一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202210112070.0
文献号 : CN114410588B
文献日 : 2022-11-04
发明人 : 宁蓬勃 , 王忠良 , 杜付玉 , 龚春梅 , 张伟洁
申请人 : 西安电子科技大学
摘要 :
本发明公开了一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用，属于免疫学和肿瘤治疗学领域。所述CAR巨噬细胞包括α1β1整合素跨膜区及胞内信号调控基序、FcγRⅠ胞内信号转导基序、胞外抗原结合区，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1‑4所示。本发明还将基于α1β1整合素介导FcγRⅠ胞内信号传导域构建CAR巨噬细胞，通过试验证明了该CAR巨噬细胞激活巨噬细胞活化信号并促进巨噬细胞吞噬能力，协同增强抗肿瘤效应。本发明通过设计适用于巨噬细胞信号转导功能的特异性元件，构建了真正意义上的CAR巨噬细胞技术平台，为今后广泛适用于各种CAR巨噬细胞治疗实体肿瘤的应用及延伸设计。
权利要求 :
1.一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞在制备治疗实体肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述CAR巨噬细胞包括胞内α1β1整合素跨膜介导的FcγRⅠ胞内信号转导基序，所述α1β1整合素包括α1β1整合素跨膜区及胞内信号调控基序；
所述α1β1整合素跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述α1β1整合素的胞内信号调控基序的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述FcγRⅠ胞内信号转导基序的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述CAR巨噬细胞还包括胞外抗原结合区，所述胞外抗原结合区为scFv，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述实体肿瘤为卵巢癌和乳腺癌。
2.一种制备如权利要求1所述的α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞的方法，其特征在于，包括将α1β1整合素跨膜区及胞内信号调控基序、FcγRⅠ胞内信号转导基序、胞外抗原结合区的核苷酸序列导入CAR巨噬细胞中的步骤；
所述α1β1整合素跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述α1β1整合素的胞内信号调控基序的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述FcγRⅠ胞内信号转导基序的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述CAR巨噬细胞还包括胞外抗原结合区，所述胞外抗原结合区为scFv，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括权利要求2中所述的α1β1整合素跨膜区及胞内信号调控基序、FcγRⅠ胞内信号转导基序、胞外抗原结合区；
所述α1β1整合素跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述α1β1整合素的胞内信号调控基序的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述FcγRⅠ胞内信号转导基序的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述CAR巨噬细胞还包括胞外抗原结合区，所述胞外抗原结合区为scFv，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种载体，其特征在于，包括权利要求2中所述的α1β1整合素跨膜区及胞内信号调控基序、FcγRⅠ胞内信号转导基序、胞外抗原结合区的核苷酸序列。
5.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的CAR巨噬细胞或权利要求4所述的载体连同药学上可接受的载体。
6.一种如权利要求1所述的CAR巨噬细胞在制备增强巨噬细胞先天免疫吞噬功能的药物中的应用。
说明书 :
一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和
应用
技术领域
[0001] 本发明涉及免疫学和肿瘤治疗学技术领域，特别是涉及一种α1β1整合 素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 免疫治疗在肿瘤治疗领域发挥重要作用，且不断取得重要进展。近年 来，CAR‑T细胞疗法因其在血液系统肿瘤领域取得的很好疗效，现已被美 国FDA及我国药监部门批准成为特定血液癌症治疗的临床用药。然而， CAR‑T细胞疗法因受到T细胞对实体肿瘤浸润难度大、以及T细胞在肿瘤 微环境中遭遇免疫衰竭等问题。迄今为止，CAR‑T细胞疗法在针对恶性实 体瘤的治疗中进展缓慢。当前探索更多类型免疫细胞用于开发过继细胞疗 法，以能开展特定有效的细胞免疫治疗已成为肿瘤免疫治疗发展的热点和 趋势。巨噬细胞先天具有肿瘤趋化性，并可深度浸润实体肿瘤，部分肿瘤 中巨噬细胞浸润度达50％，并且随着肿瘤恶性程度增加其浸润程度逐渐增 强。因此，基于巨噬细胞开展的嵌合抗体构建，进而形成的CAR巨噬细 胞(CAR‑Macrophage，CAR‑M)肿瘤细胞治疗技术在今后攻克实体肿瘤 的治疗发展中被寄予厚望。
