一种新型冠状病毒mRNA疫苗及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了新型冠状病毒mRNA疫苗及其制备方法和用途。本发明的新型冠状病毒mRNA疫苗可以诱导强烈的新型冠状病毒特异性的体液和/或T细胞免疫应答，并可以诱导产生可广泛中和多种变异毒株的中和抗体。本发明提供的新型冠状病毒mRNA疫苗递送载体具有良好的稳定性、递送效率高、安全有效质量可控。

权利要求

1.一种mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗包含：

至少一个信使核糖核酸mRNA，所述mRNA编码至少一种抗原肽或结构蛋白，所述抗原肽或结构蛋白包括SARS‑CoV‑2冠状病毒的刺突蛋白的衍生蛋白，所述刺突蛋白的衍生蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:7所示，所述mRNA疫苗还包含脂质纳米颗粒，所述mRNA包封于所述脂质纳米颗粒中，所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质和聚乙二醇‑脂质，所述阳离子脂质的结构为：ALC‑0315：。

2.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述刺突蛋白的衍生蛋白还包括将SEQ ID NO:4‑7的第1‑13位替换为其他强信号肽，或在N端增加其他强信号肽；

所述其他强信号肽包括组织型纤溶酶原激活剂的信号肽和血清免疫球蛋白E的信号肽。

3.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述刺突蛋白的衍生蛋白还包括在N端或C端增加用于形成多聚体的片段，所述片段包括Fc片段或噬菌体T4纤维蛋白的三聚化基序。

4.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA序列是天然或修饰的RNA，所述修饰的RNA包括通过用修饰的尿苷部分或全部取代天然尿苷对RNA进行修饰。

5.根据权利要求4所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA序列是修饰的RNA，所述修饰的RNA为通过用1‑甲基‑假尿苷对天然尿苷进行全部替换。

6.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述聚乙二醇‑脂质选自：2‑[(聚乙二醇)‑2000]‑N,N‑二十四烷基乙酰胺、1,2‑二肉豆蔻酰基‑sn‑甘油甲氧基聚乙二醇、1,2‑二硬脂酰基‑sn‑甘油基‑3‑磷酸乙醇胺‑N‑[氨基(聚乙二醇)]、PEG‑二甾醇基甘油、PEG‑二棕榈油基、PEG‑二油基、PEG‑二硬脂基、PEG‑二酰基甘油酰胺、PEG‑二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、PEG‑1,2‑二肉豆蔻酰基氧基丙基‑3‑胺或DMG‑PEG2000中的一种或多种组合。

7.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述的中性磷脂选自：1,2‑二硬脂酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱、1,2‑二棕榈酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱、1,2‑二油酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1,2‑二棕榈酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1,2‑二肉豆蔻酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、

2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸‑(1'‑rac‑甘油)、油酰磷脂酰胆碱、1‑棕榈酰基‑2‑油酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种组合。

8.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述的甾族脂质选自燕麦甾醇、β‑谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇以及经多肽修饰后的胆固醇；羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸中的一种或多种组合。

9.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述聚乙二醇‑脂质为DMG‑PEG2000；

所述中性磷脂为DSPC；所述的甾族脂质为胆固醇。

10.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述的阳离子脂质在脂质组分中的摩尔百分含量为20 60%、中性磷脂在脂质组分中的摩尔百分含量为5% 25%、甾族脂质在脂~ ~质组分中的摩尔百分含量为25% 55%；聚乙二醇‑脂质在脂质组分中的摩尔百分含量为0.1%~

15%。

~

11.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，脂质纳米颗粒中总脂质与mRNA的质量比在10‑30：1之间。

12.根据权利要求10所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述阳离子脂质：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇‑脂质摩尔比为30‑60:5‑20:20‑50:0.1‑10。

13.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗中还包含其他辅料，所述其他辅料包括醋酸钠、氨丁三醇、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸氢二钠、蔗糖中的一种或多种组合。

14.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述脂质纳米颗粒的平均粒径为50~

200nm；或所述脂质纳米颗粒在中性pH下具有净中性电荷；或所述脂质纳米颗粒具有小于

0.4的多分散性。

15.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述抗原肽或结构蛋白还包括包膜蛋白，膜蛋白或核衣壳蛋白，或其免疫原性片段或免疫原性变体。

