浓度为10μg/mL，包被AHC传感器；PBS为对照，稀释1A3浓度为0.1μg/mL 、1μg/mL、3μg/mL、10μg/ mL、测定抗1A3抗体与PDE9A蛋白相互作用的结合、解离曲线；利用GlobeFitting拟合曲线， 计算两者相互作用的解离常数。结果，本发明获得的1A3单克隆抗体其解离常数达到了1.21nM，具有较好的结合效果。

[0042] 实施例3 人外周血CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）的分离及增殖活性验证[0043] 采健康人外周血，密度梯度离心法分离PBMC，用Dynabeads阳性分选PBMC中的CD8+T细胞，然后用DERACHaBEAD去除CD8+T细胞上的珠子；当分选CD4+T细胞时，采用Miltenyi磁60
珠阴性分选。将这种去除T细胞（包括CD8+T细胞和CD4+细胞）的剩余细胞，用 Co照射（30Gy），作为抗原提呈细胞（APC）。对总CD4+细胞再通过抗CD25的磁珠阳性分选，将CD4+CD25+T细胞与CD4+CD25‑T细胞分开。

[0044] 将分离得到的CD4+CD25+Treg接种于96孔U型底培养板中，每孔细胞个数为1×4
10 ，终体积为200μ1。培养液为RPMI1640完全培养液(含有10%灭活胎牛血清，青、链霉素各
50U／ml)，培养体系中CD3／CD28单克隆抗体包被的Dynal Beads与细胞的比例为4:1，并且加入浓度为200U／ml的IL‑2，于37℃、5%CO2饱和湿度的条件下进行培养。实验分为2组：第1组在CD4+CD25+Treg培养体系中不加PDE9A单克隆抗体1A3，共培养两轮，第6天去除CD3／CD28单克隆抗体包被的DynalBeads，只加入20U／ml IL‑2，第8天重新用CD3／CD28单克隆抗体包被的DynalBeads刺激继续第二轮培养；第2组培养体系中除加入100mg／L PDE9A单克隆抗体
1A3以外，其它条件与第1组相同。每个实验组均每2～3天补充与之对应的外源性人IL‑2及RPMI1640完全培养液。结果显示，第二组CD4+CD25+表达达到了99.7%，比第一组的94.3%显著提高；同时，第二组CD4+CD25+细胞数量也比第一组的要高34.2%，说明加入PDE9A单克隆抗体1A3能够促进CD4+CD25+Treg细胞的增殖。

[0045] 实施例4 细胞对CIA小鼠实验

[0046] 用含有1000u／ml IL‑2以及100mg／L PDE9A单克隆抗体1A3的完全培养基将分选纯化后的CD4+CD25+Treg细胞重新混悬，接种于96孔板中并在饱和湿度、5％CO2和37℃的条件下的培养箱中培养，每隔3d更换一次培养基，连续培养9d后收集细胞，即为增殖活化后的CD4+CD25+Treg细胞，命名为细胞1。

[0047] 用含有1000u／ml IL‑2的完全培养基将分选纯化后的CD4+CD25+Treg细胞重新混悬，接种于96孔板中并在饱和湿度、5％CO2和37℃的条件下的培养箱中培养，每隔3d更换一次培养基，连续培养9d后收集细胞，即为增殖活化后的对照CD4+CD25+Treg细胞，命名为细胞2。

[0048] CIA小鼠模型的建立与评价：Ⅱ型胶原溶液(2mg／ml溶于0．05mol／L醋酸中)与完全弗氏佐剂(CFA，含1mg／ml Mycobacteriumtuberculosis)体积1：1完全混合乳化，于小鼠尾根部皮下注射50ul混合溶液(含50ugⅡ型胶原)，记为第0天；第21天二次免疫接种50ul混合溶液。第22天进行治疗。CD4+CD25+Tregs治疗CIA小鼠将二次免疫后的CIA小鼠随机分为对照组，细胞1治疗组，细胞2治疗组，细胞1联合1A3治疗组，1A3治疗组。细胞1和细胞2治疗组7
分别经小鼠尾根部静脉过继输注100ul Tregs细胞悬液(1X10／鼠)；1A3治疗组经腹腔注射
100ul 1.0mg／kg单抗；细胞1联合1A3治疗组联合治疗组同时进行以上两种治疗：对照组静脉与腹腔同时注射100ul PBS溶液。每周治疗一次。

[0049] 第21天开始评分，每周评一次，关节炎严重程度采用如下评分标准：0分，关节正常，无明显症状；1分，单一趾关节发生炎症红肿；2分，两个以上(包括两个)趾关节发生红肿，但没达到整个脚掌，或整个脚掌轻微红肿；3分，整个脚掌炎症红肿；4分，整个脚掌严重红肿，或踝关节变形、强直。每只小鼠关节炎严重程度以4足累积总分表示。

[0050] 各组CIA小鼠评分结果如图1所示。

[0051] 从图1 的结果可以看出，各治疗组均能延缓CIA小鼠的关节炎症状的发生。与对照组相比，细胞1联合1A3治疗组可显著改善关节炎的临床评分，在49天评分只有（3.12±0.19），比对照的（10.2±0.20）显著降低 (P<0.05)；从实验结果可以看出，采用单抗处理后获得细胞1治疗组的治疗效果也比不采用单抗处理的Treg细胞治疗组的效果要好，这说明采用单抗处理后获得Treg细胞本身的活性更强。而单独采用1A3单克隆抗体治疗小鼠后，能够刺激小鼠体内Treg细胞的增殖进而抑制关节炎症状，但是其效果比直接采用Treg细胞治疗要略差，这也说明单抗刺激Treg细胞增殖具有一定的滞后性。

[0052] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。