[0003] T细胞的活化需要表面TCR‑CD3复合物与MHC分子复合物结合提供 T细胞的活化第一信号，然而肿瘤微环境中MHC分子的表达水平低下， 不能有效提刺激T细胞的第一活化信号，从而导致T细胞的免疫反应和杀 伤作用被抑制。因此研究人员创造性地设计了CAR‑T细胞技术，使用含胞 外特异识别肿瘤抗原的scFv段换掉TCR的胞外区域，使其不依赖于MHC 分子的作用。Arthur Weiss等发现嵌合抗原受体含有的T细胞内信号域 CD3ζ可激活T细胞信号传导。故CAR‑T选择了CD3ζ作为传输胞内激活 信号的基序。
[0004] CAR‑M肿瘤细胞疗法作为新型肿瘤免疫治疗技术着眼于机体另一重 要免疫细胞‑巨噬细胞，开拓了新的细胞治疗领域，然而，当前CAR‑M构 建大多在沿用CAR‑T细胞的设计单元。例如，来自宾夕法尼亚大学的Saar Gill博士和Michael Klichinsky博士在Nature Biotechnology报道的CAR‑ 巨噬细胞疗法，采用的是经典CAR‑T中特异性发挥T细胞信号转导功能 的CD3ζ信号转导结构域。CAR‑M若得以作为独树一帜的细胞免疫治疗机 制，首先如何构建设计真正适用于巨噬细胞信号转导功能的特异性元件亟 待深入探讨。
[0005] 巨噬细胞的活化须经历两个阶段：致敏阶段和激活阶段。激活是由众 多基因的协同表达驱动完成，期间需要多种跨膜蛋白的参与。巨噬细胞表 面存在多种蛋白分子，均参与介导巨噬细胞活化的过程，包括α1β1整合素、 FcR、CSF‑1R、MR、CD36、CD163和CD206等。α1β1整合素通常表达 于巨噬细胞，并通过α1亚基胞外区的I‑结构域与细胞外基质(ECM)中 的胶原分子相互作用，介导其细胞因子的分泌。α1β1整合素在巨噬细胞的 炎症反应中发挥重要作用，其在介导巨噬细胞活化方面起着重要作用。在 免疫系统中，α1β1只有在被抗原、超抗原或细胞因子激活后才在巨噬细胞 上表达。研究表明，巨噬细胞α1/β1整合素的表达被IFN‑γ特异性诱导， 从而促进巨噬细胞的活化和刺激细胞因子的表达。巨噬细胞是肿瘤免疫浸 润的重要组成部分。肿瘤细胞可以分泌白细胞介素和趋化因子等信号分子 来招募巨噬细胞，这使得巨噬细胞天然趋向并浸润至实体肿瘤内。遗憾的 是，巨噬细胞募集到肿瘤组织后，肿瘤细胞为避免被巨噬细胞免疫攻击， 其肿瘤微环境大多低表达IFN‑γ等免疫诱导因子，从而无法形成对巨噬细 胞M1型极化及抗癌活化特性的有效激活，客观上促进了实体肿瘤的恶性 进展。
[0006] 近些年，虽然也有很多研究者在构建巨噬细胞方面进行研究，但是由 于肿瘤微环境IFN‑γ低表达等抑制性因素，巨噬细胞先天免疫吞噬等清除 肿瘤细胞的能力受到显著抑制，并没有真正意义上的成功构建CAR‑M，而 CAR‑M信号转导功能的特异性元件如何来设计，以更适宜于CAR‑M的本 身抗癌潜能机制，从而形成真正意义的CAR‑M技术体系，是亟需解决的 问题。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其 制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，基于α1β1整合素与 FcγRⅠ特定基序设计构建的活化吞噬增强型CAR‑M，CAR‑M scFV靶向杀 伤肿瘤细胞后，激活巨噬细胞活化信号并促进巨噬细胞的吞噬，协同增强 抗肿瘤效应。
[0008] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
[0009] 本发明提供一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞，包括胞内 α1β1整合素跨膜介导的FcγRⅠ胞内信号转导基序，所述α1β1整合素包括 α1β1整合素跨膜区及胞内信号调控基序。
[0010] 优选的是，所述α1β1整合素跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所 示，所述α1β1整合素的胞内信号调控基序的核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示；
[0011] 所述FcγRⅠ胞内信号转导基序的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0012] 优选的是，所述CAR巨噬细胞还包括胞外抗原结合区。
[0013] 优选的是，所述胞外抗原结合区为scFv，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4 所示。
[0014] 本发明还提供一种制备所述的α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞 的方法，其特征在于，包括将α1β1整合素跨膜区及胞内信号调控基序、 FcγRⅠ胞内信号转导基序、胞外抗原结合区的核苷酸序列导入CAR巨噬细 胞中的步骤。