16.根据权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗为液体制剂或冻干粉剂。

17.根据权利要求16所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗为口服制剂、肌肉注射制剂、静脉注射制剂或吸入制剂。

18.根据权利要求17所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗为雾化吸入剂或干粉吸入剂。

19.根据权利要求1‑18任一所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA的序列如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或者SEQ ID NO:13所示。

20.一种权利要求1所述的mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，将阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质、聚乙二醇‑脂质溶解至溶剂后与mRNA混合后制得。

21.根据权利要求20所述的mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，脂质纳米颗粒包封mRNA时的N/P为2‑10。

22.根据权利要求21所述的mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，将阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质、聚乙二醇‑脂质溶解至乙醇后与经稀释后的mRNA稀释液混合后经超滤、稀释、过滤后制得。

23.根据权利要求22所述的mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，稀释液可为乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或tris缓冲液。

24.根据权利要求23所述的mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述缓冲液pH为3 6，浓~度为6.25 200mM。

~

25.一种权利要求1‑19任一项所述的mRNA疫苗在制备用于预防新型冠状病毒感染的药物中的应用。

26.根据权利要求25所述的应用，其特征在于，所述的新型冠状病毒为原型株、Beta变异株、Delta变异株或Omicron变异株。

说明书

一种新型冠状病毒mRNA疫苗及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及疫苗研制技术领域，具体涉及一种编码新型冠状病毒S蛋白的mRNA在预防新型冠状病毒感染方面的应用。

背景技术

[0002] 新型冠状病毒肺炎（COVID‑19）是新型冠状病毒（SARS‑CoV‑2）感染导致的肺炎。2020年2月11日世界卫生组织宣布，将新型冠状病毒感染的肺炎正式命名为“COVID‑19”
(Coronavirus Disease)；同日，国际病毒分类委员会将引起该疾病的病毒正式命名为
“SARS‑CoV‑2”（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2）。2020年3月11日世界卫生组织宣布，根据评估COVID‑19可被称为全球大流行病（pandemic），成为第一个由冠状病毒引起的全球大流行病。鉴于此，接种有效的预防性疫苗仍是防控新型冠状病毒感染
的根本措施之一。

[0003] 已商品化的新型冠状病毒mRNA疫苗的mRNA编码序列都是基于原型株的全长S蛋白，位置986和987处由脯氨酸替代。但是此设计的mRNA疫苗诱导产生的抗体对于一些流行
变异株的中和活性有较大程度降低，如对Beta变异株的中和抗体滴度降低10倍以上，对
Omicron变异株的中和抗体滴度降低20‑50倍。

发明内容

[0004] 本发明的mRNA疫苗的mRNA编码序列保留了位置986和987处的脯氨酸替代，增加了K417N、E484K或E484A、N501Y突变，这3个突变是Beta变异株在受体结合区（RBD）上的突变，并在其他的重要变异株中反复出现；并含有D614G突变，该突变在目前所有重要变异株中存
在；此外还含有弗林酶切位点删除/突变，可以消除S蛋白引起细胞融合的不利，并增强S蛋
白的免疫原性。本发明的mRNA疫苗可以诱导产生针对多种流行变异株的高水平的中和抗
体。

[0005] 本发明术语“中性磷脂”术语是指不带电荷的、非磷酸甘油酯的磷脂分子。

[0006] 本发明术语“聚乙二醇(PEG)‑脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。

[0007] 本发明术语“脂质纳米颗粒”（Lipid nanoparticles，LNP）是指具有至少一个纳米量级尺寸的颗粒，其包含至少一种脂质。

[0008] 本发明术语“疫苗”是指适合于应用于动物(包括人)的组合物，在施用后诱导免疫应答，其强度足以最低限度地帮助预防、改善或治愈起因于由微生物感染的临床疾病。

[0009] 本发明术语，“N/P”为阳离子脂质中N与mRNA单核苷酸中P的摩尔比。

[0010] 本发明的第一方面，提供了一种mRNA，所述的mRNA编码SARS‑CoV‑2病毒的刺突（S）蛋白或其衍生蛋白，所述的刺突（S）蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少75%的同源性（例如，与SEQ ID NO:1具有至少80%、85%、90%、95%、99%的同源性），所述刺突（S）蛋白具有相对于SEQ ID NO:1的修饰，所述的修饰位点包括：第417位由天冬酰胺替代；第484位由赖
氨酸或丙氨酸替代；第501位由酪氨酸替代；第614位由甘氨酸替代；第682‑685位发生氨基
酸部分或全部替换和/或缺失；和/或，第986和987位由脯氨酸替代中的一个、多个或全部。

