一种具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐及其制备方法

摘要

本发明公开了一种具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐，其分子式为H30[Tb7SbⅢ13SbⅤ2W3O32(C3NH7O)(H2O)6(SbW8O30)(SbW9O33)5]·30H2O(1‑Tb)，该晶体结构是通过五个三缺位的{B‑α‑SbW9O33}构筑块和一个四缺位的{B‑β‑SbW8O31}构筑块共同封装一个高核主族‑稀土异金属簇{Ln7SbⅢ13SbⅤ2W3O32(C3NH7O)(H2O)6}形成的六聚体锑钨酸盐，该化合物为零维纳米级孤立簇结构，尺寸约为1.7×1.8×2.6nm，在生理条件下具有很好的溶解性和稳定性。上述化合物对乳腺癌细胞(4T1细胞)的增殖具有很好的抑制效果，对正常细胞的影响较小且在生物体内中对脏器的毒副作用小。

权利要求

1.一种具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐，其特征在于：

Ⅲ Ⅴ

该锑钨氧酸盐的分子式为H30[Tb7Sb 13Sb 2W3O32(C3NH7O)(H2O)6(SbW8O30)(SbW9O33)5]·

30H2O；

该锑钨氧酸盐的结构特征为：通过五个三缺位的{B‑α‑SbW9O33}构筑块和一个四缺位的Ⅲ Ⅴ{B‑β‑SbW8O31}构筑块共同封装一个高核主族‑稀土异金属簇{Tb7Sb 13Sb 2W3O32(C3NH7O)(H2O)6}形成的六聚体锑钨氧酸盐，该锑钨氧酸盐的晶体结构为零维的孤立簇结构，尺寸为

1.7×1.8×2.6nm。

2.如权利要求1所述的一种具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐，其特征在于：该锑钨氧酸盐属于正交晶系，空间群为Pbca，对应空间群号为61。

3.如权利要求2所述的一种具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐，其特征在于：该锑钨氧酸盐的晶胞参数为： α＝β＝γ＝90°。

4.一种如权利要求1‑3任一所述的具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、三缺位锑钨酸盐前驱体Na9[B‑α‑SbW9O33]·19.5H2O的合成：称取40g二水合钨酸钠溶于80mL温度为80℃的去离子水中得到钨酸钠溶液；随后称取1.96g三氧化二锑溶解于

10mL浓盐酸中；将上述溶液逐滴加入到钨酸钠溶液中在95℃下回流1小时；最后将反应液浓缩至2/3体积，冷却至室温后得到白色晶体，过滤后用乙醇洗涤，自然干燥后得到20g白色颗粒状晶体；

S2、依次称取步骤S1制得的Na9[B‑α‑SbW9O33]·19.5H2O、硼酸、稀土盐到25mL聚四氟乙烯反应釜内，随后加入3mL去离子水和5mLDMF，搅拌十分钟后滴加200uL浓盐酸，并在常温下继续搅拌至1小时使原料混合均匀；将聚四氟乙烯反应釜置于恒温烘箱中进行水热反应；反应冷却至室温后，将晶体吸出，真空干燥后得到0.5‑2.0mm淡黄色长条状晶体；其中Na9[B‑α‑SbW9O33]·19.5H2O、硼酸、稀土盐的摩尔比为：2∶10∶3；稀土盐为六水合硝酸铽；水热反应温度为140℃；水热反应时间为3天。

5.一种如权利要求1所述的具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐的应用：具有抗肿瘤生Ⅲ Ⅴ物活性的主族‑稀土异金属簇嵌入的锑钨氧酸盐H30[Tb7Sb 13Sb 2W3O32(C3NH7O)(H2O)6(SbW8O30)(SbW9O33)5]·30H2O用于抑制乳腺癌4T1细胞，其IC50值为1.086μM。

说明书

一种具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及药物合成技术领域，具体的说是一种具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 癌症是世界范围内恶性程度最高的疾病之一，发病率和死亡率都很高。据世界卫生组织(http://www.who.int/cancer/en/)称，癌症是全球第二大死因，2018年估计有960万人死于癌症。每年癌症都夺去很多人的是生命，同时发病也逐渐向年轻人靠拢，因此，癌症的研究与治愈相当重要。随着学科交叉的发展，无机化学在医学中的应用已成为一个新兴的研究领域。在过去的几十年里，基于有机、无机或复合材料的纳米药物被积极开发用于临床前和临床癌症治疗。最突出的细胞毒性药物类别是顺铂(CDDP)，至今仍是临床应用最多的化疗药物之一。除CDDP外，其他一系列药物通过暂时缓解症状、延长患者寿命，在极少数情况下也显示了其抗癌潜力甚至治愈癌症。然而，它们都存在一些主要缺点：例如，由于缺乏选择性而产生严重的副作用，对某些癌症类型的效率低、生物利用度低等，因此，新的良性抗癌药物的探索和发现仍然存在巨大的挑战，亟需要寻找替代药物来选择性地使癌细胞丧失能力而不严重损害正常细胞。