[0015] 本发明还提供一种嵌合抗原受体，包括所述的α1β1整合素跨膜区及胞 内信号调控基序、FcγRⅠ胞内信号转导基序、胞外抗原结合区的核苷酸序列。
[0016] 本发明还提供一种载体，包括所述的α1β1整合素跨膜区及胞内信号调 控基序、FcγRⅠ胞内信号转导基序、胞外抗原结合区的核苷酸序列，或权利 要求6所述的嵌合抗原受体。
[0017] 本发明还提供一种药物组合物，包括所述的CAR巨噬细胞或所述的 载体连同药学上可接受的载体。
[0018] 本发明还提供一种所述的CAR巨噬细胞在制备增强巨噬细胞先天免 疫吞噬功能的药物中的应用。
[0019] 本发明还提供一种所述的CAR巨噬细胞在制备治疗实体肿瘤药物中 的应用。
[0020] 优选的是，所述实体肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、结直肠 癌等HER2高表达实体肿瘤。
[0021] 本发明公开了以下技术效果：
[0022] 本发明基于α1β1整合素与FcγRⅠ特定基序设计构建的活化吞噬增强型 CAR‑M(Active CAR‑M，ACT CAR‑M)，CAR‑M scFV靶向结合肿瘤细胞 表面抗原后，激活α1β1整合素活化进而与FcγRⅠ形成共刺激分子，CAR‑M 给予本发明采用的α1β1‑FcγRⅠ胞内活化结构域，将FcγRⅠ的胞内直接构建 至CAR胞内起到巨噬细胞吞噬功能活化启动的第一信号，α1β1整合素的 胞内构建至CAR胞内增强巨噬细胞活力，起到第二步活化巨噬细胞的作 用。恰能够使其CAR‑M scFV靶向杀伤肿瘤细胞的同时，激发α1β1整合 素促进巨噬细胞活化，并使得巨噬细胞无须Fc介导即可通过胞外特异识别 肿瘤抗原的scFv段激活发挥其吞噬增强等抗肿瘤潜能，即协同增强抗肿瘤 效应。
[0023] 本发明基于α1β1整合素跨膜介导的FcγRⅠ胞内信号传导域，设计适用 于巨噬细胞信号转导功能的特异性元件，设计并实施了一种α1β1整合素依 赖增强型Active CAR‑M(ACT CAR‑M)细胞技术平台，该技术平台显著 提高CAR‑M抗肿瘤特性，适用于今后各类型CAR‑M治疗实体肿瘤的应 用及延伸设计。
附图说明
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对 实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附 图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出 创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025] 图1为本发明巨噬细胞特异活化型ACT CAR‑M的构建及其表征；
[0026] A：共聚焦显微镜观察ACT CAR的跨膜表达；B：qPCR检测ACT CAR 的表达；C：共聚焦检测ACT CAR‑M的HER2蛋白结合能力，标尺大小 为30μm；
[0027] 图2为本发明ACT CAR‑M的活性检测；A：CCK‑8检测ACT CAR‑M 的增殖情况；B：qPCR检测p53的表达情况；C：qPCR检测CCND‑1的 表达情况；D：qPCR检测Ki67的表达情况；*表示不同组之间的显著性差 异，***为P<0.001，**为P<0.01，*为P<0.05；
[0028] 图3为本发明ACT CAR‑M吞噬肿瘤能力检测；A：ACT CAR‑M吞噬 HER2+‑4T1肿瘤细+胞；B：ACT CAR‑M吞噬HER2‑SKOV3肿瘤细胞；
[0029] 图4为本发明anti‑HER2 ACT CAR‑M对HER2+‑4T1 HER2信号通路 的作用分析；A：qPCR检测AKT的表达情况；B：qPCR检测PI3K的表 达情况：C：qPCR检测p53的表达情况；D：
qPCR检测CCND‑1的表达 情况：E：qPCR检测Caspase‑3的表达情况；F：qPCR检测Ki67的表达 情况；*表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001，**为P<0.01，*为 P<0.05；
qPCR检测CCND‑1的表达 情况：E：qPCR检测Caspase‑3的表达情况；F：qPCR检测Ki67的表达 情况；*表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001，**为P<0.01，*为 P<0.05；
[0030] 图5为本发明anti‑HER2 ACT CAR‑M对HER2+‑SKOV3 HER2信号通 路的作用分析；A：qPCR检测AKT的表达情况；B：qPCR检测PI3K的 表达情况：C：qPCR检测p53的表达情况；D：
qPCR检测CCND‑1的表 达情况；E：qPCR检测Caspase‑3的表达情况；F：qPCR检测Ki67的表 达情况；*表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001，**为P<0.01，* 为P<0.05；
qPCR检测CCND‑1的表 达情况；E：qPCR检测Caspase‑3的表达情况；F：qPCR检测Ki67的表 达情况；*表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001，**为P<0.01，* 为P<0.05；
