一种反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A及其应用

摘要

本发明公开了一种反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A及其应用。本发明提供了来源于山羊瘤胃原虫Ostracodinium gracile的木聚糖酶，利用pPIC9K载体与木聚糖酶OGXyn1A序列构建毕赤酵母表达菌株，使该木聚糖酶OGXyn1A在毕赤酵母中高效的分泌表达。该木聚糖酶降解榉木木聚糖的最适pH为5.0、最适温度50℃，比活为206U/mg，可以广泛应用于畜禽饲料、造纸、食品、生物能源。

权利要求

1.一种反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A，其特征在于：该木聚糖酶OGXyn1A的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

2.根据权利要求1所述一种反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A，其特征在于：所述木聚糖酶OGXyn1A的编码序列为SEQ.ID.NO.5所示的DNA序列。

3.一种表达木聚糖酶的重组载体，其特征在于：该重组载体包括如权利要求1所述的反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A的编码序列。

4.一种表达木聚糖酶的重组菌株，其特征在于：该重组菌株包括转化有如权利要求3所述的重组载体的宿主细胞。

5.一种制备如权利要求1所述的反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)根据所述木聚糖酶OGXyn1A的编码序列构建重组载体，将重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

2)将重组菌株通过发酵进行重组木聚糖酶OGXyn1A的诱导表达，得到发酵液；

3)收集发酵液上清，得到重组木聚糖酶OGXyn1A蛋白样品。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组载体表达的目的基因序列如SEQ.ID.NO.6所示。

8.一种如权利要求1所述的反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A在制备酶制剂中的应用。

9.一种酶制剂，其特征在于：该酶制剂包括如权利要求1所述的反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A。

说明书

一种反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种反刍动物瘤胃原虫“薄硬甲虫”(Ostracodinium gracile)木聚糖酶(xylanase,Xyn)在毕赤酵母中的分泌表达方法及应用。

背景技术

[0002] 作为植物半纤维素主要成分的木聚糖，是自然界中除纤维素之外较为丰富的再生资源。木聚糖的结构复杂，一般需要多种酶的共同作用才能将其完全降解。木聚糖酶是木聚糖降解中的关键酶，用于降解木聚糖主链的β‑1,4‑糖苷键。木聚糖酶广泛分布在自然环境中的微生物体内，这种来源的木聚糖酶具有活力高、成本低的优点。但受限于微生物通常生存于温和的生理环境，所获得的木聚糖酶难以耐受苛刻温度和pH条件。

[0003] 反刍动物瘤胃作为一个天然、高效的植物细胞壁多糖降解场所，其内存在大量的微生物。随着宏基因组的发展，瘤胃内微生物特别是原生生物对木质纤维素、半纤维素的降解作用也得到了广泛研究。有研究报道了来源于多甲属(Polyplastron)的多泡多甲虫(Polyplastron multivesiculatum)的木聚糖酶，该酶的最适温度为39℃，最适pH为7，使其在工业中的应用仍存在一定限制。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A及其应用。该木聚糖酶OGXyn1A可以用作一种新型来源的酶制剂，并广泛应用于畜禽饲料、造纸、食品和生物能源。

[0005] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

[0006] 一种反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A，该木聚糖酶OGXyn1A的基因编码序列包括SEQ.ID.NO.5所示的DNA序列，或者所述木聚糖酶OGXyn1A的基因编码序列选自与SEQ.ID.NO.5所示的DNA序列具有90％以上同源性的来源于反刍动物瘤胃原虫基因组的序列。

[0007] 优选的，所述木聚糖酶OGXyn1A的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

[0008] 优选的，所述反刍动物瘤胃原虫为硬甲属(Osteracodinium)，例如薄硬甲虫(Ostracodinium gracile)。

[0009] 一种表达木聚糖酶的重组载体，该重组载体包括上述反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A的编码序列。

[0010] 一种表达木聚糖酶的重组菌株，该重组菌株包括转化有上述重组载体的宿主细胞。

[0011] 一种制备上述反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A的方法，包括以下步骤：

[0012] 1)根据所述木聚糖酶OGXyn1A的基因编码序列构建甲醇诱导型重组载体，将所述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