[0011] 优选的，所述刺突（S）蛋白的修饰还包括将SEQ ID NO:1的第1‑13位替换为其他强信号肽，或在N端增加其他强信号肽；所述其他强信号肽包括组织型纤溶酶原激活剂(tPA)
的信号肽和血清免疫球蛋白E(lgE)的信号肽。

[0012] 优选的，所述刺突（S）蛋白的修饰还包括在N端或C端增加用于形成多聚体的片段，所述片段包括Fc片段或噬菌体T4纤维蛋白的三聚化基序，优选的，所述多聚体包括二聚体，
或三聚体或更多聚体。

[0013] 具体的，所述刺突（S）蛋白具有相对于SEQ ID NO:1如下的修饰：

[0014] （1）K986P、V987P；或者，

[0015] （2）K417N、E484K、N501Y、K986P、V987P；或者，

[0016] （3）K417N、E484K、N501Y、R682G、R683S、R685G、K986P、V987P；或者，

[0017] （4）K417N、E484K、N501Y、D614G、R682G、R683S、R685G、K986P、V987P；或者，[0018] （5）K417N、E484K、N501Y、D614G、∆R682(删除第682位)、∆R683(删除第683位)、∆R685(删除第685位)、K986P、V987P；或者，

[0019] （6）A67V、∆H69(删除第69位)、∆V70(删除第70位)、T95I、G142D、∆V143(删除第143位)、∆Y144(删除第144位)、∆Y145(删除第145位)、N211I、∆L212(删除第212位)、+
214EPE（第214位增加EPE三个氨基酸）、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、N954K、N969K、L981F、R682G、R683S、R685G、K986P、V987P。

[0020] 优选的，所述mRNA序列是天然或修饰的RNA，所述修饰的RNA包括通过用修饰的尿苷部分或全部取代天然尿苷对RNA进行修饰。

[0021] 更优选的，所述mRNA序列是修饰的RNA，所述修饰的RNA为通过用1‑甲基‑假尿苷对天然尿苷进行全部替换。

[0022] 在本发明的具体实施方式中，所述的mRNA的序列选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13，或者，所述的mRNA的序列为与上述任意序列至少75%的同源性的序列（例如，与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:
10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%、99%的同源性），并且所述的mRNA能够编码SARS‑CoV‑2病毒的刺突（S）蛋白或其衍生蛋白。

[0023] 本发明的第二方面，提供一种mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包含：

[0024] 1）至少一个信使核糖核酸mRNA，所述mRNA编码至少一种抗原肽或结构蛋白，所述抗原肽或结构蛋白包括SARS‑CoV‑2冠状病毒的刺突（S）蛋白或衍生蛋白，其中刺突（S）蛋白的序列与SEQ ID NO:1具有至少75%的同源性（例如，与SEQ ID NO:1具有至少80%、85%、90%、
91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性）；

[0025] 所述刺突（S）蛋白具有相对于SEQ ID NO:1的修饰，所述的修饰包括：第417位由天冬酰胺替代；第484位由赖氨酸或丙氨酸替代；第501位由酪氨酸替代；第614位由甘氨酸替
代；第682‑685位发生氨基酸部分或全部替换和/或缺失；和/或，第986和987位由脯氨酸替
代中的一个、多个或全部。

[0026] 优选的，所述mRNA疫苗包括2）脂质纳米颗粒（LNP）；所述mRNA包封于所述脂质纳米颗粒（LNP）中。

[0027] 优选的，所述抗原肽或结构蛋白还包括包膜蛋白（E），膜蛋白（M）或核衣壳蛋白（N），或其免疫原性片段或免疫原性变体。

[0028] 优选的，所述mRNA编码的刺突（S）蛋白的修饰包括信号肽变化，例如，可将SEQ ID NO:1的第1‑13位替换为其他强信号肽，或在N端增加其他强信号肽，所述其他强信号肽包括组织型纤溶酶原激活剂(tPA)的信号肽和血清免疫球蛋白E(lgE)的信号肽。