[0031] 图6为本发明anti‑HER2 ACT CAR‑M对肿瘤细胞的体外杀伤检测；A： CCK‑8检测+ +ACT CAR‑M对HER2‑SKOV3细胞的杀伤；B.CCK‑8检测 ACT CAR‑M对HER2‑4T1细胞的杀伤；
[0032] 图7为本发明小鼠HER2+‑4T1肿瘤模型验证ACT CAR‑M的抗肿瘤结 果；A：ACT CAR‑M治疗小鼠HER2+‑4T1肿瘤模式图；B：ACT CAR‑M 治疗小鼠肿瘤生长曲线；C：ACT CAR‑M治疗小鼠肿瘤生存曲线；D：ACT CAR‑M治疗小鼠体重；*表示不同组之间的显著性差异，***为P<0.001， **为P<0.01，*为P<0.05。
具体实施方式
[0033] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对 本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更 详细的描述。
[0034] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于 限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该 范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间 值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也 包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围 内。
[0035] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述 领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方 法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等 同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公 开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时， 以本说明书的内容为准。
[0036] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实 施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本 发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请 说明书和实施例仅是示例性的。
[0037] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开 放性的用语，即意指包含但不限于。
[0038] 实施例1一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞的制备方法及功 能验证[0039] 1、活力增强型ACT CAR‑M的构建及表征
[0040] 本研究前期参考CAR‑T的体胞外结合理念，受益于包膜病毒的侵染出 芽表达机制，采用慢病毒载体构建巨噬细胞的特异性CAR以及活力增强 型ACT CAR‑M，以HER2为模式分子成功建立活力增强型CAR‑M平台， 于细胞膜表面表达跨膜HER2 scFv胞外段，筛选获得具有高亲和HER2结 合活性的ACT CAR‑M稳转细胞系。
[0041] 1.1慢病毒的构建和包装
[0042] 基于慢病毒载体，通过将HER2 scFv、α1β1整合素跨膜区域、α1β1 整合素胞内信号调控基序、FcγR1跨膜信号传导域胞内(及FcγRⅠ胞内信 号转导基序)和GFP使用linker进行连接，合成嵌合抗原受体HER2 scFv‑GFP(由生工生物工程(上海)股份有限公司进行的序列合成)，将 其转染巨噬细胞，构建巨噬细胞特异性CAR，通过将合成的HER2 scFv‑GFP‑CAR慢病毒质粒与Rev、Gag、VSV三种辅助质粒进行共转染， 使其包装成为完整的HER2 scFv‑GFP‑CAR慢病毒。
[0043] 具体步骤如下：
[0044] (1)将4×105个处于对数生长期的HEK293T细胞均匀接种于6孔板 中，在37℃、5％CO2细胞培养箱中静置培养至细胞汇合度达到60％‑70％， 按3:1:1:1比例分别取质粒pCDH‑Affibody‑GFP 2.0μg、Rev 0.67μg、Gag 0.67μg和VSV 0.67μg加入到装有400μL Opti‑MEM的1.5mL离心管中混 匀室温孵育5min，再加入6.0μL TurboFect Transfection Reagent转染试剂， 枪头轻柔吹打混匀，室温孵育15‑20min；
[0045] (2)将上述孵育好的混合液缓慢滴加到接种了293T细胞的6孔板中， 边滴加边轻轻摇动培养板，置于37℃、5％CO2培养16‑24h后，弃掉6孔 板各孔中的转染混合液，添加2‑3mL包含10％胎牛血清(FBS)、1×CD(CD lipid concentrate Gibico)、0.01mM胆固醇、