[0013] 2)将重组菌株通过发酵进行重组木聚糖酶OGXyn1A的诱导表达，得到发酵液；

[0014] 3)收集发酵液上清，得到重组木聚糖酶OGXyn1A蛋白样品。

[0015] 优选的，所述宿主细胞来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)，例如毕赤酵母GS115感受态细胞。

[0016] 优选的，所述重组载体表达的目的基因序列如SEQ.ID.NO.6所示，重组木聚糖酶OGXyn1A的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

[0017] 上述反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A在制备酶制剂中的应用。

[0018] 一种酶制剂，该酶制剂包括上述反刍动物瘤胃原虫木聚糖酶OGXyn1A。

[0019] 本发明的有益效果体现在：

[0020] 本发明从山羊瘤胃原虫Ostracodinium gracile基因组中鉴定出一种木聚糖酶(命名为OGXyn1A)基因，并根据基因编码序列建立了通过在宿主菌中分泌表达而制备该木聚糖酶的方法。所述木聚糖酶不仅酶活力高，而且可以在pH5.0～12.0的范围内维持较高的酶活性(最适温度为50℃)，在畜禽饲料、造纸、食品、生物能源等领域具有一定的应用前景。

[0021] 本发明根据瘤胃原虫Ostracodinium gracile特异的木聚糖酶(即木聚糖酶OGXyn1A)的序列构建可以高效的分泌表达该木聚糖酶的甲醇诱导型毕赤酵母重组菌株，使木聚糖酶OGXyn1A的生产具有操作简单、周期短的优点。

附图说明

[0022] 图1为实施例中重组OGXyn1A基因表达产物SDS‑PAGE电泳图，其中Marker为蛋白分子量。

[0023] 图2为重组木聚糖酶OGXyn1A最适pH测定图。

[0024] 图3为重组木聚糖酶OGXyn1A pH稳定性测定图。

[0025] 图4为重组木聚糖酶OGXyn1A最适温度测定图。

[0026] 图5为重组木聚糖酶OGXyn1A温度稳定性测定图。

具体实施方式

[0027] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，以便于本领域技术人员理解本发明，但本发明的保护范围并不局限于此。

[0028] (一)反刍动物瘤胃原虫Ostracodinium gracile木聚糖酶OGXyn1A在毕赤酵母中的分泌表达方法

[0029] 1、构建毕赤酵母GS115重组菌株

[0030] 1.1本发明利用反刍动物(包括关中奶山羊，关中奶山羊瘤胃内容物于2019年11月采集于陕西杨凌)瘤胃原虫Ostracodinium gracile基因组测序数据，对其基因进行组装、注释分析，鉴定得到了一个山羊瘤胃原虫Ostracodinium gracile的木聚糖酶(命名为OGXyn1A)基因。该木聚糖酶OGXyn1A基因编码的对应氨基酸序列如下所示(即SEQ.ID.NO.1)：

[0031] MKKPIISLLLVLSLLSMFAETSLISTSFEDGDITMFTKRGDYDASKLTLKKDGGKTGSNYLWVSGREETWNGAQFSLVGKCKEGDQYIASVAVKAPEKANICLSMQHTDSSGEDHYNNLKCTESKGDWVEMKEFKFTIPAGAKSVYLYFENTSGTGDFGVDDFVIKGDSSTIDDSIPSLKEKFSKHFKFGTATTVDELSPKTTQQLILQHFNSLTIGNELKPDYLLDRSATLANAEKTGDYTNPLVKIGGAATILDFCAKNNIPVRGHVLVWHSQTPTWFFKEKFDQYGKWVSKEIMLKRMENYIKNVFDMIKKLYPTVNFYAWDVVNEAWEDDGKPRKPGSQEEGGGLSPWVKVFGDNSFIKYAFKYARKYGIEGCKLYYNDYNEYITGKTNAIVEMVKDINSEEKLIDGIGMQSHLDVNFPGISMYESAVKAFSQTGLDVQVTELDATTDCSSAGFETQAKYYRDIMNVLVKYSKYVSAVVVWGTTDDKSWRTAQCPLLFNGDYSPKPCFNWIVEVA[0032] 其中，N端的前21个氨基酸“MKKPIISLLLVLSLLSMFAET”(即SEQ.ID.NO.2)为其信号肽；其信号肽碱基序列如SEQ.ID.NO.3所示。

