甘薯ERF转录因子IbERF4在促进植物绿原酸类物质合成中的用途

摘要

本发明公开了甘薯ERF转录因子IbERF4在促进植物绿原酸类物质合成中的用途，从甘薯中分离出编码ERF转录因子基因的完整cDNA，连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得的转基因植株，对转基因植株进行了抗逆性分析，结果表明IbERF4蛋白通过与绿原酸合成途径中4‑羟基桂皮酰辅酶A连接酶基因启动子结合激活其表达，IbERF4基因过表达转基因植株中4‑羟基桂皮酰辅酶A连接酶基因的表达水平上调，能够促进植物绿原酸类物质的合成，对于提高植物体内绿原酸类物质含量具有十分重要的意义。

权利要求

1.甘薯ERF转录因子IbERF4在促进甘薯绿原酸类物质合成中的用途，其特征在于，甘薯ERF转录因子IbERF4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，IbERF4基因过表达转基因植株中4‑羟基桂皮酰辅酶A连接酶基因的表达水平上调。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，IbERF4蛋白通过与绿原酸合成途径中4‑羟基桂皮酰辅酶A连接酶基因启动子结合激活其表达。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述绿原酸类物质包括绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B或异绿原酸C。

5.根据权利要求1所述的用途，含有权利要求1中所述IbERF4基因的过表达载体为pCAMBIA1305‑2×35s‑IbERF4。

6.一种提高植物体内绿原酸含量的方法，其特征在于，将权利要求1中所述的IbERF4基因导入目的植物，得到转基因植物，所述转基因植物中的绿原酸类物质含量高于目的植物，所述目的植物为甘薯。

7.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为如下（1）和/或（2）：（1）通过增加目的植物中IbERF4蛋白的活性，获得绿原酸类物质含量高于目的植物的植株；

（2）通过促进目的植物中IbERF4基因的表达，获得绿原酸类物质含量高于目的植物的植株；所述目的植物为甘薯。

说明书

甘薯ERF转录因子IbERF4在促进植物绿原酸类物质合成中的

用途

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及甘薯ERF转录因子IbERF4在促进植物绿原酸类物质合成中的一个新用途。

背景技术

[0002] 转录因子是能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合，从而调控目的基因表达的蛋白质分子。AP2/ERF是植物中广泛存在的一类转录因子超家族，该家族蛋白含有AP2/ERF结构域，与植物的生长发育及逆境胁迫响应密切相关。IbERF4是一个从甘薯中分离出来的AP2/ERF家族转录因子，该基因受盐、干旱胁迫诱导表达。研究表明，在拟南芥中过量表达IbERF4明显削弱了转基因植株的耐盐性和耐旱性，在甘薯中过量表达IbERF4则会削弱转基因甘薯植株的耐盐性。本发明的发明人在公开号为CN104862320A的专利申请中已经报道了其负责调控植物耐逆与促进植物衰老的功能，然而，有关IbERF4在甘薯生长发育过程中的作用仍不清楚，随着研究的深入，本发明将继续探索其在甘薯生长发育过程中的作用。

[0003] 绿原酸(Chlorogenic acid, CGA)是植物苯丙素类次生代谢产物之一，狭义上是指由咖啡酸（Caffe  acid）与奎宁酸（Quinic  acid）组成的咖啡单宁酸（5‑O‑Caffeoylquinic acid）。实际上，绿原酸在植物中通常是以几种异构体共存的形式存在。因此，广义上绿原酸代表由奎尼酸与反式肉桂酸（trans‑Cinnamic acids）缩合而成的酯类化合物家族。目前，已报道的绿原酸合成途径在不同植物间存在一定差异，但基本包括苯丙氨酸解氨酶(L‑phenylalaninammonia‑lyase,PAL)、肉桂酰‑4‑羟化酶(Cinnamate‑4‑hydroxylase,C4H)、4‑羟基桂皮酰辅酶A连接酶(4‑coumaroyl‑CoA‑ligase,4CL)。近年已发现绿原酸具抗氧化、抗高血压、抗菌、抗肿瘤、抗辐射、降血糖、降血脂、抗炎、补肾、保肝等多种药理作用。除了药用外，绿原酸还可用于食品工业作食品和果品的保鲜剂。

[0004] 以甘薯为代表的薯类作物，单位面积的生物能产量高于其它栽培作物，且具有耐瘠耐旱、适应性广、块根（茎）淀粉率高等特点，是世界上重要的粮食、饲料和工业原料作物。相比常见主粮作物，甘薯不仅含有丰富的蛋白质、糖类、维生素和矿物质，同时也因含有大量功能性成分而具有重要的药用价值，如绿原酸等。甘薯一方面可以作为日常生活快速便捷摄取绿原酸的来源，另一方面也因其巨大的生物量可用来开发高附加值的产品。因此，分析、挖掘和利用绿原酸合成调控相关基因将有助于提高植物绿原酸类物质的合成及其营养价值，促进植物绿原酸次生代谢工程的应用。