[0003] 多金属氧酸盐(Polyoxometalates,POMs)简称多酸，通常是指由V、Nb、Ta、Mo和W等高价过渡金属的的无机氧酸盐经过缩聚脱水形成多核金属簇状结构，其结构类型丰富，尺寸与电荷具有可修饰性和可调变性，具有较强的电子和质子转移/存储能力，优异的氧化还原性能，且稳定性好。在过去的几十年的研究表明，多酸在生物医药方面具有潜在的应用前景，这是由于其作为无机药物具有诸多优点，例如多酸种类繁多，结构多样化，能识别和作用于生物大分子(如DNA和RNA)；价格廉价，容易合成，同时又具有抗病毒，抗肿瘤，抗细菌活性等，表现为诱发细胞凋亡，抑制ATP的产生。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐及其制备方法和应用，其能够高效抑制肿瘤细胞生长，同时对正常细胞和器官安全温和。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0006] 一种具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐，其中：

[0007] 该锑钨氧酸盐的分子式H30[Tb7SbⅢ13SbⅤ2W3O32(C3NH7O)(H2O)6(SbW8O30)(SbW9O33)5]·30H2O(1‑Tb)。

[0008] 该锑钨氧酸盐的结构特征为：通过五个三缺位的{B‑α‑SbW9O33}构筑块和一个四缺Ⅲ Ⅴ位的{B‑β‑SbW8O31}构筑块共同封装一个高核主族‑稀土异金属簇{Ln7Sb 13Sb 2W3O32(C3NH7O)(H2O)6}形成的六聚体锑钨酸盐，该晶体结构为零维孤立簇结构，尺寸约为1.7×
1.8×2.6nm。

[0009] 优选地，该锑钨氧酸盐属于正交晶系，空间群为Pbca，对应空间群号为61。

[0010] 优选地，该锑钨氧酸盐的晶胞参数为：α＝β＝γ＝90°。

[0011] 本发明同时提供了上述具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐的制备方法，包括以下步骤：

[0012] S1、三缺位锑钨酸盐前驱体Na9[B‑α‑SbW9O33]·19.5H2O的合成：称取40g二水合钨酸钠溶于80mL温度为80℃的去离子水中得到钨酸钠溶液；随后称取1.96g三氧化二锑溶解于10mL浓盐酸中；将上述溶液逐滴加入到钨酸钠溶液中在95℃下回流1小时；最后将反应液浓缩至2/3体积，冷却至室温后得到白色晶体，过滤后用乙醇洗涤，自然干燥后得到约20g白色颗粒状晶体；

[0013] S2、依次称取步骤S1制得的Na9[B‑α‑SbW9O33]·19.5H2O、硼酸、稀土硝酸盐到25mL聚四氟乙烯反应釜内，随后加入3mL去离子水和5mLDMF，搅拌十分钟后滴加200uL浓盐酸，并在常温下继续搅拌至1小时使原料混合均匀；将聚四氟乙烯反应釜置于恒温烘箱中进行水热反应；反应冷却至室温后，将晶体吸出，真空干燥后得到0.5‑2.0mm淡黄色长条状晶体；其中Na9[B‑α‑SbW9O33]·19.5H2O、硼酸、稀土硝酸盐的摩尔比为：2∶10∶3；稀土硝酸盐为Tb(NO3)3·6H2O；反应温度为140℃；反应时间为3天。

[0014] 上述具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐的应用于抗肿瘤药物领域，具有抗肿瘤生物活性的主族‑稀土异金属簇嵌入的锑钨氧酸盐1‑Tb对乳腺癌细胞(4T1细胞)的增殖具有很好的抑制效果，其IC50值为1.086μM，对正常细胞的影响较小，在生物体内中对脏器的毒副作用小。

[0015] 采用上述技术方案后，本发明具有如下有益效果：

[0016] 1)本发明所制备的锑钨氧酸盐在生理条件下具有很好的溶解性和稳定性，为探索纳米级抗肿瘤药物提供了重要保障。

[0017] 2)本发明所制备的锑钨氧酸盐1‑Tb对乳腺癌细胞(4T1细胞)的增殖具有很好的抑制效果，其IC50值为1.086μM，其抗肿瘤细胞毒性要优于绝大部分多酸基纳米药物；该化合物对正常细胞的影响较小且在生物体内中对脏器的毒副作用小，具有较高的安全性。