4.0mM L‑谷氨酸(Glu)、0.01mM 蛋黄卵磷脂的Advanced DMEM完全培养基，将细胞培养板重置于37℃、 5％CO2培养48h，待合成为HER2 scFv‑GFP‑CAR慢病毒；
4.0mM L‑谷氨酸(Glu)、0.01mM 蛋黄卵磷脂的Advanced DMEM完全培养基，将细胞培养板重置于37℃、 5％CO2培养48h，待合成为HER2 scFv‑GFP‑CAR慢病毒；
[0046] (3)为去除细胞碎片，将含有慢病毒的培养基于4℃、4000g下离心 10min。用0.22μm的过滤器过滤上清液并收集，离心机4℃、15000g离心 2h。弃上清，利用病毒保存液重悬病毒颗粒，再10000g离心5min后取上 清于‑80℃中保存备用；
[0047] (4)随后，检测包装出来的慢病毒滴度，向9个无菌的1.5mL离心 管中加入90μL含有6.0μg/mL聚凝胺的DMEM完全培养基，再将10μL已 获得的重组慢病毒颗粒HER2 scFv‑GFP‑CAR加入第一个离心管中吹打均 匀，吸出10μL混合液加入到第二个离心管中，如此连4
续直至最后一管， 每组设置三个重复。将5×10 个HEK293T细胞均匀接种于96孔板中，细 胞汇合度达到60％‑70％时依次加入上述稀释好的各梯度慢病毒稀释液，同 时设置不加入病毒稀释液的293T细胞作为阴性对照；培养24h后，更换 新鲜的DMEM完全培养基，48h后于倒置荧光显微镜下观察各孔应该情况。 慢病毒滴度计算公式为：病毒滴度(TU/mL)＝平均发绿色荧光细胞数×病 毒稀释倍数/接种病毒液的体积(mL)，单位为TU/mL。
续直至最后一管， 每组设置三个重复。将5×10 个HEK293T细胞均匀接种于96孔板中，细 胞汇合度达到60％‑70％时依次加入上述稀释好的各梯度慢病毒稀释液，同 时设置不加入病毒稀释液的293T细胞作为阴性对照；培养24h后，更换 新鲜的DMEM完全培养基，48h后于倒置荧光显微镜下观察各孔应该情况。 慢病毒滴度计算公式为：病毒滴度(TU/mL)＝平均发绿色荧光细胞数×病 毒稀释倍数/接种病毒液的体积(mL)，单位为TU/mL。
[0048] 上述构建嵌合抗原受体的各元件序列如下：
[0049] HER2 scFv序列(SEQ ID NO:4)：
[0050] atgaatttacaaccaattttctggattggactgatcagttcagtttgctgtgtgtttgctctagcttctcaggtac aactgcagcagtctggacctgaactgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcctctgggtat cctttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggacagggtttaaagtggatgggctggattaac acctccactggagagtcaacatttgctgatgacttcaagggacggtttgacttctctttggaaacctctgccaacact gcctatttgcagatcaacaacctcaaaagtgaagacatggctacatatttctgtgcaagatgggaggtttaccacgg ctacgttccttactggggccaagggaccacggtcaccgtttcctctggcggtggcggttctggtggcggtggctc cggcggtggcggttctgacatccagctgacccagtctcacaaattcctgtccacttcagtaggagacagggtcag catcacctgcaaggccagtcaggatgtgtataatgctgttgcctggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaa cttctgatttactcggcatcctcccggtacactggagtcccttctcgcttcactggcagtggctctgggccggatttc actttcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaacattttcgtactccattcacg。
[0051] Linker序列(SEQ ID NO:5)：
[0052] ggcggtggttccggcggtggatctggtggaggaactggaggaggttcaggaggtggt。
[0053] α1β1整合素跨膜区序列(SEQ ID NO:1)：
[0054] ttatgggtcatcctgctgagtgcttttgccggattgttgctgttaatgctgctcattttagcactgtgg。
[0055] α1β1整合素胞内信号调控基序(SEQ ID NO:2)：
[0056] aagatcggattcttcaagagacctctgaagaagaagatggagaag。
[0057] FcγRⅠ胞内信号转导基序(SEQ ID NO:3)：
[0058] aagatccatagactgcagagagagaagaagtacaacctggaggtgcctctggtgagcgagcagggcaa gaaggccaacagcttccagcaggtgaggagcgacggcgtgtacgaggaggtgaccgccaccgccagccaga ccacccctaaggaggcccctgacggccctaggagcagcgtgggcgactgtggccctgagcagcctgagcctc tgcctcctagcgacagcaccggcgcccagaccagccagagc。