[0005] 在前期的研究过程中，发明人已经找到了一些甘薯绿原酸合成途径关键酶基因，如公开号为CN111690672A的“甘薯绿原酸合成途径关键酶基因IbPAL2及应用”以及公开号为CN111690670A的“甘薯绿原酸合成途径关键酶基因IbHCT1及应用”，研究发现，对于控制同一性状的基因可能不止一个，继续寻找与绿原酸合成相关的基因，对甘薯生长发育研究具有重要的意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种甘薯ERF转录因子IbERF4的一个新用途，该转录因子能够促进植物绿原酸类物质合成。

[0007] 还提供一种提高植物绿原酸含量的方法，通过转基因技术将IbERF4基因克隆到植物体内，获得转基因植株，该转基因植株绿原酸类物质含量提高。

[0008] 为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：

[0009] 甘薯ERF转录因子IbERF4在促进植物绿原酸类物质合成中的用途，所述ERF转录因子IbERF4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示，其编码蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

[0010] 其中，IbERF4蛋白通过与绿原酸合成途径中4‑羟基桂皮酰辅酶A连接酶（4‑coumarate:coenzyme A ligase, 4CL）基因启动子结合激活其表达；IbERF4基因过表达转基因植株中4‑羟基桂皮酰辅酶A连接酶基因的表达水平上调。

[0011] 所述绿原酸类物质包括绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B或异绿原酸C。

[0012] 含有ERF转录因子IbERF4的过表达载体pCAMBIA1305‑2×35s‑IbERF4同样具有促进植物绿原酸类物质合成的作用。

[0013] 为了提高植物的优良性状，本发明还公开了一种提高植物体内绿原酸含量的方法，将所述的IbERF4基因导入目的植物，得到转基因植物，所述转基因植物中的绿原酸类物质含量高于目的植物。

[0014] 具体地，IbERF4基因具体可通过所述过表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述过表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

[0015] 另外，也公开了一种植物育种方法，所述方法为如下（1）和/或（2）：

[0016] （1）通过增加目的植物中IbERF4蛋白的活性，获得绿原酸类物质含量高于目的植物的植株;

[0017] （2）通过促进目的植物中IbERF4基因的表达，获得绿原酸类物质含量高于目的植物的植株。

[0018] 其中，促进目的植物中IbERF4基因的表达的实现方式包括将IbERF4基因导入目的植物或引入强启动子和/或增强子。

[0019] 本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作即可，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。

[0020] 作为一种实施方式，所述的“植物”包括但不限于：甘薯，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。尤其适用于需要提高绿原酸类物质含量的植物，在实际的应用过程中，对于需要提高绿原酸类物质含量的植物，均可以通过转基因的方式培育转入该基因的株系。

[0021] 本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。

[0022] 本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。

[0023] 本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

[0024] 本发明的优点：

[0025] 本发明找到了一个甘薯ERF转录因子IbERF4的新用途，从甘薯中分离出编码ERF转录因子基因的完整cDNA，连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得的转基因植株，对转基因植株进行了抗逆性分析，结果表明IbERF4蛋白通过与绿原酸合成途径中4‑羟基桂皮酰辅酶A连接酶基因启动子结合激活其表达，IbERF4基因过表达转基因植株中
4‑羟基桂皮酰辅酶A连接酶基因的表达水平上调，能够促进植物绿原酸类物质的合成，对于提高植物体内绿原酸类物质含量具有十分重要的意义。

[0026] 对于一些需要提高植物体内绿原酸类物质含量的植物，可以通过导入该基因的方式培育一些新品种，对于植物育种具有重大的应用价值。

附图说明

[0027] 图1是IbERF4过表达转基因代表家系IbERF4表达水平；

[0028] 图2是IbERF4过表达转基因代表家系绿原酸类物质含量；

[0029] 图3是IbERF4过表达转基因代表家系4CL表达水平；

[0030] 图4是IbERF4与4CL启动子结合。

具体实施方式

[0031] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。

[0032] 若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。

[0033] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0034] 实施例1 IbERF4过表达转基因甘薯的获得及功能