[0018] 3)本发明合成工艺简单，结晶度好且产率高。

附图说明

[0019] 图1为实施例2制备的具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐的晶体形貌图；

[0020] 图2为具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐的晶体结构图，其中图a为化合物中六聚Ⅲ体的锑钨氧酸盐的多面体‑球棍图，图b为化合物中嵌入的主族‑稀土异金属簇{Tb7Sb 13SbⅤ
2W3O32(C3NH7O)(H2O)6}的结构图；

[0021] 图3为实施例2制备的具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐的粉末衍射图；

[0022] 图4为实施例2制备的具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐的电喷雾电离质谱图(ESI‑MS)；

[0023] 图5为实施例2制备的具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐的红外光谱图；

[0024] 图6为实施例2制备的具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐、前驱体Na9[B‑α‑SbW9O33]·19.5H2O和硝酸铽对乳腺癌细胞(4T1)的细胞毒性测试；

[0025] 图7为实施例2制备的具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐对正常内皮细胞(EA.hy926)的细胞毒性测试；

[0026] 图8为用不同浓度实施例2制备的具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐的1‑Tb处理24小时的4T1细胞的形态变化；

[0027] 图9为实施例2制备的具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐对4T1细胞凋亡的AnnexinV‑FITC/PI分析；

[0028] 图10为实施例2制备的具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐的小鼠体内实验中肿瘤尺寸大小和体重变化图；

[0029] 图11为实施例2制备的具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐的肿瘤组织切片对照图；

[0030] 图12为实施例2制备的具有抗肿瘤生物活性的锑钨氧酸盐治疗后小鼠的心、肝、脾、肺、肾的组织切片图。

具体实施方式

[0031] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0032] 实施例1：前驱体Na9[B‑α‑SbW9O33]·19.5H2O的制备

[0033] 称取40g二水合钨酸钠溶于80mL温度为80℃的去离子水中得到钨酸钠溶液；随后称取1.96g三氧化二锑溶解于10mL浓盐酸中；将上述溶液逐滴加入到钨酸钠溶液中在95℃下回流1小时；最后将反应液浓缩至2/3，冷却至室温后得到白色晶体，过滤后用乙醇洗涤，自然干燥后得到约20g白色颗粒状晶体。

[0034] 实施例2：化合物H30[Tb7SbⅢ13SbⅤ2W3O32(C3NH7O)(H2O)6(SbW8O30)(SbW9O33)5]·30H2O的制备

[0035] 依次称取三缺位锑钨酸盐前驱体Na9[B‑α‑SbW9O33]·19.5H2O(0.17mmol,0.480g)、硼酸(0.82mmol,0.050g)、六水合硝酸铽(0.27mmol,0.120g)到25mL聚四氟乙烯反应釜内，随后加入3mL去离子水和5mLDMF，搅拌十分钟后滴加200uLHCl，并在常温下继续搅拌至1小时使原料混合均匀；将反应釜内衬装入不锈钢反应釜中，置于140℃烘箱内反应3天。反应釜取出后放置在室内自然冷却至室温，将晶体吸出，真空干燥后得到0.5‑2.0mm淡黄色长条状晶体(见图1)。

[0036] 实施例3：化合物H30[Ln7SbⅢ13SbⅤ2W3O32(C3NH7O)(H2O)6(SbW8O30)(SbW9O33)5]·30H2O(Ln＝Gd,Eu,Dy,Ho,Er)的制备

[0037] 依次称取三缺位锑钨酸盐前驱体Na9[B‑α‑SbW9O33]·19.5H2O(0.17mmol,0.480g)、硼酸(0.82mmol,0.050g)、六水合硝酸盐(0.27mmol)到25mL聚四氟乙烯反应釜内，随后加入3mL去离子水和5mLDMF，搅拌十分钟后滴加200uLHCl，并在常温下继续搅拌至1小时使原料混合均匀；将反应釜内衬装入不锈钢反应釜中，置于140℃烘箱内反应3天。反应釜取出后放置在室内自然冷却至室温，将晶体吸出，真空干燥后得到条状晶体。

[0038] 本实施例的六水合硝酸盐包括六水合硝酸钆、六水合硝酸铕、六水合硝酸镝、六水合硝酸钬和六水合硝酸铒，该实施例中的化合物与实施例2的1‑Tb属于同构的化合物。