[0059] GFP序列(SEQ ID NO:6)：
[0060] gtgagtaagggcgaggagctgtttaccggcgtggtgcccatcctggtggagctggacggcgacgtgaa cggccacaagttcagcgtgagcggcgagggggagggcgacgccacctacggcaagctgaccctgaagttcat ttgcacaaccggcaagctgcccgtgccatggcctaccctggtgaccaccctgacatacggcgtccagtgttttag caggtatcccgaccacatgaagcagcacgacttctttaagagcgccatgcccgagggctacgtgcaggagagg accatcttcttcaaggacgacggtaactacaagaccagagccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaa ccggatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggtaacatcctgggccacaagctggagtataactata atagccacaacgtgtacatcatggccgacaagcagaagaacggcattaaggtgaacttcaagatcagacataac atcgaggacggatctgtgcagctggccgaccactaccagcagaacacccctatcggagatggaccagtgctgct gcctgataatcactatctgagcacacagtctgccctgagcaaagatcctaatgaaaagagagatcacatggtgctg ctggagtttgtgacagctgctggaataacactgggcatggatgagctgtataagtaa。
[0061] 1.2筛选ACT CAR‑M稳转细胞株
[0062] 在包装为完整的慢病毒并检测了其滴度后，使用HER2 scFv‑GFP‑CAR 慢病毒感染巨噬细胞，并通过药物筛选获得ACT CAR‑M稳转细胞株，具 体步骤如下：
[0063] (1)为确定药物筛选最佳浓度，取5×104个处于对数生长期的不经任 何处理的J774A.1巨噬细胞接种于24孔板内，用DMEM完全培养基于37℃、 5％CO2的细胞培养箱中培养。待细胞密度约60‑70％时，添加含有终浓度 为0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、5μg/mL嘌呤霉素的DMEM 完全培养基进行最佳致死浓度的测定。24孔板置于细胞培养箱中静置培养， 每天观察一次细胞形态及残留细胞数目，以第4天杀死全部巨噬细胞的嘌 呤霉素终浓度作为最佳药筛浓度；
[0064] (2)使用慢病毒感染J774A.1巨噬细胞，取2×105个J774A.1巨噬细 胞接种于6孔板内，待其生长到细胞汇合度至60‑70％时，以每9：1的比 例向培养J774A.1巨噬细胞的培养基中加入HER2 scFv‑GFP‑CAR慢病毒 病毒颗粒，并加入聚凝胺使其终浓度为6.0μg/mL，24h后更换新鲜DMEM 完全培养基，48h后即完成J774A.1的慢病毒感染；
[0065] (3)通过嘌呤霉素最佳药筛浓度进行筛选稳转细胞株，每隔1天更换 一次含有嘌呤霉素的新鲜DMEM培养基，使培养基中嘌呤霉素的浓度保 持不变，观察细胞生长情况及形态变化。约持续3‑4次后药筛完成，胰酶 消化药筛后的细胞并按0.5个/100μL的细胞浓度，将细胞接种于96孔板中， 用含有嘌呤霉素的DMEM完全培养基继续培养，选择仅含有单个细胞的 孔进行细胞扩大培养，传代至新的培养瓶或培养皿中进行扩增或者冻存。
[0066] 1.3 qPCR检测
[0067] 提取上述稳转细胞株的总RNA，利用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒检测上述的稳转细胞株中融合蛋白的表达情况，按照试剂盒 说明书进行实验，qPCR实验步骤如下：
[0068] (1)正常溶解2×SuperReal Premix Plus、50×ROX Reference Dye、模 板、引物和RNase‑free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀；
[0069] (2)在冰上将反转得到的cDNA模板以一定体系与正向引物、反向 引物、Mix、ROX、ddH2O混合，利用移液枪将混合液添加入八连管中， 20μL体系包括：10μL 2×SuperReal Premix Plus、0.6μL正向引物(10μM)、 0.6μL反向引物(10μM)、0.1‑2μL cDNA模板、0.4μL 50×ROX Reference Dye， 使用RNase‑free ddH2O补充至总体积20μL；
[0070] (3)盖上管盖，吹打混匀，用微量离心机离心5‑10s，确保所有组分 均在管底；
[0071] (4)将反应体系放置于RT‑qPCR仪ABI 7300中，设置仪器参数，95℃ 预变性15min、95℃变性10s、60℃±1℃退火20s，72℃延伸31s，40个循 环，运行程序，待程序结束后导出‑ΔΔCt