[0029] 优选的，所述mRNA编码的抗原肽或结构蛋白可以是S蛋白全长，或者S蛋白胞外区。

[0030] 优选的，所述mRNA编码的抗原肽或结构蛋白可以在N端或C端增加用于形成多聚体（例如二聚体，或三聚体，或更多聚体）的片段，所述片段包括Fc片段和噬菌体T4纤维蛋白的三聚化基序。

[0031] 优选的，所述mRNA可以是天然或修饰的RNA；优选的，可以通过用修饰的尿苷部分或全部取代天然尿苷对RNA进行修饰；更优选的，可以通过用1‑甲基‑假尿苷对天然尿苷进
行全部替换。

[0032] 优选的，所述的mRNA由若干个结构元件组成，即所述的mRNA除包含上述编码区外还包括5’帽子结构，5’非编码区，3’非编码区和/或多聚腺苷酸尾的mRNA序列。

[0033] 优选的，所述的mRNA序列的长度为200‑10000个核苷酸。进一步优选的，所述的mRNA序列的长度为500‑8000个核苷酸。

[0034] 在本发明的具体实施方式中，所述的mRNA的序列选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13，或者，所述的mRNA的序列为与上述任意序列至少75%的同源性的序列（例如，与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:
10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%、99%的同源性），并且所述的mRNA能够编码SARS‑CoV‑2病毒的刺突（S）蛋白或其衍生蛋白。

[0035] 优选的，所述脂质纳米颗粒包含阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质和聚乙二醇(PEG)‑脂质。

[0036] 优选的，所述的阳离子脂质具有以下结构：

[0037]

[0038] 或其药物可接受的盐或立体异构体，其中：

[0039] G1和G2各自独立地为未取代的C6‑C10亚烷基；

[0040] G3为未取代的C1‑C12亚烷基；

[0041] R1和R2各自独立地为C6‑C24烷基或C6‑C24烯基；

[0042] R3为OR5、CN、‑C(＝O)OR4、‑OC(＝O)R4或–NR5C(＝O)R4；

[0043] R4为C1‑C12烃基；并且

[0044] R5为H或C1‑C6烃基。

[0045] 优选的，阳离子脂质化合物结构：

[0046] DLin‑MC3‑DMA：

[0047]

[0048] ALC‑0315：

[0049]

[0050] SM‑102：

[0051]

[0052] 优选的，所述的聚乙二醇(PEG)‑脂质选自：2‑[(聚乙二醇)‑2000]‑N,N‑二十四烷基乙酰胺(ALC‑0159)、1,2‑二肉豆蔻酰基‑sn‑甘油甲氧基聚乙二醇(PEG‑DMG)、1,2‑二硬脂酰基‑sn‑甘油基‑3‑磷酸乙醇胺‑N‑[氨基(聚乙二醇)](PEG‑DSPE)、PEG‑二甾醇基甘油(PEG‑DSG)、PEG‑二棕榈油基、PEG‑二油基、PEG‑二硬脂基、PEG‑二酰基甘油酰胺(PEG‑DAG)、PEG‑二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG‑DPPE)、PEG‑1,2‑二肉豆蔻酰基氧基丙基‑3‑胺(PEG‑c‑DMA) 或DMG‑PEG2000中的一种或多种组合，优选的为DMG‑PEG2000。

[0053] 优选的，所述的中性磷脂选自：1,2‑二硬脂酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DSPC)、1,2‑二棕榈酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DPPC)、1,2‑二油酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2‑二棕榈酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺 (DPPE)、 1,2‑二肉豆蔻酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺 (DMPE)、2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸‑(1'‑rac‑甘油) (DOPG)、油酰磷脂酰胆碱（POPC）、1‑棕榈酰基‑2‑油酰基磷脂酰乙醇胺（POPE）中的一种或多种组合，优选的为DSPC。

[0054] 优选的，所述的甾族脂质选自燕麦甾醇、 β‑谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇以及经多肽修饰后的胆固醇；羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸中的一种或多种组合，优选的为胆固醇。

[0055] 优选的，所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述的阳离子脂质在脂质组分中的摩尔百分含量为20 60%、中性磷脂在脂质组分中的摩尔百分含量为5% 25%、甾族脂质在脂质
~ ~
组分中的摩尔百分含量为25% 55%；聚乙二醇(PEG)‑脂质在脂质组分中的摩尔百分含量为
~
0.1% 15%。
~