[0035] 1. IbERF4过表达转基因甘薯的获得

[0036] 利用液氮冻融法将构建的过表达载体pCAMBIA1305‑2×35s‑IbERF4（江苏省农业科学院）转入农杆菌EHA105。将阳性克隆接种到50 mLYEP (含100 μg/mL Rif、100 μg/mL Kan)液体培养基中，28℃、180 rpm继续培养至OD600至0.6~0.8。4000 rpm离心10 min，弃培养基，收集菌体。用MS1D液体培养基（4.4 g/l MS+0.4 mg/l VB1+30 g/l sucrose+肌醇0.1 g/l +1 mg/l 2,4D）+0.1% As 将菌体稀释至OD600 0.3~0.5，制备成甘薯转化侵染液。将甘薯愈伤浸入其中20 min，期间遮光置于摇床缓慢摇晃。超声波超声10 sec后，倒掉侵染液，用消毒滤纸吸干愈伤表面水分，将干燥的已侵染愈伤转入MS1D（含0.1% As）培养基上共培2 3d（黑暗）。用无菌水洗净愈伤表面农杆菌，将愈伤转移至筛选培养基上(MS1D+10 ~mg/L潮霉素+400 mg/L cefotaxime)，暗培4‑6周后转移至再生培养基。将潮霉素筛选后的愈伤转移至再生培养基MSCH (4.4 g/L MS+10 mg/L 潮霉素+200mg/L cefotaxime)，待分化成苗后将苗转移至生根培养基SBMC (4.4 g/L MS+200 mg/L cefotaxime+0.3 mg/L VB1)。

[0037] 将分化成苗的转基因苗移栽至盆钵，成活后（约7 14d）提取叶片DNA进行PCR鉴定，~1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。对经PCR检测为阳性的转基因植株进一步取样，提取RNA进行Real‑time PCR定量分析，以验证IbERF4过表达效应（图1）。

[0038]  IbERF4基因的功能验证

[0039] 以转基因受体徐薯29号（由中国农业科学院甘薯研究所徐州市农业科学院选育）及其转化过表达空载体植株（EV）为对照，取实施例1获得的IbERF4过表达转基因植株和对照植株相同部位叶片进行绿原酸含量测定，每植株设3次重复。具体操作步骤如下：准确称取烘干后的甘薯叶0.2g于100mL具塞锥形瓶中，加50%甲醇20mL浸泡24h，超声0.5h后过滤、洗涤。重复操作2次，合并滤液，用50%甲醇定容于50mL容量瓶中，稀释10倍后待测。

[0040] 绿原酸标准曲线绘制：准确称取绿原酸和异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C标准品（购自北京索莱宝科技有限公司）各5.0mg，用50%甲醇溶液在超声条件下使其完全溶解，并定容至25mL，得到浓度各为0.2mg/mL的混合标准品溶液。分别取0.5、1.0、1.5、2.0和2.5mL标准品溶液置于25mL棕色容量瓶中，用50%甲醇溶液定容。在吸收光波长为326 nm的高效液相色谱仪中测定吸光度，以浓度为x坐标，吸光度为y坐标绘制。

[0041] 结果表明（图2），IbERF4过表达转基因植株中绿原酸类物质含量明显高于对照（X29和EV），包括绿原酸、异绿原酸A（ICGA‑A）、异绿原酸B（ICGA‑B）和异绿原酸C（ICGA‑C）。

[0042] 实施例2 IbERF4过表达转基因植株中4CL表达水平检测

[0043] 为了更进一步从分子水平上说明IbERF4基因在促进植物绿原酸类物质合成中的用途，继续进行了如下实验：

[0044] 以转基因受体徐薯29号（由中国农业科学院甘薯研究所徐州市农业科学院选育）为对照，取实施例1获得的IbERF4过表达转基因植株和对照植株相同部位叶片，液氮速冻后置于‑80 °C冰箱备用。取一部分样品用于转录组测序分析，结果表明苯丙氨酸代谢途径中4CL基因在IbERF4过表达转基因植株中的表达水平明显上调。另一部分样品用于对转录组测序结果进行验证，具体为：使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒（北京天根）提取总RNA后，用NanoDrop 2000紫外‑可见分光光度计（Thermo Fisher USA）检测RNA浓度及质量，1%琼脂糖电泳检测RNA完整性。取1 μg RNA作为模板，使用PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （Takara）反转录合成第一链cDNA，‑20 °C保存。将反转录合成的cDNA稀释5倍后作为模板，利用SYBR premix Ex TaqTM (TaKaRa公司)试剂盒，在ABI StepOnePlus上扩增进行qRT‑PCR反应。扩增程序为: 95 °C 60 s 预变性；95 °C 15 s，60 °C 15 s，72 °C 45 s，40个循环；95 °C 15 s，60 °C 1 min。IbTublin基因（F：
CAACTACCAGCCACCAACTGT，R：CAAGATCCTCACGAGCTTCAC）的表达量作为内参，计算出4CL基因（F：GGCGACTCATTTGATGGCTT，R：AATTGCCATCTCCTGACCCA）的相对表达量。样本和内参分别设3次重复。