Ct值，并利用2 (Livak)法计算最 终结果。
Ct值，并利用2 (Livak)法计算最 终结果。
[0072] qPCR结果显示：ACT CAR‑M融合蛋白的成功表达；共聚焦显微镜结 果成功验证了HER2 scFv的HER2结合活性，如图1所示。这为后期研究 提供细胞治疗模型。
[0073] 2、ACT CAR‑M的活性检测
[0074] (1)CCK细胞增殖试验
[0075] ①于96孔板中每孔加入100μL的HER2阳性肿瘤靶细胞悬液，密度 为1×105个细胞/mL，置于37℃、5％CO2的培养箱中静置培养；
[0076] ②待HER2阳性肿瘤靶细胞贴壁后，吸去孔板中的培养基，用PBS清 洗细胞2‑3次，分别向96孔板中分别加入100μL不同密度的J774A.1 (UTD‑M)、Empty‑pCDH J774A.1(Empty)、HER2 scFv J774A.1(CAR‑like)、 HER2 scFv CAR J774A.1(ACT CAR‑M)，设置效靶比分别为0:1、0.25:1、 0.5:1、0.75:1、1:1，同时在没有靶细胞的96孔板中加入等量的UTD‑M、 Empty、CAR‑like、ACT CAR‑M细胞作为效应细胞对照，设置全部裂解的 未加效应细胞的等量HER2阳性肿瘤靶细胞孔作为靶细胞阳性对照组，每 组实验设置3个平行孔；
[0077] ③细胞共培养24‑48h之后，吸去96孔板中的培养基，用PBS清洗细 胞2‑3次，再向96孔板中加入10μL的CCK8检测溶液，在37℃、5％CO2的培养箱中培养3‑4h；
[0078] ④用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度，靶细胞细胞活性大小＝(效 靶比作用组吸光度－效应细胞对照组吸光度)/(靶细胞阳性对照组吸光度 －空白孔吸光度)。
[0079] (2)同时，分别提取各组细胞总RNA，采用qPCR检测ACT CAR‑M 活性，检测方法同上述的qPCR的检测方法。
[0080] 结果如图2所示，ACT CAR‑M组细胞增殖显著增强于CAR‑Like组(图 2A)。qPCR检测结果显示，ACT CAR‑M组细胞的增殖因子CCND1和 Ki67的mRNA表达水平均显著强于CAR‑Like组，且p53表达水平低于 CAR‑like组，见图2B‑D。研究结果提示，ACT CAR‑M的基础活性显著 增强，这意味着α1β1整合素和FcγRⅠ在胞内转导的信号增强了ACT CAR‑M的增殖活性。
[0081] 3、ACT CAR‑M的体外吞噬活性检测
[0082] 将上述构建的ACT CAR‑M，分别基于1:1的效靶比，以HER2+‑SKOV3 和HER2+‑4T1肿瘤细胞为模型，使用ACT CAR‑M吞噬肿瘤细胞，具体操 作为：
[0083] 于6孔板中分别接种4×105个UTD‑M、Empty、CAR‑like、ACT CAR‑M、 HER2阳性肿瘤靶细胞，以10％FBS的DMEM高糖培养基于37℃、5％CO2培养箱中静置培养，待细胞长至汇合度为70‑80％时，向巨噬细胞组中加入 工作浓度4μM的DiO染料，向HER2阳性肿瘤靶细胞组中加入工作浓度 4μM DiI染料，孵育4‑6h；吸去上清，于荧光显微镜下拍照。
[0084] 结果如图3A和3B所示，相对于CAR‑like组，ACT CAR‑M组的吞噬 肿瘤细胞能力得到了显著提升，这意味着α1β1整合素和FcγRⅠ在胞内转导 的信号增强了ACT CAR‑M的吞噬能力，提示ACT CAR‑M活性增强，为 后期各项研究奠定理论基础。
[0085] 4、anti‑HER2 ACT CAR‑M作用于肿瘤细胞her2靶点的抗肿瘤机制分 析[0086] 利用上述的“2、ACT CAR‑M的活性检测”中CCK细胞增殖试验培养 不同组巨噬细胞后，采用HER2信号通路下游相关分子(AKT、PI3K)， 同时检测肿瘤相关活性分子p53、Caspase‑3、CCND‑1、Ki67，进一步佐证 了ACT CAR‑M对肿瘤的杀伤。具体步骤包括：
[0087] (1)于6孔板中每孔加入4×105个的HER2阳性肿瘤靶细胞，置于37℃、 5％CO2的培养箱中静置培养；
[0088] (2)待HER2阳性肿瘤靶细胞贴壁后，吸去孔板中的培养基，用PBS 清洗细胞2‑3次，分别向6孔板中分别加入不同密度的J774A.1(UTD‑M)、Empty‑pCDH J774A.1(Empty)、HER2 scFv J774A.1(CAR‑like)、HER2 scFv CAR J774A.1(ACT CAR‑M)，设置效靶比分别为0:1、0.25:1、0.5:1、0.75:1、 1:1，同时在没有靶细胞的96孔板中加入等量的UTD‑M、Empty、CAR‑like、 ACT CAR‑M细胞作为效应细胞对照，设置全部裂解的未加效应细胞的等 量HER2阳性肿瘤靶细胞孔作为靶细胞阳性对照组，每组实验设置3个平 行孔；
[0089] (3)细胞共培养24‑48h之后，吸去6孔板中的培养基，用PBS清洗 细胞2‑3次，再向6孔板中每孔加入1mL的trizol，提取RNA，利用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒，并按照试剂盒说明书进行实验。