[0039] 针对实施例2制得的锑钨氧酸盐化合物的基本表征：

[0040] 1)晶体结构测定

[0041] 在显微镜下挑选大小合适、形状规则且透亮的单晶，通过Bruker APEX II CCD衍射仪，在175(2)K下，采用石墨单色器单色化的Mo‑Kα射线 作为入射光源以收集晶体衍射数据。在结构解析中使用Shelextl‑2018程序以直接法对晶体结构进行解析和精修，同时非氢原子及其各向异性化处理参数利用全矩阵最小二乘法进行修正，所有的氢原子通过理论加氢得到，所得晶体结构图见图2所示。部分晶体学数据以及精修参数见表1：

[0042] 表1：化合物的晶体参数表

[0043]

[0044]

[0045] (2)粉末衍射表征：

[0046] 取适量上述方法所制备的晶体，将其充分研磨成粉末，通过常温下测得的粉末衍射图(见图3)与根据单晶衍射数据模拟的衍射峰的对比可知，实验测定结果与Mercury软件拟合结果吻合的较好，由此可说明该化合物为纯相。其中晶体的各向异性导致了部分衍射峰在峰强上有所差异。

[0047] (3)稳定性测试：

[0048] 通过电喷雾电离质谱分析(ESI‑MS)研究化合物1‑Tb在水溶液中的稳定性，在ESI‑MS光谱(见图4)中观察到了对应于不同负电荷(9‑、8‑、7‑、6‑、5‑)的五组峰，其中具有较大m/z值的五个物种是在m/z为1957.12,2208.75,2530.86,2973.02,3597.63处检测到的，该数值与模拟的m/z值一致，这表明该结构在水溶液中具有很好的稳定性。此外，通过傅立叶变换红外光谱进一步证实了1‑Tb在水、PBS和细胞培养基中的稳定性。如图5所示，在上述溶液中孵育24小时后，光谱中未观察到特征簇信号的明显变化，表明1‑Tb在生理条件下具有高稳定性。

[0049] 1)抗肿瘤活性测试流程：

[0050] 细胞培养：小鼠乳腺癌(4T1)细胞购自中国科学院；4T1细胞存放在含有10％FBS的RPMI‑1640培养基中，EA.hy926细胞存放在含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)和1％青霉素‑链霉素溶液的DMEM培养基中；所有细胞均在37℃、5％CO2加湿培养箱中培养。

[0051] 体外细胞毒性测定：1‑Tb和两种原材料(Tb(NO3)3·6H2O、Na9[B‑α‑SbW9O33]·19.5H2O)对4T1和EA.hy926细胞在内的一组肿瘤细胞的细胞毒性通过CellKit‑8(CCK8)检
3
测，而EA.hy926细胞用作非肿瘤细胞对照。将细胞以6×10个细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，用不同浓度的1‑Tb处理24小时，然后用100μL/孔的10％CCK8溶液孵育。在37℃下额外孵育0.5‑4小时后。使用酶标仪在450nm处测量吸光度。使用GraphPad Prism8软件通过概率分析计算IC50(半数最大抑制浓度)值。与对照组比较绘制1‑Tb处理的细胞活力曲线。
使用以下等式计算细胞活力：细胞活力(％)＝OD处理/OD控制×100％。

[0052] 核形态：将4T1细胞以5×105个细胞/孔的密度接种在BeyoGoldTM35mm玻璃基共聚焦培养皿上，并使其生长24小时。然后，在37℃下用1‑Tb(分别为0、10、20μM)处理细胞24小时。随后，PBS洗细胞1次，Hoechst33342室温染色15min，PBS洗2次，荧光显微镜下观察细胞核形态，放大60倍拍照。

[0053] 细胞凋亡的流式细胞术分析：对于细胞凋亡检测，4T1细胞分别用1‑Tb在20、10、5、2.5和0μM下处理24小时。使用Annexin‑V‑FITC/PI凋亡检测试剂盒测定凋亡细胞。收集新鲜细胞并重悬于500μL结合缓冲液中，用5μL Annexin‑V‑FITC和5μL碘化丙啶染色。最后，使用TM
BD Accuri  C6 Plus 流式细胞仪分析样品。

[0054] 体内实验：将4T1细胞(1.75×106)皮下注射到雌性Balb/c小鼠右背部(6‑8周)，等3
待肿瘤达到70mm左右。将小鼠分为两组(每组5只小鼠)进行各种治疗。一组小鼠皮下注射
100μL1‑Tb(溶于盐水)，剂量为50mg/kg，基于小鼠体重两天一次，共21天。另一组小鼠皮下注射100μL生理盐水作为参考个体。每两天监测每只小鼠的体重和肿瘤大小，共8次。肿瘤体
2
积计算为宽度×长度/2。从图在第30天处死小鼠并收集器官(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏)用于苏木精‑伊红(H&E)染色分析。