[0045] 结果表明（图3），IbERF4过表达转基因家系中4CL表达水平明显上调。

[0046] 实施例3 IbERF4蛋白与4CL启动子区DRE元件互作

[0047] 1.甘薯IbERF4基因与载体pB42AD（南京农业大学）的连接

[0048] 以实施例1得到的pCAMBIA1305‑2×35s‑IbERF4质粒为模板，采用引物

[0049] ERF4AD‑F：TGCCTCTCCCGAATTCATGGCGGTGAAGGGCAGA

[0050] ERF4AD‑R：CGAGTCGGCCGAATTCAGCTTCCGTGGGTGGAGC

[0051] 在IbERF4前后引入含酶切位点EcoR I的重组序列，利用TAKARA公司KOD Plus Neo聚合酶进行扩增，具体步骤如下：

[0052] Plasmid DNA                        1 μL

[0053] 10 pmol ERF4AD‑F                   1.5 μL

[0054] 10 pmol ERF4AD‑R                   1.5 μL

[0055] 2mM dNTPs                          5 μL

[0056] 25 mM MgSO4                        3 μL

[0057] KOD Plus Neo (1.0 U/μl)            1 μL

[0058] 10×PCR Buffer for KOD Plus Neo    5 μL

[0059] ddH2O                             Up to 50 μL

[0060] 反应条件如下：94℃，2min；98℃，10sec；58℃，30sec；68℃，lmin；68℃，10min；34个循环。使用OMEGA DNA纯化试剂盒将PCR扩增产物纯化。使用限制性内切酶EcoR I将载体pB42AD酶切后，将纯化后的PCR产物与质粒的酶切产物相连接(50 °C 15 min)，连接体系如下：

[0061] pB42AD酶切后空载体片段           2 μL

[0062] IbERF4加酶切位点PCR产物片段      1 μL

[0063] 5×In‑fusion HD Enzyme Premix    1 μL

[0064] ddH2O                            up to 5 μL

[0065] 连接产物转化E‑Coli.Trans1‑T1（北京全式金生物），涂布于含100mg/ml浓度卡纳霉素抗性的LB平板上。37℃培养，12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带，最后送生工生物工程（上海）测序公司测序，结果表明载体IbERF4‑pB42AD构建正确。

[0066] 2.甘薯4CL基因启动子区（p4CL）与载体pLacZi（南京农业大学）的连接

[0067] 利用EasyPure® Plant Genomic DNA Kit (含RNase A）（全式金生物技术有限公司）提取甘薯叶片中DNA，具体操作步骤参考试剂盒说明书。以提取获得的甘薯叶片DNA为模板，采用引物

[0068] p4CLlaczi‑F：ATCTGTCGACCTCGAGCCGTTATACACCGTCCCTGT

[0069] p4CLlaczi‑R：GAGCACATGCCTCGAGACGAACGTTTCGGACACATAA

[0070] 在4CL前后引入含酶切位点Xho I的重组序列，利用TAKARA公司KOD Plus Neo聚合酶进行扩增，具体步骤同1.1。使用OMEGA DNA纯化试剂盒将PCR扩增产物纯化。使用限制性内切酶Xho I将载体pLacZi酶切后，将纯化后的PCR产物与质粒的酶切产物相连接(50 °C 10 min)，连接体系如下：

[0071] pLacZi酶切后空载体片段            2 μL

[0072] p4CL加酶切位点PCR产物片段       1 μL

[0073] 5×In‑fusion HD Enzyme Premix     1 μL

[0074] ddH2O                          up to 5 μL

[0075] 连接产物转化E‑Coli.Trans1‑T1（北京全式金生物），涂布于含100mg/ml浓度卡纳霉素抗性的LB平板上。37℃培养，12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带，最后送生工生物工程（上海）测序公司测序，结果表明载体p4CL‑pLacZi构建正确。

[0076] 3.载体共转化

[0077] 利用EGY48感受态细胞（上海唯地生物技术有限公司）进行载体共转化，具体操作步骤参考说明书。将转化后的菌液涂于SD‑Trp‑Ura培养基上，30℃培养3 d后，将每个板的酵母单克隆划线于SD‑Trp‑Ura/Gal/Raf+X‑gal上，30℃培养3 d后，观察划线酵母状态。

[0078] 结果表明（图4），IbERF4能够直接与4CL启动子结合，从而直接调节其表达水平。

[0079] 以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。