[0090] (4)正常溶解2×SuperReal Premix Plus、50×ROX Reference Dye、模 板、引物和RNase‑free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀；
[0091] (5)在冰上将反转得到的cDNA模板以一定体系与正向引物、反向 引物、Mix、ROX、ddH2O混合，利用移液枪将混合液添加入八连管中， 20μL体系包括：10μL 2×SuperReal Premix Plus、0.6μL正向引物(10μM)、 0.6μL反向引物(10μM)、0.1‑2μL cDNA模板、0.4μL50×ROX Reference Dye， 使用RNase‑free ddH2O补充至总体积20μL；
[0092] (6)盖上管盖，吹打混匀，用微量离心机离心5‑10s，确保所有组分 均在管底；
[0093] (7)将反应体系放置于RT‑qPCR仪ABI 7300中，设置仪器参数，95℃ 预变性15min、95℃变性10s、60±1℃退火20s，72℃延伸31s，40个循环， 运行程序，待程序结束后导出CtΔΔCt
值，并利用2‑ (Livak)法计算最终结 果。
值，并利用2‑ (Livak)法计算最终结 果。
[0094] 结果如图4和图5所示，与CAR‑like组相比，ACT CAR‑M组AKT、 PI3K表达发生了显著下调，说明ACT CAR‑M阻断了HER2信号的传导， 从而诱导p53和Caspase‑3的表达均发生了显著上调，最终导致了对肿瘤 的杀伤抑制，其体现在Ki67和CCND‑1的表达均发生了显著+ +下调，提示 ACT CAR‑M细胞阻断了HER2肿瘤细胞HER2信号通路的传导，抑制 HER2 肿瘤细胞周期进展，导致肿瘤凋亡事件的发生。这为ACT CAR‑M 的体外肿瘤杀伤效应研究奠定基础，也为后期肿瘤调控的活力增强型 CAR‑M的设计提供可靠理论支撑。
[0095] 6、anti‑HER2 ACT CAR‑M对多种肿瘤细胞系的体外杀伤检测
[0096] 本研究前期利用CCK‑8技术(同上述“2、ACT CAR‑M的活性检测中 CCK细胞增殖试验”)在细胞水平对anti‑HER2 ACT CAR‑M的体外杀伤能 力进行检测，使用HER2+‑4T1细胞+和HER2‑SKOV3细胞，明确anti‑HER2 ACT CAR‑M对HER2靶点杀伤的有效性，确定其有效的效靶比。
[0097] 如图6所示，相对于CAR‑like组，ACT CAR‑M组对HER2+的肿瘤细 胞有显著杀伤作用，说明ACT CAR‑M抑瘤效果优于CAR‑like，提示α1β1 整合素和FcγRⅠ在胞内转导的信号增强了ACT CAR‑M的杀伤肿瘤能力。
[0098] 7、ACT CAR‑M体内治疗肿瘤效果验证
[0099] 本研究前期初探ACT CAR‑M在体内靶向肿瘤能力的验证，使用小鼠 HER2+‑4T1肿+瘤模型验证ACT CAR‑M的抗肿瘤效果，HER2‑4T1肿瘤模 型的建立包括如下步骤：
[0100] (1)小鼠乳腺癌细胞系HER2+‑4T1利用1640培养基(hyclone)于 37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
[0101] (2)4‑6周龄的磁性BALB/c小白鼠购买后需于恒温无菌通风小鼠饲 养间饲养一周以上后再进行小鼠实验；
[0102] (3)将HER2+‑4T1细胞扩大培养，待小鼠饲养约一周后，消化 HER2+‑4T1细胞，用PBS7
清洗2‑3次，并利用PBS重悬，稀释密度为10个细胞/mL，将100μL细胞重悬液以皮下注射的方式注射到小鼠右肢上方 皮下；
清洗2‑3次，并利用PBS重悬，稀释密度为10个细胞/mL，将100μL细胞重悬液以皮下注射的方式注射到小鼠右肢上方 皮下；
[0103] (4)将UTD‑M、Empty、CAR‑like和ACT CAR‑M细胞均利用DMEM 高糖培养基于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
[0104] (5)待HER2+‑4T1细胞成瘤后，每组设置4只小鼠的平行实验，分 别将100μL PBS或细胞重悬液通过尾静脉方式进行注射，UTD‑M、Empty、 CAR‑like和ACT CAR‑M组分别注射36 6
×10个细胞，在注射第一次后的第 5d，进行第二次注射，每组注射量为3×10 个细胞，总共注射了两次。
×10个细胞，在注射第一次后的第 5d，进行第二次注射，每组注射量为3×10 个细胞，总共注射了两次。
[0105] (6)用电子游标卡尺对小鼠肿瘤的长和宽分别进行测量，利用电子天 平对小鼠体重进行测量，小鼠肿瘤体积＝(长*宽2)/2，每两天测量一次， 最后计算小鼠生存曲线。
[0106] 结果见图7，相对于CAR‑like组，ACT CAR‑M组肿瘤得到了明显抑 制，生存期延长，取得了显著的治疗效果。另外，相对于CAR‑like组， ACT CAR‑M组体重无明显变化，提示其具有较好安全性。
[0107] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明 的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人 员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求 书确定的保护范围内。