[0056] 优选的，所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述阳离子脂质：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇(PEG)‑脂质摩尔比为30‑60:5‑20:20‑50:0.1‑10，优选的，所述阳离子脂质：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇(PEG)‑脂质缀合物摩尔比为 40‑60:10‑20:30‑50:1‑5，更优选的，所述阳离子脂质：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇(PEG)‑脂质摩尔比为45:10:43:2或40:
10:48:2。

[0057] 优选的，所述脂质纳米颗粒（LNP）中总脂质（即阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质和聚乙二醇(PEG)‑脂质）与mRNA的质量比（w/w）在10‑30：1之间。

[0058] 优选的，所述的mRNA疫苗，所述疫苗中还包含其他辅料，所述其他辅料为醋酸钠、氨丁三醇、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸氢二钠、蔗糖中的一种或多种组合。

[0059] 优选的，所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述脂质纳米颗粒的平均粒径为50 200nm~
或所述脂质纳米颗粒在中性pH下具有净中性电荷或所述脂质纳米颗粒具有小于0.4的多分
散性。

[0060] 优选的，所述mRNA疫苗为液体制剂或冻干粉剂。更优选的，所述mRNA疫苗为口服制剂、肌肉注射制剂、静脉注射制剂或吸入制剂。进一步优选的，所述mRNA疫苗为雾化吸入剂
或干粉吸入剂。

[0061] 本发明所述的mRNA疫苗还可以包含药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是载体、稀释剂、佐剂或编码佐剂核苷酸序列、增溶剂、粘合剂、润滑剂、助悬剂、转染促进剂等。所述转染促进剂包括但不限于表面活性剂如免疫刺激复合物、费氏
(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(例如单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质、钙离子、病毒蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚‑L‑谷氨酸(LGS))或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。所述的编码佐剂的核苷酸序列为编码如下至少一种佐剂的核
苷酸序列：GM‑CSF、IL‑17、IFNg、IL‑15、IL‑21、抗PD1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、IL‑1、IL‑2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑6、IL‑7、IL‑8、IL‑9、IL‑10、IL‑12、INF‑α、INF‑ γ、Lymphotoxin‑α、hGH、MCP‑1、MIP‑1a、MIP‑1p、IL‑8、RANTES、L‑选择蛋白、P‑选择蛋白、 E‑选择蛋白、CD34、GlyCAM‑1、MadCAM‑1、LFA‑1、VLA‑1、Mac‑1、pl50.95、PECAM、ICAM‑1、 ICAM‑2、ICAM‑3、CD2、LFA‑3、M‑CSF、、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo‑1、p55、WSL‑1、DR3、TRAMP、Apo‑3、AIR、LARD、NGRF、 DR4、DR5、KILLER、TRAIL‑R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c‑jun、Sp‑1、Ap‑1、Ap‑2、 p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP‑1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL‑R3、TRAIL‑R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、 NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。

[0062] 本发明的第三方面，提供一种上述mRNA疫苗的制备方法，所述制备方法包括将阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质、聚乙二醇(PEG)‑脂质溶解至溶剂后与核酸混合后制得。

[0063] 优选的，所述mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，将阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质、聚乙二醇(PEG)‑脂质溶解至乙醇后与经稀释后的mRNA稀释液混合后经超滤、稀释、过滤后制得；优选的，将阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质、聚乙二醇(PEG)‑脂质溶解至乙醇后与经稀释后的mRNA稀释液按一定流速比混合后经超滤、稀释、过滤后制得；优选的，所述的超滤方式为切向流过滤；更优选的，所述的混合方式可为湍流混合、层流混合或微流体混合。

[0064] 更优选的，所述稀释液可为乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或tris缓冲液。进一步优选的，所述缓冲液pH为3 6，浓度为6.25 200mM。
~ ~