[0033] 因此，该木聚糖酶的成熟蛋白由498个氨基酸组成，理论分子量为56KDa，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，基因编码序列如SEQ.ID.NO.5。

[0034] 根据木聚糖酶OGXyn1A氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子偏好性，得到去除信号肽的重组瘤胃原虫Ostracodinium gracile木聚糖酶OGXyn1A基因序列(由北京博迈德基因技术有限公司合成，序列设计完成时间为2021年11月)，如SEQ.ID.NO.6所示。瘤胃原虫Ostracodinium gracile木聚糖酶OGXyn1A重组蛋白的氨基酸序列如下所示(即SEQ.ID.NO.4)：

[0035] SLISTSFEDGDITMFTKRGDYDASKLTLKKDGGKTGSNYLWVSGREETWNGAQFSLVGKCKEGDQYIASVAVKAPEKANICLSMQHTDSSGEDHYNNLKCTESKGDWVEMKEFKFTIPAGAKSVYLYFENTSGTGDFGVDDFVIKGDSSTIDDSIPSLKEKFSKHFKFGTATTVDELSPKTTQQLILQHFNSLTIGNELKPDYLLDRSATLANAEKTGDYTNPLVKIGGAATILDFCAKNNIPVRGHVLVWHSQTPTWFFKEKFDQYGKWVSKEIMLKRMENYIKNVFDMIKKLYPTVNFYAWDVVNEAWEDDGKPRKPGSQEEGGGLSPWVKVFGDNSFIKYAFKYARKYGIEGCKLYYNDYNEYITGKTNAIVEMVKDINSEEKLIDGIGMQSHLDVNFPGISMYESAVKAFSQTGLDVQVTELDATTDCSSAGFETQAKYYRDIMNVLVKYSKYVSAVVVWGTTDDKSWRTAQCPLLFNGDYSPKPCFNWIVEVA。

[0036] 1.2将编码成熟的瘤胃原虫Ostracodinium gracile木聚糖酶OGXyn1A基因片段经EcoR I和Not I双酶切(合成重组瘤胃原虫Ostracodinium gracile木聚糖酶OGXyn1A基因序列时于序列两端引入相应限制性酶切位点)后，连接于经过同样双酶切的pPIC9K表达载体(购自Invitrogen公司)，获得重组质粒pPIC9K‑OGXyn1A，质粒提取采用天根质粒小提中量试剂盒。

[0037] 1.3制备毕赤酵母GS115感受态细胞

[0038] 挑选YPD固体平板上的Pichia pastoris GS115单克隆(购自Invitrogen公司)，接种到3mL YPD液体培养基中，30℃、200rmp摇床培养。菌体生长至OD600～1.0，转接至100mL YPD摇瓶中，30℃、200rmp摇床培养。待菌体生长至OD600～1.0，在4℃下5000rmp离心5min，去除上清，加入200mL冰水，重悬；在4℃下，5000rmp离心5min，去除上清，加入100mL冰水，重悬；在4℃下5000rmp离心5min，去除上清，加入50mL冰水，重悬；在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入4mL冰山梨醇(1M)，重悬；在4℃下1500g离心5min，去除上清，加入2mL冰山梨醇(1M)，重悬，收集备用。

[0039] 1.4 pPIC9K‑OGXyn1A转化毕赤酵母GS115

[0040] 将待转化的pPIC9K‑OGXyn1A质粒利用Bgl II限制性内切酶进行线性化，电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞；取转化菌液均匀涂于MD固体平板上培养，挑取阳性单克隆，即毕赤酵母GS115重组菌株。

[0041] 2、发酵培养重组菌株并甲醇诱导重组木聚糖酶表达

[0042] 取毕赤酵母GS115重组菌株，接种于200mL BMGY液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养48h，5000rpm转速离心5分钟收集菌体。然后于100mL BMMY液体培养基中重悬，30℃、200rpm振荡培养进行诱导，期间每隔12h加入500μL甲醇作为诱导物。诱导60h后，12000rpm离心10min收集发酵液上清。

[0043] 以上步骤中涉及的培养基配方(相应的固体培养基均加入20g/L琼脂粉)：

[0044] 1)BMGY液体培养基(1L)：酵母提取物10g、胰蛋白胨20g及甘油10mL，121℃灭菌15min后于无菌操作台上加入YNB 100mL及500×生物素2mL。