[0055] (2)抗肿瘤活性测试结果分析：

[0056] 为了测试1‑Tb对乳腺癌(4T1)细胞系的抗肿瘤活性，我们将细胞与不同浓度的1‑Tb孵育24小时后测定其细胞毒性。为了进行比较，我们同时测定了1‑Tb对正常内皮细胞系EA.hy926的细胞毒性，以评估其对肿瘤细胞系的特异性。1‑Tb以剂量依赖性方式抑制所有癌细胞的增殖。在高浓度下，乳腺癌细胞的活力被抑制到9.7％。1‑Tb的相应IC50值(50％生长抑制的浓度)为1.086μM，表明1‑Tb可能对乳腺癌细胞有显著的抑制效果。为了进一步了解1‑Tb的抗肿瘤机制，还在4T1细胞中测试了原材料的细胞毒性(见图6)。Na9[B‑α‑SbW9O33]·19.5H2O在4T1细胞中表现出中等的细胞毒性，IC50值为22.37μM，而Tb(NO3)3·6H2O即使在高浓度下也没有表现出细胞毒性(见表2)。该结果表明1‑Tb的抗肿瘤效果是Na9[B‑α‑SbW9O33]·19.5H2O的20倍，进一步说明1‑Tb的簇结构也有助于细胞毒性。此外，1‑Tb对内皮细胞系EA.hy926无毒(见图7)，表明1‑Tb对肿瘤细胞的特异性超过健康细胞，并且1‑Tb在循环系统中的运输具有一定的安全性。

[0057] 表2：细胞毒性测试结果

[0058]

[0059] 为了揭示化合物1‑Tb抑制肿瘤细胞活力的潜在机制，我们使用核酸染色剂Hoechst 33342研究了1‑Tb处理后4T1细胞核的形态变化，以可视化核碎片和染色质凝聚形成细胞凋亡。为此，4T1细胞用不同浓度的1‑Tb处理24小时，然后用Hoechst 33342染色，随后通过共聚焦激光扫描显微镜检测。与未处理的细胞相比，1‑Tb处理的细胞显示出以细胞核碎裂为代表的细胞核变形和一些由于核凝聚引起的亮蓝色荧光块，表明1‑Tb触发了细胞凋亡(见图8)。这促使我们进行Annexin V‑FITC/PI分析，以通过流式细胞术分析定量研究1‑Tb引起的肿瘤细胞的凋亡和坏死。如图9所示。与未处理的对照相比，1‑Tb剂量依赖性地增加了24小时处理后早期和晚期凋亡细胞的比例。此外，随着药物浓度的增加，细胞比例由早期凋亡变为晚期凋亡，并伴有部分细胞坏死。总之，结果表明1‑Tb通过结合细胞凋亡和坏死的复杂机制抑制肿瘤生长。

[0060] 随后我们使用皮下肿瘤移植小鼠模型在体内进一步研究了1‑Tb的抗肿瘤作用。将3
鼠乳腺癌细胞4T1皮下植入雌性Balb/c小鼠的右侧。肿瘤体积达到50‑200mm 后，将小鼠随机分为三组，每隔一天分别用生理盐水和50mg/kg1‑Tb给药。每两天监测一次肿瘤体积和体重(见图10)。结果表明，用1‑Tb给药显着抑制了肿瘤生长。第21天，小鼠麻醉后切除肿瘤组织并称重。观察到用1‑Tb治疗的小鼠的平均肿瘤重量为0.952g，而对照组显示平均重量为
1.492g。此外，体重的非明显变化(平均体重范围从18.43到20.62克)证明了1‑Tb的副作用是可以忍受的(见图10c)。肿瘤组织的苏木精和伊红(H&E)染色的组织病理学切片显示，1‑Tb治疗的肿瘤组织中存在炎性病变和局部坏死，而对照组的肿瘤组织中则存在大量的组织损伤(见图11)。值得注意的是，组织病理学切片显示未治疗的肿瘤移植小鼠的肺组织中有明显的转移细胞(见图12)。相反，在1‑Tb治疗组中观察到相对清晰的肺组织，表明1‑Tb具有有效的抗转移作用。组织病理学分析还表明，1‑Tb未对其他器官(心脏、肝脏、脾脏和肾脏)造成明显损害(见图12)。

[0061] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。