[0065] 优选的，所述的mRNA疫苗的制备方法中，脂质纳米颗粒包封mRNA时的N/P为2‑10，优选的N/P为3‑9。

[0066] 优选的，mRNA疫苗的剂型为口服制剂、肌肉注射制剂、静脉注射制剂、吸入制剂、液体制剂、冻干粉剂、雾化吸入剂或干粉吸入剂。

[0067] 本发明所述的mRNA疫苗还可以包含药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是载体、稀释剂、佐剂或编码佐剂核苷酸序列、增溶剂、粘合剂、润滑剂、助悬剂、转染促进剂等。 所述转染促进剂包括但不限于表面活性剂如免疫刺激复合物、费氏
(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(例 如单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质、钙离子、病毒蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚‑L‑谷氨酸(LGS))或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。所述的编码佐剂的核苷酸 序列为编码如下至少一种佐剂的
核苷酸序列：GM‑CSF、IL‑17、IFNg、IL‑15、IL‑21、抗PD1/2、乳铁 蛋白、鱼精蛋白、IL‑1、IL‑
2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑6、IL‑7、IL‑8、IL‑9、IL‑10、IL‑12、INF‑α、INF‑ γ、Lymphotoxin‑α、hGH、MCP‑1、MIP‑1a、MIP‑1p、IL‑8、RANTES、L‑选择蛋白、P‑选择蛋白、 E‑选择蛋白、CD34、GlyCAM‑1、MadCAM‑1、LFA‑1、VLA‑1、Mac‑1、pl50.95、PECAM、ICAM‑1、 ICAM‑2、ICAM‑3、CD2、LFA‑3、M‑CSF、、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、 神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo‑1、p55、WSL‑1、DR3、TRAMP、Apo‑3、AIR、LARD、NGRF、 DR4、DR5、KILLER、TRAIL‑R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c‑jun、Sp‑1、Ap‑1、Ap‑2、 p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP‑1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、 TRAILrec、
TRAILrecDRC5、TRAIL‑R3、TRAIL‑R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、 NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。

[0068] 本发明的第四方面，提供一种上述mRNA或者mRNA疫苗在制备用于预防或治疗病毒感染的疫苗中的应用。

[0069] 具体地，其中的病毒感染为新型冠状病毒。

[0070] 本发明相比现有技术的有益效果为：

[0071] 采用本发明所述的mRNA疫苗制剂稳定性良好。免疫可以诱导产生针对多种流行变异株的高水平的中和抗体，尤其是对现有mRNA疫苗已知有较强逃逸效果的变异株有较好中
和效果。

[0072] mRNA 新冠疫苗既可诱导人体产生体液免疫，又可引发人体产生细胞免疫，它具有双重免疫作用。

[0073] 在体内表达mRNA可避免来自病毒和蛋白质等外源因子的污染。且通过修饰mRNA序列和递送系统，可以有效调控mRNA的表达性和体内半衰期，达到高效免疫原性的同时具有
长效持续性。

附图说明

[0074] 图1：不同mRNA序列及不同递送阳离子脂质单免抗体滴度。

[0075] 图2： HEK293细胞Western‑Blot法检测mRNA的体外表达情况，其中标记“1”代表的细胞裂解物样品，标记“阴”代表阴性对照。

[0076] 图3 ：BALB/c小鼠模型上ELISA法检测S蛋白特异性IgG滴度。

[0077] 图4 ：BALB/c小鼠模型上ICS法检测特异性分泌TNFα、IFNγ、IL‑2、IL‑4和IL‑5的CD4+T细胞频数；

[0078] 图5 ：BALB/c小鼠模型上ICS法检测特异性分泌TNFα、IFNγ、IL‑2、IL‑4和IL‑5的CD8+T细胞频数。

[0079] 图6 ：恒河猴模型上ELISA法检测S蛋白特异性IgG滴度。

[0080] 图7 ：hACE2转基因小鼠模型上qPCR法检测原型株和Beta变异株真病毒攻毒后鼻甲的病毒载量。

[0081] 图8 ：hACE2转基因小鼠模型上qPCR法检测原型株和Beta变异株真病毒攻毒后肺部的病毒载量。

[0082] 图9 ：BALB/c小鼠模型上FRNT法检测原型株、Beta变异株、Delta变异株和Omicron变异株真病毒中和抗体滴度。

具体实施方式

[0083] 下面将结合本发明的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普
通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的
范围。

[0084] 实施例1：mRNA序列及递送阳离子脂质匹配筛选

[0085] 根据下表所示的蛋白序列设计质粒DNA序列。

[0086] 表1 ：蛋白序列信息汇总

[0087]