[0045] 2)BMMY液体培养基(1L)：酵母提取物10g及胰蛋白胨20g，121℃灭菌15min后于无菌操作台上加入YNB 100mL、500×生物素2mL及甲醇5mL。

[0046] (3)YPD液体培养基(1L)：酵母提取物10g、胰蛋白胨20g及葡萄糖20g。

[0047] (4)MD固体平板(1L)：琼脂糖20g及葡萄糖20g。

[0048] 其中，以100mL计，500×生物素含0.02g生物素。

[0049] 利用SDS‑PAGE电泳对发酵液上清中的瘤胃原虫Ostracodinium gracile木聚糖酶OGXyn1A重组蛋白进行鉴定。SDS‑PAGE结果表明，出现目标分子量大小的明显蛋白条带，几乎没有其他杂质条带，即通过毕赤酵母GS115重组菌株的分泌表达，可以非常容易的获得瘤胃原虫Ostracodinium gracile木聚糖酶OGXyn1A重组蛋白(图1)。

[0050] 3、木聚糖酶OGXyn1A重组蛋白(重组木聚糖酶OGXyn1A)的活性分析

[0051] 采用DNS法检测酶活力，具体步骤如下：在pH5.0、50℃条件下，包括900μL 1.0％的来源于榉木的木聚糖底物(即榉木木聚糖，购自Sigma公司)和100μL适当稀释发酵液上清的反应体系于水浴锅反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活力单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖(由木聚糖酶降解榉木木聚糖而生成)所需要的酶量。

[0052] 结果表明，重组木聚糖酶OGXyn1A的比活为206U/mg。根据测定的酶活力，重组木聚糖酶OGXyn1A的表达量可表示为52.2U/mL。

[0053] (二)反刍动物瘤胃原虫Ostracodinium gracile木聚糖酶OGXyn1A重组蛋白的性质测定

[0054] 2.1重组木聚糖酶OGXyn1A的最适pH和pH稳定性的测定

[0055] 重组木聚糖酶OGXyn1A在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH，具体步骤如下：来源于榉木的木聚糖底物用不同pH的缓冲液(包括0.1mol/L的甘氨酸‑盐酸缓冲液、0.2mol/L柠檬酸‑磷酸氢二钠缓冲液、0.1mol/L Tris‑盐酸缓冲液、0.1mol/L的甘氨酸‑氢氧化钠缓冲液)溶解，然后于50℃下进行酶活力测定。

[0056] 结果如图2所示，可知重组木聚糖酶OGXyn1A的最适pH为5.0，在pH4.5～8.0范围内有80％以上的相对酶活性。

[0057] 随后测定了该重组木聚糖酶OGXyn1A的pH稳定性，具体步骤如下：将使用不同pH缓冲液适当稀释的发酵液上清置于37℃处理60min，而后在pH5.0缓冲液体系、50℃下测定酶活力。

[0058] 结果如图3所示，可知该重组木聚糖酶OGXyn1A在pH 5.0～12.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性均在90％左右，说明重组木聚糖酶OGXyn1A也具有良好的耐碱性。

[0059] 2.2重组木聚糖酶OGXyn1A的最适温度及热稳定性测定

[0060] 测定最适温度的具体步骤如下：将适当稀释的发酵液上清置于pH5.0的柠檬酸‑磷酸氢二钠缓冲液底物缓冲液体系中，于不同温度下进行酶活力检测。

[0061] 热稳定性测定的具体步骤如下：发酵液上清在不同温度下处理不同时间，而后于50℃下进行酶活力测定。

[0062] 最适温度测定结果(图4)表明，重组木聚糖酶OGXyn1A最适温度为50℃。热稳定性测定结果表明(图5)，重组木聚糖酶OGXyn1A在40℃下温育1h，能保持80％以上的酶活性。

[0063] (三)反刍动物瘤胃原虫Ostracodinium gracile木聚糖酶OGXyn1A应用实例[0064] 以上获得的发酵液上清含有具有较高酶活性的木聚糖酶OGXyn1A重组蛋白，可以通过制成木聚糖酶OGXyn1A制剂，应用于饲料工业以提高畜禽生产性能、提升饲料利用率，以及降低饲料成本和提高经济效益。同时，由于耐受碱性能力，该酶不仅在饲料工业，也在造纸工业中具有较大应用潜力。