[0088] 注：∆代表删除突变

[0089] 人工合成质粒DNA序列，DNA序列含RNA转录相关的元件。质粒转化如大肠杆菌中进行扩增。发酵纯化后的质粒用限制性核酸内切酶BspQ1线性化。用T7体外转录试剂盒进行转
录，获得的未加帽的mRNA。分别用DNaseI消化转录模板，并用沉淀法纯化mRNA。用Cap1加帽
试剂盒给mRNA加帽，并分别用mRNA纯化试剂盒对加帽后的mRNA进行纯化。将纯化后的mRNA
溶解于酸性柠檬酸钠缓冲液中，待用。每条mRNA序列分别用含阳离子脂质ALC‑0315、SM‑102或DLin‑MC3‑DMA的配方包封；将阳离子脂质：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇(PEG)‑脂质按摩尔比为45:10:43:2在乙醇中溶解、混合。设定纳米药物制造设备总流速12ml/min。将表1
中的mRNA溶液与脂质混合溶液分别按流速比3：1包封，包封完成后，切向流过滤系统超滤换
液收集样品，并加入蔗糖溶液，得到mRNA疫苗（mRNA‑LNP）。BALB/c雌性小鼠按5只组进行随机分组，按5µg/只单免mRNA‑LNP，在第14天采血检测S蛋白特异性抗体滴度，检测结果如表
2、图1所示，不同mRNA和LNP的组合均可产生较高的抗体滴度，其中RBD/614/GSAG/2P和ALC‑
0315的组合、RBD/614/A/2P和ALC‑0315的组合，以及Omicron/GSAG/2P和ALC‑0315的组合的平均抗体滴度明显高于其他种类脂质组合。

[0090] 表2 ：不同mRNA序列及不同递送阳离子脂质单免抗体平均滴度

[0091]

[0092] 实施例2：不同总脂质与mRNA的质量比单免抗体滴度实验

[0093] 将ALC‑0315：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇(PEG)‑脂质按摩尔比为45:10:43:2在乙醇中溶解、混合。设定纳米药物制造设备总流速12ml/min。总脂质与编码RBD/614/GSAG/2P，RBD/614/A/2P，Omicron/GSAG/2P的mRNA溶液分别按照总脂质/mRNA(w/w)7:1、10:1、20:
1、30:1包封，包封完成后，切向流过滤系统超滤换液收集样品，并加入蔗糖溶液，得到mRNA疫苗（mRNA‑LNP）。BALB/c雌性小鼠按5只每组进行随机分组，按5ug/只单免mRNA‑LNP，在第
14天采血检测S蛋白特异性抗体滴度，检测结果如下表所示，当总脂质与mRNA的质量比在
10‑30：1之间时，单免抗体滴度大于10的5.5次方。

[0094] 表3：总脂质与mRNA的质量比单免抗体滴度汇总

[0095]

[0096] 实施例3：mRNA的制备与检测

[0097] 包含SEQ ID NO:11的质粒用限制性核酸内切酶BspQ1线性化。用T7体外转录试剂盒进行转录，获得的未加帽的mRNA。分别用DNaseI消化转录模板，并用沉淀法纯化mRNA。用
Cap1加帽试剂盒给mRNA加帽，并分别用mRNA纯化试剂盒对加帽后的mRNA进行纯化。将纯化
后的mRNA溶解于酸性柠檬酸钠缓冲液中，待用。将mRNA用转染试剂转染进入HEK293细胞，
24h后收集细胞，用细胞裂解物做Western‑Blot检测，可用S蛋白特异性抗体检测到S蛋白在
细胞中的表达，如图2所示。

[0098] 其他序列SEQ ID NO:8、9、10、12、13的mRNA参照上述步骤进行制备，并可检测到S蛋白在细胞中的表达。

[0099] 实施例4：mRNA疫苗的制备与检测

[0100] 将ALC‑0315：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇(PEG)‑脂质按摩尔比为45:10:43:2在乙醇中溶解、混合。设定纳米药物制造设备总流速12ml/min。将实施例1中的RBD/614/A/2P‑mRNA溶液与脂质混合溶液按流速比3：1包封，包封完成后，切向流过滤系统超滤换液收集样品，并加入蔗糖溶液，得到mRNA疫苗（mRNA‑LNP）。取样测得包封率为91.49%，平均粒径为
81.99nm，PDI为0.07,Zeta电位为‑8.20mV。

[0101] 实施例5：mRNA疫苗的小鼠免疫原性检测

[0102] BALB/c雌性小鼠按10只每组进行随机分组，在第0天和28天按不同免疫剂量（高剂量组10µg/只、低剂量组5µg/只）免疫实施例1 RBD/614/A/2P‑mRNA‑LNP。在第28天（二免前）和第42天采血；第42天，处死小鼠、收获脾细胞并使用S蛋白的重叠肽库进行刺激检测细胞
免疫应答。

[0103] 一免和二免的抗体滴度如图3所示，一免即可以引起较高的抗体应答，但二免可以使抗体滴度增加约一个数量级；5µg即可在小鼠模型上引起足够高的抗体滴度，增加剂量到
10µg并不能提高抗体应答水平。

[0104] 通过细胞内细胞因子染色流式细胞术（ICS）方法检测受到肽库刺激后分泌IL‑2、IFNγ、TNFα、IL‑4和IL‑5的CD4+T细胞和CD8+T细胞的频数。特异性分泌上述细胞因子的CD4+T细胞频数如图4所示，分泌IL‑2、IFNγ和TNFα的CD4+T细胞频数相比阴性组有明显升高。
特异性分泌上述细胞因子的CD8+T细胞频数如图5所示，分泌IL‑2、IFNγ和TNFα的CD8+T细
胞频数相比阴性组有明显升高，分泌IFNγ和TNFα的CD8+T细胞占比达到了5%‑10%，展现出
很高的细胞应答水平。

[0105] 实施例6：mRNA疫苗的恒河猴免疫原性检测

[0106] 恒河猴按6只每组、雌雄各半进行随机分组，在第0天和21天按不同免疫剂量（高剂量组150ug/只、低剂量组50ug/只）免疫实施例1 RBD/614/A/2P‑mRNA‑LNP。在第21天（二免前）和第28天采血。

[0107] 一免和二免的抗体滴度如图6所示，一免即可以引起较高的抗体应答，但二免可以使抗体滴度增加约一个数量级；50ug即可在恒河猴模型上引起足够高的抗体滴度，增加剂
量到150ug并不能提高抗体应答水平。

[0108] 实施例7：mRNA疫苗的小鼠保护性研究

[0109] hACE2转基因雌性C57BL/6小鼠按16只每组进行随机分组，在第0天和21天按不同免疫剂量（高剂量组10ug/只、低剂量组5ug/只）免疫实施例1 RBD/614/A/2P‑mRNA‑LNP。二免后第21天，每组小鼠再按8只每组随机分为2组：一组滴鼻感染5×105PFU的原型株的新型
冠状病毒（2019‑nCoV‑WIV04）；一组滴鼻感染5×105PFU的Beta变异株的新型冠状病毒
（NPRC2.062100001）。攻毒后第5天，解剖小鼠，分别取小鼠鼻甲和肺，通过RT‑qPCR测定病毒载量。小鼠鼻甲的病毒载量如图7所示，mRNA疫苗可以完全或部分阻止病毒在鼻甲的复制。
小鼠肺部的病毒载量如图8所示，mRNA疫苗可以完全或部分阻止病毒在肺部的复制。可见本
发明的mRNA疫苗对原型株和Beta变异株都有很好的保护效果。

[0110] 实施例8：mRNA疫苗的交叉保护性研究

[0111] BALB/c雌性小鼠按8只每组进行随机分组，在第0天和14天按5ug/只的免疫剂量免疫实施例1 RBD/614/A/2P‑mRNA‑LNP。在第28天采血，采用斑点减少中和试验（FRNT）评价血清中的中和抗体水平。检测用真病毒包括新型冠状病毒原型株、Beta变异株、Delta变异株
及Omicron变异株。中和抗体检测结果表明（图9），二免后14天的小鼠血清具有较好的交叉
中和效果，对原型株、Beta变异株、Delta变异株和Omicron变异株的几何平均中和抗体滴度
均高于103。本发明的mRNA疫苗两针免疫后血清对Omicron变异株的几何平均中和抗体滴度
相比于原型株降低了3.3倍，相对于商品化疫苗对Omicron变异株的交叉中和活性大幅增
强。

[0112] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这
些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0113] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可
能的组合方式不再另行说明。